四碘甲状腺素的检测试剂盒及其使用方法

专利名称：四碘甲状腺素的检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及四碘甲状腺素的检测试剂盒，具体涉及基于光激化学发光原理的四碘 甲状腺素的检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
甲状腺疾病是一组较常见的内分泌疾病，包括缺碘性甲状腺肿、其他原因引起的 甲状腺肿、甲亢、甲状腺瘤、甲状腺炎、甲状腺功能减退等。甲状腺病的发生率比较高。甲亢也就是甲状腺功能亢进症，它是一种临床上十分常见的内分泌疾病。是指由 各种原因导致甲状腺功能增强，甲状腺激素分泌过多或因甲腺原氨酸(T4、T4)在血液中水 平增高所导致的机体神经系统、循环系统、消化系统心血管系统等多系统的一系列高代谢 症候群以及高兴奋症状和眼部症状。甲状腺机能减退症系甲状腺激素TSH合成与分泌不足，或甲状腺激素生理效应不 好、生物效应不足而致的全身性疾病。临床上可分为呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能 减退始于胎儿或新生儿期，称为克汀病；始于性发育前儿童称幼年型甲减；始于成人称成 年型甲减。甲状腺瘤是临床常见病，其中绝大多数为良性病变，少数为癌，肉瘤，恶性淋巴瘤 等。该病女性发病率明显高于男性，男女发病比例约1 2 3。甲状腺炎是以炎症为主要表现的甲状腺疾病，包括感染性和非感染性。不少见。临 床权威上所说的急性、亚急性及已经慢性甲状腺炎，只表明青年疾病过程的长短，它们之间 无内在联系，也不互相转变，每种具有发表不同的病因有着临床特点、病理过程及固有的结局。四碘甲状腺素(3，5，3',5' -tetraiodo-L-thyronine，缩写 T4)，是从甲状腺滤 泡上皮分泌产生的激素，释放入血后，T4绝大部分都与TBG(甲状腺结合球蛋白)结合，通 过与细胞核内特异受体蛋白结合，诱导该蛋白产生活性构象，使其DNA结合部位与DNA的特 定部位有效结合，从而激活DNA的转写过程，达到调节基因表达的生物功能，其中约0. 03% 的总血清T4呈游离状态，与结合激素动态平衡，维持正常的生理功能。大量生物学和生理 学的实验结果证明，甲状腺激素对细胞的正常发育和分化、动物的体温调节和各种糖、脂肪 和蛋白质代谢平衡的维持起重要的调节和控制作用。因此，检测血清T4对于甲状腺功能亢 进、甲状腺功能减低及甲状腺肿瘤的诊断或鉴别诊断，对甲状腺功能相关疾病的发展过程、 疗效及预后评估中具有十分重要的意义。血清中T4浓度高于正常值，可能是(1)甲状腺机能亢进；(2)药物影响如服用 甲状腺素、雌激素类药物及避孕药、奋乃静等；(3)其它疾病如先天性遗传性甲状腺结合 球蛋白增高症、急性传染性肝炎、间歇性血卟啉病等；(4)生理因素如妊娠。血清中T4浓度低于正常值，可能是(1)甲状腺疾病原发性甲状腺功能下症、慢 性淋巴性甲状腺炎；(2)药物影响抗甲状腺药物；(3)其它疾病严重肝肾功能衰竭、肾病 综合症、活动性肢端肥大症、遗传性甲状腺素结合球蛋白减少症等。
免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利 用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质， 激素等微量生物活性物质。我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代，现仍普遍使 用于县级以上医院)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用)；以化 学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用，产品步入成 长期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性 的需求的不断提高而决定的。化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内 发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助 其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分 析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直 接标记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗 时长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott， Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免 疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP，金钢 脘为基质采用酶促化学发光。Roche为则采用电化学发光(electrochemiluminescence， ECL)，发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧 化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即 释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光 子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当昂 贵。此外，发光基质的稳定性也是一大问题。光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因 反应在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背 景值，减少反应时间，并可实现自动化操作。

发明内容
本发明的目的是提供一种可用于定量检测血清中四碘甲状腺素的检测试剂盒及 其使用方法。本发明的技术原理本发明的四碘甲状腺素检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关，光激化 学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术主要整 合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。本发明之所以能检测血清中的四碘甲状腺素的水平，首先使用解离剂将样品中与 甲状腺素结合球蛋白(thyroxine-binding globulin, TBG)结合的四碘甲状腺素(T4)解 离。然后在均相条件下，将内部带有染料的感光微粒(纳米级)以及包被有三碘甲腺原氨 酸(T3)并且内部带有发光化合物的发光微粒(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混
合o
T3又名三碘甲腺原氨酸，是一种从甲状腺分泌出来的激素，是一组含碘的酪氨酸， 以碘和酪氨酸为原料在甲状腺腺细胞内合成。T3分泌量较少，但其活性大，是T4的5倍。 T3在甲状腺外，可以由甲状腺素的脱碘化形成，两者在结构上极为相似。血液中的T3绝大 部分与TBG结合，约0. 4%的游离T3作用于靶细胞，维持正常的生理功能。约20%循环中 T3由甲状腺产生，其余80%主要来自肝脏，由T4的外环脱碘(5' D-I)转换产生。T3分子式为C15H12I3N04，结构如下所示 T4分子式为C15|||||4N04,结构如下所示 由于T4和T3分子结构十分相似，因此T3可和针对T4的抗体发生微弱的结合。当 血清中存在T4时，这一脆弱的结合即被破坏，被T4和T4抗体的结合取代。此时纳米感光微粒和包被有表面抗体的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉四碘甲 状腺素(T4)，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微粒中的染 料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离 的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后，发光 微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电 脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样 本不含四碘甲状腺素(T4)时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递 至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级红光产生。具体原理 参见图1及图2。据文献记载，8-苯胺基-1-萘磺酸铵(8-Anilino-l-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，简称ANS)能够通过与蛋白疏水区域之间的强有力的结合作用，从 而使蛋白构象变化，解离蛋白之间的相互作用。(Yoshimura，T.，Monitoring protein conformational changes during membrane fusion. Method Enzymol. ,221,72-82)基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测四碘甲状腺素(T4)的检测 试剂盒，包括四碘甲状腺素检测微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体和解离剂；其中 四碘甲状腺素检测微粒为三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒，解离剂为8-苯胺基-1-萘磺酸铵、柳硫汞、水杨酸钠或者三氯醋酸钠。试剂盒中，还可包括亲和素包被的感光微粒。 在试剂盒中，上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒、生物素标记的抗四碘 甲状腺素抗体(T4Ab)、解离剂和亲和素包被的感光微粒分别独立包装，且三碘甲腺原氨酸 (T3)包被的发光微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab)和亲和素包被的感光微 粒均为混悬液。上述含有三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒、生物素标记的抗四碘甲状 腺素抗体(T4Ab)或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应 的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系。三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒的 溶剂优选PH8. 0的成分为HEPES、NaCUEDTA和BSA的HEPES缓冲液，生物素标记的抗四碘 甲状腺素抗体(T4Ab)的溶剂优选pH8. 0的成分为Tris、NaCl和EDTA_Na-2H20的Tris缓 冲液，亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES缓冲液，上 述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试 剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选 100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。在用于定量检测四碘甲状腺素(T4)时，上述试剂盒中还可包括含有多种已知四 碘甲状腺素浓度的溶液。上述不同四碘甲状腺素浓度的溶液分别独立包装。上述解离剂选自8-苯胺基-1-萘磺酸铵、柳硫汞、水杨酸钠或者三氯醋酸钠，优选 为8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS)。解离剂的缓冲液可以为Tris缓冲液、PBS缓冲液或者双 蒸水，较佳为双蒸水。上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合 物可以是Dioxene (二氧杂环己烯)或thioxene (二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合 物可以是Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Phen等，该微粒可由市场上购得。研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径(微粒的平均直径) 太大(>400nm)会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小(< lOOnm)，会使制备过程中 的清洗工作比较困难，对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在100-400nm之 间，较好为150-300nm之间，优选250nm。发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基 和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不 相同。鉴于获得更好的三碘甲腺原氨酸(T3)的连接效率，试剂稳定性和连接重复性，经 试验优选醛基表面官能团的微粒，并应用了 NaBH3CN的还原胺化反应作为抗体的连接方法。发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光 量一般会在150，000-350, 000光子数/100 μ g发光微粒范围内，优选中等强度偏上的水平 (彡250，000光子数/IOOug)发光微粒。上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒中，发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3) 的质量比例较佳为10 (0.01-0. 05)，优选10 0.02。上述生物素标记的抗体(T4Ab)中，生物素与抗体的分子比例较佳为(10-50) 1， 优选30 1。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激发下，可以 产生单线态氧离子，当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生 520-620nm波长光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。
上述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例无特殊限制，较佳 为 1 (3-10)，优选 1 5。市售感光微粒均适用于本发明，微粒粒径较佳为180-260nm，优选220nm。三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒采用NaBH3CN的还原胺化反应法制备，反应 步骤如下1)混合将发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3)按质量比例为10 (0. 1-0. 5)混合 于缓冲液中；2)反应加入缓冲液配制的NaBH3CN溶液混合并反应；3)封闭加入缓冲液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反应后，再加入BSA溶液封 闭；4)清洗产物，获得三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒。其中，混合步骤中，发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3)的质量比例为 10 (0.1-0. 4)，优选10 0.2。反应缓冲液可为MES缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲 液，浓度优选0. 05M,反应步骤中，反应溶液中发光微粒的浓度可为10-40mg/ml，优选20mg/ ml ο改进的，三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒可采用下述方法制得1)混合将发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3)混合于缓冲液中。较佳的，缓冲液 为MES缓冲液，发光微粒与三碘甲腺原氨酸(T3)的质量比例为10 (0.01-0. 05)，优选
10 0.02ο2)反应加入缓冲液配制的EDACd-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐 酸盐)溶液混合并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，混合溶液中，发光微粒与EDAC的质 量比优选为25 1混合。反应条件为37°C旋转反应。一般约48小时反应充分。3)往步骤2获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混勻并反应。较佳的，缓冲 液为MES缓冲液。BSA溶液与步骤2获得的反应液体积比较佳为5 8。反应条件为37°C 旋转反应。一般约16小时反应充分。4)清洗产物，获得三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒。清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步骤采用反应缓冲液透析，每次4-5小时，更换缓冲液4次。透析清 洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此 反复3-5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很 容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。上述改进的制备方法与NaBH3CN的还原胺化反应法的主要差别在于主要反应试剂 NaBH3CN替换成了 EDAC，该试剂的替换，不仅使得反应时间与NaBH3CN的还原胺化反应法相 比缩短了 10个多小时，而且发光微粒与二碘甲腺氨酸的交联效率获得了提高，节省了二碘 甲腺氨酸用量，此外，试验表明，该方法制得的检测微粒与NaBH3CN的还原胺化反应法制得 的检测微粒相比，在相同条件下反应信号更强，灵敏度更高，检测范围也更广。
亲和素包被的感光微粒可采用NaBH3CN的还原胺化反应法制备。本发明第二方面，公开了上述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，四碘甲状 腺素的检测试剂盒利用光激化学发光原理，采用双抗体夹心法，可定量检测血清中的四碘 甲状腺素。 四碘甲状腺素(T4)的检测试剂盒的使用方法包括下列步骤首先使用解离剂对样品进行预处理，然后将样品与试剂盒中用于检测四碘甲状腺 素的检测微粒、生物素标记的游离抗四碘甲状腺素抗体(T4Ab)和亲和素包被的感光微粒 混合反应，而后用激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。具体包括下列步骤1)在反应孔中加入样品，再依次加入T3包被的发光微粒、解离剂和生物素标记的 抗T4抗体(T4Ab)，获得初始反应溶液，混合反应；2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。上述激发光光源波长范围为600-700nm，优选640-680nm ；反应孔发光的发射光光 源波长范围为600-680nm，优选610_620nm ；发射光延迟时间范围为lOOms-lOOOms ；激发光 光源的功率范围为5-lOOmw，优选40-60w。上述四碘甲状腺素(T4)的检测试剂盒在应用在定量检测四碘甲状腺素(T4)时， 需根据标准曲线计算待测样品中T4含量。上述步骤1)的反应条件为37°C温育10-30分钟，优选20分钟，步骤2)的反应条 件也为37°C温育10-30分钟，优选15分钟。上述初始反应溶液中，三碘甲腺原氨酸(T3)包被的发光微粒的浓度无特殊限制， 可以为 50-200 μ g/ml，优选 150 μ g/ml。上述解离剂的工作浓度可以为0. 5mg/ml-l. 5mg/ml，较佳为lmg/ml。初始反应溶液中，生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体的浓度无特殊限制，可以为 0. 5-1. 5 μ g/ml,较佳为 1 μ g/ml。在最终反应溶液中，亲和素包被的感光微粒的浓度一般控制在10-100 μ g/ml，可 以为 30-60 μ g/ml，优选 40 μ g/ml。上述方法中，初始反应溶液的体积无特殊限制，可以为60-100 μ 1，优选ΙΟΟμ 1 ； 最终反应溶液的体积也无特殊限制，可以为120-275 μ 1，优选275 μ 1。上述样品包括血清、血浆、全血或标准品。当本发明的检测试剂盒用于定量检测四碘甲状腺素(Τ4)时，还需根据标准曲线 计算待测样品中四碘甲状腺素的含量本发明是采用光激化学发光检测技术，配合光激化学发光分析系统测定人血清样 品中四碘甲状腺素(Τ4)的定量体外诊断试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于甲 状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。本发明的四碘甲状腺素(Τ4)光激化学 发光检测试剂盒灵敏度高、精密性好、检测范围宽、而且操作简便、快速、成本低、稳定性好、 无环境污染和放射危害，在临床上具有广泛的应用前景。



图1 光激化学发光免疫技术原理图微粒结合形成二聚体，产生光子信号。图2 光激化学发光免疫技术原理图未结合微粒，无光子信号产生。图3 单线态氧随微粒间距离衰减，在大概600nm的距离，基本没有单线氧的存在， 因此也不发光FG BEAD 发光微粒，内含发光分子；GG BEAD 感光微粒，内含感光分子；Singlet Oxygen 单线态氧,活性氧离子；A/B 两者可直接或间接特异结合的活性分子。如在双抗夹心检测中，A，B为针对 靶分子C不同的表位的单克隆抗体。图4 比较试验测试结果示意图。
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而 非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均 为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆试验手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实验中仪器原料来源及试剂配方原料及试剂厂家Biotin-X-X-NHSSigma TLC ^ 95%BSAEquitech/protease freeT3BiochemikaGlySigma ^ 95%HEPES经科宏达Tris国药NaBH3CNAcrosANSSigma抗-T4单克隆抗体Biospecfic感光微粒美国PentaTek公司发光微粒美国PentaTek公司8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS) Sigma仪器型号 厂家光激化学发光分析仪HT 上海博阳医疗仪器公司紫外分光光度计 752P 上海光谱公司高速冷冻离心机 CR21GHITACHI分析天平ALC-2100. 2 ACCULAB分析天平AG285METTLERPH 计DELTA320METTLER粒径仪Model 370 Nicomp
酶标仪MultiSKAN MK3 labsystem超声波清洗器 KQ5200E昆山超声仪器公司漩涡混合器 QL-901其林贝尔 磁力搅拌器(79-1)2003-03国华实施例1 T3包被的发光微粒的制备抗体与发光微粒制备方法1)发光微粒混悬液处理吸取一定量的羧基发光微粒于高速冷冻离心机中离心， 弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节发光微 粒浓度至100mg/ml。2)抗体处理T3于0. 05Μ pH6. 0的MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)透析，透 析完成后测定浓度，并调节浓度至2mg/ml。3) MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(MES缓冲液)和2mg/ml的T3 (MES缓 冲液)以1 10 1的体积比进行混合，迅速混勻，得到反应液。4)用MES缓冲液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照与发光微粒100mg/100uL EDAC 的比加入，迅速混勻，37°C旋转反应48小时。5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5 8，迅速混 匀，37。C旋转反应16小时。6)用MES缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固 含量，调节浓度至10mg/ml。将上述方法与采用NaBH3CN的还原胺化反应法制得的检测微粒进行比较。NaBH3CN还原胺化反应法的制备方法1)发光微粒处理吸取一定量的发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清， 加入一定量PH6. 00. 05M MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)，超声至微粒重新悬浮。2)混合T3用0. 2Ν NaOH配制成lmg/ml的溶液。按照IOmg发光微粒0. 2mg T3 加入T3溶液，补加MES缓冲液至发光微粒固含量为25mg/ml，振荡混勻得到反应液。3)反应用MES缓冲液配制25mg/mL的NaBH3CN溶液，按照与反应液3 250的 体积比加入，混勻。37°C旋转反应68-70小时。4)封闭用MES缓冲液配制75mg/mL的Gly溶液以及25mg/mL的NaBH3CN溶液，按 照与反应液2 1 10的体积比加入上述溶液中，混勻，37°C旋转反应2小时。5)清洗向反应好的发光抗体中加入0. IM Na2CO3溶液，高速冷冻离心机离心，弃 上清，加入新鲜0. IM Na2CO3，重新悬浮，再次离心，如此清洗4次，最后用少量发光试剂缓冲 液进行悬浮。6)取样测定清洗好的发光抗体的固含量、粒径，用发光试剂缓冲液调节发光抗体 浓度lOmg/mL准备进行稀释。两者制备结果的比较1.节省了制备时间 2.提高了抗体交联效率，节省了抗体用量 3.增强了反应信号 4.提高了灵敏度 5.扩大了检测范围 参照上述的制备方法制备T3包被的发光微粒，并通过各项性能测试比较从以下 几方面进行了具体工艺条件的选择研究本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下1.光信号检测方法
在反应孔中分别加入25 μ 1样品，再依次加入25 μ 1发光试剂(150 μ g/ml)、25ul 解离剂ANS (lmg/ml)、25 μ 1生物素化抗体试剂(1 μ g/ml)。然后放入仪器(光激化学发光 分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作振动，37°C温育20分钟，再自动加入175 μ 1亲和 素包被的感光微粒试剂(40 μ g/ml)后37°C温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算 每孔发光光子量。2.精密性检测方法 分别采用2个批号的T4试剂盒对质控品QC L、QC H进行1次检测，每次复测10 孔，每份样品共检测20次。得到如下结果 由上述结果可知，本产品其批内精密性小于5%，批间精密性小于10%。3.灵敏度检测方法检测10孔校准品0 μ g/dl，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以 AVE-2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，经检测两个批号的试 齐U，其分析灵敏度分别为0. 46ug/dL、0. 50ug/dL，均不高于1 μ g/dl。4.工艺条件选择1)防腐剂的考察出于对试剂防腐以及长期储存的考虑，我们选择万分之五Proclin 300作为防腐 剂进行考察。检测未添加防腐剂及添加万分之五Proclin 300作为防腐剂的T4测定值< 2 μ g/ dL的血清、正常人血清、T4测定值彡25 μ g/dL的血清、BSA 0. OlM PBS。每种条件检测 两孔，取RLU检测均值。结果见下表 根据以上结果可以发现以万分之五Proclin 300作为防腐剂对试验结果没有明 显影响，故选用万分之五Proclin 300作为防腐剂。2)校准品稀释液的选择为了得到长期稳定且较易获取的校准品稀释液来取代不含T4的血清，使用20份T4测定值< 2 μ g/dL的临床血清作为参照来考察备选校准品稀释液，备选校准品稀释液分 别有生理盐水、双蒸水、添加BSA的0. OlM pH 7. 4PBS、去激素牛血清，20份阴性血清每 份测单孔，计算该20孔的RLU检测均值；备选校准品稀释液每种检测两孔，取RLU检测均 值。检测结果如下 根据以上结果可以发现BSA 0. OlM PBS的光信号水平与临床T4参照血清相 当，所以我们选用1%BSA 0.01M PBS作为校准品稀释液。3)发光微粒与T3的反应比例发光微粒T3分别按 10mg/0. 01mgU0mg/0. 02mgU0mg/0. 05mg 的比例包被，比较
选取最佳的包被反应比例。检测三种不同反应比例制备好的T3包被发光微粒，其灵敏度、精密性、线性。检测 结果如下表发光微粒与T3反应比例的比较 根据以上实验结果可知，抗原加入量与发光微粒上包被的抗原量基本呈正比关 系，但T3抗原继续增加时包被上的抗原达到饱和。综合考虑QC结果及成本问题，选择IOmg 发光微粒与0. 02mg T3的反应比例可得到较好的线性及灵敏度。4)发光试剂缓冲液将T3包被的发光微粒用HEPES缓冲液、PBS缓冲液分别配成150 μ g/ml的浓度，比较选取最佳缓冲液。
HEPES 缓冲液pH8. 0,0. 05M HEPES+0. 3M NaCl+25mM EDTA+1. 6% BSA+ 表面活性 剂+防腐剂；PBS缓冲液pH7. 4，0. 02M PBS+1 % BSA+表面活性剂+防腐剂；以两种缓冲液配制的T3包被的发光微粒，检测其灵敏度、37°C破坏7天稳定性、线 性。检测结果如下表T3包被的发光微粒缓冲液比较 根据以上实验结果可知，把以两种缓冲液配制的T3包被的发光微粒37°C破坏7d 后，整体RLU都有一定程度的下降，线性无明显变化，但HEPES缓冲液比PBS缓冲液灵敏度 下降的程度更小一些，因此选择HEPES作为试剂1的缓冲液。5)防腐剂的选择出于对试剂防腐以及长期储存的考虑，我们选择万分之五Proclin 300作为防腐 剂进行考察。检测未添加防腐剂及添加万分之五Proclin 300作为防腐剂的T4测定值< 2 μ g/ dL的血清、正常人血清、T4测定值彡25 μ g/dL的血清、BSA 0. OlM PBS。每种条件检测 两孔，取RLU检测均值。结果见下表 根据以上结果可以发现以万分之五Proclin 300作为防腐剂对试验结果没有明显影响，故选用万分之五Proclin 300作为防腐剂。6)清洗方式的选择
透析法清洗步骤100倍体积透析，每次4-5小时，更换缓冲液2次。透析清洗操 作时间较长，且清洗不彻底。离心法清洗步骤12000rpm离心30分钟，清洗3次，沉淀以超声法重悬。这种方 法清洗所用时间较短，效果好。综合考虑选用离心法清洗。最终选择250nm的粒径，发光量为≥250，000光子数/IOOug的发光微粒，BSA 的0. OlM pH 7. 4PBS作为稀释液，万分之五Proclin 300作为防腐剂，20mg/ml的发光微粒 反应浓度，10 0. 02的re-bead与T3的比例，离心法清洗作为最优制备条件。实施例2生物素标记抗体的制备制备方法1)抗体处理将抗-T4单克隆抗体(标记)透析于0. IM NaHC03溶液中，测定抗 体浓度并调节至lmg/mL ；2)用 DMSO 配制 16. 17mg/mL 的 Biotin 溶液；3)标记取处理好的lmg/mL抗-T4单克隆抗体(标记)与配制好的Biotin溶液， 二者按照10000 54的体积比进行混合，迅速混勻；2 8°C静置反应12 16小时；4)透析将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液；5)将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度，用生 物素标记透析缓冲液调节生物素标记抗体浓度至0. 5mg/mL。本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下1、将抗体与Biotin按照不同比例进行反应并进行检测将Biotin-X-X-NHS 抗体按照20 1、30 1、40 1的不同比例进行标记，比较 选取最佳的标记比例。检测三种不同标记比例制备好的生物素-抗T4，其灵敏度、精密性以及线性。检测 结果如下表抗体与生物素的标记比例比较
根据以上实验结果可知，生物素抗T4标记比例为30 1时，其灵敏度较好，成本 也较低。故选择30 1的比例作为生物素抗T4的标记比例。2、生物素标记抗体缓冲液的选取将生物素标记抗T4抗体用Tris缓冲液、PBS缓冲液分别配成1 μ g/ml的浓度，比 较选取最佳缓冲液。Tris 缓冲液pH 8. 0,0. IM Tris+0. 3M NaCl+25mM EDTA+0. BSA+表面活性剂 + 防腐剂；PBS缓冲液pH7. 4，0. 02M PBS+1 % BSA+表面活性剂+防腐剂；以两种缓冲液配制的生物素标记抗T4，检测其灵敏度、37°C破坏7天稳定性、线 性。检测结果如下表生物素标记抗T4缓冲液比较 根据以上实验结果可知，把以两种缓冲液配制的生物素标记抗T437°C破坏7天 后，整体RLU都有一定程度的下降，线性无明显变化，但Tris缓冲液比PBS缓冲液灵敏度下 降更小一些，因此选择Tris作为试剂2的缓冲液。3、生物素标记抗体溶液工作浓度的选取3. 1.生物素标记抗T4工作浓度选取将试剂2中的生物素标记抗T4用Tris缓冲液分别配成0. Syg/mlUyg/ml、 1. 5 μ g/ml的浓度，比较选取最佳工作浓度。以三种不同浓度的生物素标记抗T4的试剂2，检测其灵敏度、线性。检测结果如下 表生物素标记抗T4工作浓度的选取 根据以上实验结果可知，试剂2中生物素标记抗T4的工作浓度为1 μ g/ml时，其 灵敏度、线性更佳。实施例3亲和素包被的感光微粒的制备感光微粒采用粒径为220 士40nm的感光微粒(美国PentaTek公司)制备方法a、感光微粒混悬液处理吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去 上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调 节感光微粒浓度至100mg/ml。b、亲和素溶液配制称量一定量Avidin，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
c、混合将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以 2:5: 1的体积比进行混合，迅速混勻，得到反应液。 d、反应MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液1 25的体积比 加入，迅速混勻。37°C旋转反应48小时。e、封闭MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与 反应液2 1 10的体积比加入上述溶液中，混勻，37°C旋转反应2小时。再加入200mg/ ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5 8，迅速混勻，37°C旋转反应16小 时。f、清洗向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入 新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液 进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。实施例4解离剂ANS的制备解离剂使用8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS)溶于95%乙醇配制成10mg/mL浓缩液， 然后加入万分之五的Proclin-300防腐储存。本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下1、解离剂缓冲液的选取将8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS)用Tris缓冲液、PBS缓冲液、双蒸水分别配成 lmg/ml的浓度，比较选取最佳缓冲液。Tris 缓冲液:pH 8. 0,0. IM Tris+O. 3M NaCl+25mM EDTA+O. BSA+表面活性剂 + 防腐剂；PBS缓冲液pH7. 4，0. 02M PBS+1 % BSA+表面活性剂+防腐剂；以三种缓冲液配制的解离剂，检测其灵敏度、37°C破坏7天稳定性、线性。检测结 果如下表解离剂缓冲液比较 根据以上实验结果可知，把以三种缓冲液配制的解离剂37°C破坏7d后，整体RLU 都有一定程度的下降，线性无明显变化，但使用双蒸水比Tris缓冲液及PBS缓冲液灵敏度 下降更小一些，因此选择双蒸水作为解离剂的缓冲液。2、解离剂工作浓度的选取将解离剂中的ANS用双蒸水分别配成0. 5mg/ml、lmg/ml、l. 5mg/ml的浓度，比较选 取最佳工作浓度。使用三种不同浓度的ANS的解离剂，检测其灵敏度、线性。检测结果如下表解离剂工作浓度的选取 根据以上实验结果可知，解离剂中ANS工作浓度为lmg/ml时，其灵敏度、线性更佳。
3、解离剂加样模式的选取将ANS分别加入试剂1与试剂2配制成lmg/ml的工作浓度，与试剂1+解离剂+ 试剂2的加样模式进行比较。 模式1 试剂1+ANS+试剂2 ；模式2 =ANS加入试剂1中；模式3 =ANS加入试剂2中；以三种加样模式检测其灵敏度、37°C破坏7天稳定性、线性。检测结果如下表 根据上表可知，ANS无论是加入试剂1中，还是加入试剂2中，37°C破坏7天后反 应体系都会受极大影响，故选择模式1。实施例5标准品的制备标准品使用卫生部临检中心出品的四碘甲状腺素定量参考品，以PBS为稀释液， 按照浓度 Oug/dl, lug/dl，2. 4ug/dl，6. 5ug/dl，15ug/dl，32ug/dl 配制 6 个标准品。实施例6四碘甲状腺素定量检测然后向反应孔中分别加入样品，再依次加入发光试剂(T3包被的发光微粒)、解离 剂和生物素标记抗T4抗体。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下 步骤操作振动，37°C温育。再自动加入亲和素包被的感光微粒后37°C再次温育。温育结 束后仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。按上述方法检测各个定标品的发光光子量，将测得的光信号值与相应的标准品浓 度采用cubic spline拟和作图即得，标准曲线呈线性。根据标准曲线，按样本实测光信号 值计算每一个样本的T4含量，单位是yg/dL。最后打印试验报告。检测条件的优化试验1、温育时间的确定试验材料采用抗体包被的150 μ g/ml的T3包被发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和1 μ g/ml的生物素标记抗体试剂，lmg/ml的解离剂ANS，及40 μ g/ml的亲和素包 被的感光微粒试剂。检验样本灵敏度参考品和质控品QcL，QcH0 初始反应条件加样量为样品25 μ 1，发光微粒试剂25 μ 1，解离剂25 μ 1，生物素 标记抗体试剂25 μ 1，亲和素包被的感光微粒试剂为175 μ 1，两步温浴。1. 1第一步温育时间的确定第一步分别实验温育时间分别为10min、15min、20min、30min，第二步温育时间为 15min,比较选取最适温育时间。以四种不同温育时间检测其灵敏度、精密度、线性。检测结果如下表第一步温育时间的比较 根据以上实验结果可知，在其余条件相同的情况下，第一步温育时间为20min结 果已经趋于稳定，延长第一步温育时间已经没有实际意义，故将第一步温育时间确定为 20mino1. 2第二步温育时间的确定第一步温育时间为20min，第二步分别实验温育时间分别为lOmin、15min、20min、 30min,比较选取最适温育时间。以四种不同温育时间检测其灵敏度、精密度、线性。检测结果如下表第二步温育时间的比较 根据以上实验结果可知，在其余条件相同的情况下，第二步温育时间为15min结 果已经趋于稳定，延长第二步温育时间已经没有实际意义，故将第二步温育时间确定为 15min。2、加样模式的考察根据关于抗原_抗体反应时间的文献资料，并结合本方法的特点我们设计了两种 加样模式进行考察。模式1 :25ul样品+25ul发光抗体试剂+25ul解离剂+25ul生物素化抗体试剂 +175ul亲和素包被的感光微粒；模式2 :15ul样品+15ul发光抗体试剂+15ul解离剂+15ul生物素化抗体试剂 +60ul亲和素包被的感光微粒。按照以上两种加样模式，分别考察灵敏度、精密度、线性。结果见下表加样模式的比较 根据以上实验结果可知，模式1灵敏度、精密性皆好于模式2，故选择模式1。3、生物素化抗体浓度的筛选试验材料采用抗体包被的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和生物素标记 抗体试剂，及亲和素包被的感光微粒试剂检验样本灵敏度参考品和质控品QcL，QcH0初始反应条件依次添加25 μ 1样品、25 μ 1发光微粒试剂、25 μ 1解离剂ANS、 25 μ 1生物素标记抗体试剂、175 μ 1亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间 为20min，第二温浴时间为15min。将生物素标记抗T4抗体用Tris缓冲液分别配成0. 5 μ g/ml、1 μ g/ml、1. 5 μ g/ml 的浓度，比较选取最佳工作浓度。以三种不同浓度的生物素标记抗T4的试剂2，检测其灵敏度、线性。检测结果如下 表生物素标记抗T4工作浓度的选取 根据以上实验结果可知，试剂2中生物素标记抗T4的工作浓度为Iy g/ml时，其 灵敏度、线性更佳。4、亲和素包被的感光微粒的浓度的筛选发光抗体浓度选用150 μ g/ml，生物素化抗体的浓度选用1 μ g/ml，亲和素包被的 感光微粒浓度分别配制为30 μ g/ml，40 μ g/ml，60 μ g/ml，在初始反应条件下，结果如下 根据灵敏度比较，Qc L和Qc H的测定浓度，亲和素包被的感光微粒浓度在40 μ g/ ml时结果最为理想。实施例7评价试验试剂采用发光抗体试剂(150 μ g/ml)、生物素标记抗体试剂(lyg/ml)、亲和素 包被的感光微粒试剂(40 μ g/ml)及解离剂ANS(lmg/ml)。首先在反应孔中加入25 μ 1样品，再依次加入25 μ 1发光试剂、25 μ 1解离剂ANS 和25 μ 1生物素化抗体试剂。然后放入仪器，由仪器自动按以下步骤操作振动，37°C温育 20分钟，再自动加入亲和素包被的感光微粒试剂175μ 1后37°C温育15分钟。仪器自动 产生激光照射微孔计算每孔发光光子量，根据标准曲线可以推算样品T4浓度，单位是μ g/ dL，最后打印试验报告。检测具体步骤如下1、检测范围本试剂盒线性检测范围为1-32 μ g/dl，对其用双对数模型拟合，剂量-反应曲线 相关系数(r)的绝对值不低于0. 9900。如要准确的测定样品中T4浓度值，样品中T4浓度值应不超出l-32yg/dl校准品曲线的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过校准品曲线 外延得出的计算结果。经本试剂盒对大量的临床样本的检验结果可知道，大部分样本结果 小于32μ g/dl，因此，本试剂盒设定的检测范围为1-32μ g/dl完全可满足临床应用要求。2、灵敏度的检测 检测10孔校准品0 μ g/dl，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以 AVE-2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，经检测两个批号的试 齐U，其分析灵敏度分别为0. 46ug/dL、0. 50ug/dL，均不高于1 μ g/dl。3、精密性检测分别采用2个批号的T4试剂盒对质控品QC L、QC H进行1次检测，每次复测10 孔，每份样品共检测20次。得到如下结果 由上述结果可知，本产品其批内精密性小于5%，批间精密性小于10%。4、线性的检测对除0值外其他5点校准品用双对数或其他数学模型拟合，剂量_反应曲线相关 系数(r)的绝对值应不低于0.9900。经检测两个批号的试剂盒，其线性r值分别为1.000、 0. 999。5、干扰性试验在已知浓度的临床标本1#、2#、3#中加入250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、 10mg/dL胆红素，以本试剂盒进行检测，结果如下表表1 试剂盒批号=2OO7Ol2I (单位μ g/dl) 表2试剂盒批号20070123 (单位μ g/dl) 由上述结果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL胆红素对本产品无明显干扰，但 250mg/dL血红蛋白对本产品检测结果影响超过10%，因此尽量避免样本严重溶血。实施例8比较试验试剂采用解离剂ANS(lmg/ml)、发光抗体试剂(150 μ g/ml)、生物素标记抗体试 剂(ι μ g/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(40 μ g/ml)。以西门子公司T4试剂盒为参照进行了质量水平比较，所用样本为实施例5中的灵 敏度参考品，结果如图4所示。由图4所示的结果可知，本试剂盒检测结果与西门子结果相关性r = 0. 937，且该 试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，适合于向临床推广实施例9试剂盒的组配将实施例1-4中按照各种方法制备的的三种试剂以及解离剂ANS分别独立包装， 组配后获得基本试剂盒。可用于定量检测样品中T4的浓度。
权利要求
一种四碘甲状腺素的检测试剂盒，包括四碘甲状腺素检测微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体和解离剂；其中四碘甲状腺素检测微粒为三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒，解离剂为8-苯胺基-1-萘磺酸铵溶液、柳硫汞溶液、水杨酸钠溶液或者三氯醋酸钠溶液。
2.如权利要求1所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述四碘甲状腺素 检测微粒中，发光微粒的粒径范围为100-400nm。
3.如权利要求2所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述发光微粒的粒 径范围为I50-300nm。
4.如权利要求1所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述四碘甲状腺素 检测微粒中，发光微粒的表面官能团选自羧基或醛基。
5.如权利要求1所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述四碘甲状腺素 检测微粒中，发光微粒的发光量为150，000-350，000光子数/100 μ g发光微粒。
6.如权利要求1权利要求所述四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述四碘甲 状腺素检测微粒中，发光微粒与三碘甲腺原氨酸的质量比例为10 (0.01-0.05)。
7.如权利要求6所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述发光微粒与三 碘甲腺原氨酸的质量比例为10 0.02。
8.如权利要求1-7中任一权利要求所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于， 所述四碘甲状腺素检测微粒由如下方法制得1)混合将发光微粒与三碘甲腺原氨酸混合于缓冲液中；2)反应加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应；3)往步骤2)获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混勻并反应；4)清洗产物，获得三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒。
9.如权利要求8所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为MES缓 冲液或磷酸缓冲液。
10.如权利要求8所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述步骤a的混合 液中，发光微粒的浓度为10-40mg/ml。
11.如权利要求8所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述步骤d的清洗 的方式为离心法清洗。
12.如权利要求1所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的 抗四碘甲状腺素抗体中，生物素与抗四碘甲状腺素抗体的分子比例为(10-50) 1。
13.如权利要求12所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记 的抗四碘甲状腺素抗体中，生物素与抗四碘甲状腺素抗体的分子比例为30 1。
14.如权利要求1所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述解离剂为8-苯 胺基-1-萘磺酸铵的水溶液。
15.如权利要求14所述的的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述8-苯胺 基-1-萘磺酸铵的水溶液中，8-苯胺基-1-萘磺酸铵的质量体积浓度为0. 5-1. 5mg/ml。
16.如权利要求1-7或9-15中任一权利要求所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特 征在于，该试剂盒中还包括亲和素包被的感光微粒。
17.如权利要求16所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1 (3-10)。
18.如权利要求17所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被 的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1 5。
19.如权利要求16所述四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述四碘甲状腺素 检测微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体、解离剂和亲和素包被的感光微粒分别独立 包装，且三碘甲腺原氨酸包被的发光微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体和亲和素包 被的感光微粒均为混悬液。
20.如权利要求19所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液的溶 剂选自HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。
21.如权利要求20所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，四碘甲状腺素检 测微粒混悬液的溶剂为pH8. 0的成分为HEPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES缓冲液。
22.如权利要求20所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，生物素标记的抗 四碘甲状腺素抗体混悬液的溶剂为PH8. 0的成分为Tris、NaCl和EDTA_Na-2H20的Tris缓 冲液。
23.如权利要求20所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，亲和素包被的感 光微粒混悬液的溶剂为成分为HEPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES缓冲液。
24.如权利要求19所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液中还 包括蛋白保护剂、防止微粒聚集的稳定试剂或防腐剂中的一种或多种。
25.如权利要求24所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白保护剂 为BSA，防止微粒聚集的稳定试剂为Tween20，防腐剂为庆大霉素和Proclin 300。
26.如权利要求19所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还 包括多种浓度已知的四碘甲状腺素溶液，不同浓度的四碘甲状腺素溶液分别独立包装。
27.如权利要求1-26中任一权利要求所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，包 括下列步骤1)在反应孔中加入样品，再依次加入T3包被的发光微粒、解离剂和生物素标记的抗T4 抗体，获得初始反应溶液，混合反应；2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。
28.如权利要求27所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述 步骤3)的激发光光源波长范围为600-700nm。
29.如权利要求28所述的四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述 激发光光源的功率范围为5-lOOmw。
30.如权利要求29所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述激 发光光源波长范围为640-680nm，激发光光源的功率范围为40_60w。
31.如权利要求27所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步 骤2)和3)的反应条件为37°C温育10-30分钟。
32.如权利要求31所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步 骤2)的反应条件为37°C温育20分钟，步骤3)的反应条件为37°C温育15分钟。
33.如权利要求27所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，混悬液中，四碘甲状腺素检测微粒的浓度为50-200μ g/ml，生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体的 浓度为0. 5-1. 5 μ g/ml，亲和素包被的感光微粒的浓度为10-100 μ g/ml。
34.如权利要求33所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，混悬液 中，四碘甲状腺素检测微粒的浓度为150 μ g/ml，生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体的浓度 为1 μ g/ml，亲和素包被的感光微粒的浓度为40 μ g/ml。
35.如权利要求27所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，初始反 应溶液的体积为60-100 μ 1 ；最终反应溶液的体积为120-275 μ 1。
36.如权利要求35所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，初始反 应溶液的体积为100 μ 1，最终反应溶液的体积为275 μ 1。
37.如权利要求27所述四碘甲状腺素的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括 根据标准曲线计算待测样品中四碘甲状腺素的含量。
全文摘要
本发明涉及甲状腺疾病的辅助诊断试剂盒，公开了一种四碘甲状腺素的检测试剂盒，包括四碘甲状腺素检测微粒、生物素标记的抗四碘甲状腺素抗体和解离剂；其中三碘甲腺原氨酸检测微粒为二碘甲腺氨酸包被的发光微粒，解离剂为8-苯胺基-1-萘磺酸铵。本发明还公开了上述三碘甲腺原氨酸检测试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。
文档编号C09K11/02GK101865916SQ20091004930
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者王海蛟, 赵卫国, 陈晨辉 申请人:博阳生物科技(上海)有限公司