专利名称：甲状腺功能检测蛋白芯片及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，具体涉及一种用于甲状腺 功能检测蛋白芯片及其试剂盒。
背景技术：
甲状腺是人体最大的内分泌腺，能分泌甲状腺素(T4)，三碘甲状腺原氨酸(T3)等 激素。这些激素受由腺垂体分泌的促甲状腺素(TSH)的调节，对人体的蛋白质、脂肪、糖、 维生素，水和盐的代谢以及人体的生长发育起着十分重要的作用。甲状腺功能紊乱为内分 泌疾病中最常见者，并至今仍易被漏诊。据美国对11个城市4. 6万人的普查中发现，有约 11 %的人存在未被诊断出的各种甲状腺功能紊乱。甲状腺功能紊乱可分为甲状腺功能亢进 症(hyperthyroidism，简称甲亢)和甲状腺功能减退症(hypothyroidism，简称甲减)。抗促甲状腺激素(TSH)是由腺垂体嗜碱细胞中的S细胞分泌的调节甲状腺功能的 主要激素，半衰期60min。它是一种糖蛋白，分子量为观000。腺垂体TSH呈脉冲式释放，每 池 4h出现一次波动，日周期变化是清晨高而午后低。它能促进酪氨酸的碘化和碘化酪氨 酸的缩合，促进细胞内RNA和蛋白质包括甲状腺球蛋白的合成等。过量的甲状腺素是TSH 分泌最重要的生理抑制性因子，TSH浓度降低强烈提示甲状腺功能发生亢进。由于TSH检 测技术灵敏度的提高使其不仅可区分甲状腺功能减低，诊断甲状腺功能亢进，亚临床型甲 状腺功能减低或甲状腺功能亢进，甚至可以评价门诊和非甲状腺疾病住院病人甲状腺功能 状况。三碘甲状腺原氨酸CH)分子量为651，大约65%由甲状腺直接产生，35% T4在外 周组织脱碘形成。在外周血中，99. 6%与甲状腺结合球蛋白(TBG)结合。T3是已知目前生 物活性最强的甲状腺激素，其生物活性为T4的3倍 5倍，临床上一般将未与TBG结合的 T3称为游离T3，即游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)，只有游离的T3具有代谢活性，而未结合 的则没有。FT3可以通过细胞膜与受体结合发挥生理效应，因此它是甲状腺激素发生生理 效应的的真正活性部分，能较确切地反映甲状腺的功能状态及其他对人体机能的影响。在 多数甲状腺功能亢进病例中，血清T3和T4的升高相平行，而T3毒症时仅T3升高，T4在正 常范围。甲状腺功能亢进病人在进行放射性或药物治疗过程中，血清T4降至正常，而T3仍 高于正常，直至临床甲状腺功能恢复正常，血清T3才降至正常，故T3又可作为判断疗效的 可靠指标。在某些疾病，如肝硬变时，T3可能降低，但只要甲状腺功能正常，T4则在正常范 围。因此，作为评价甲状腺功能低下的指标，测定T3不如T4可靠。甲状腺素(T4)是由甲状腺滤泡上皮细胞合成和分泌的甲状腺激素，半衰期为7d, 其结构由一个酪氨酸残基和一个酚环组成，与T3的区别仅在于多一个碘原子。T4入血后约 99.6%与结合蛋白结合，结合T4与游离甲状腺素(FT4)之间呈可逆的平衡状态，只有游离 T4才能进入靶细胞与受体结合发挥其生理功能。甲状腺功能亢进，医源性或中毒性甲状腺 功能亢进T4与FT4都升高；亚急性甲状腺炎或慢性淋巴细胞性甲状腺炎T4、FT4 —过性升 高；各种原因所致TBG升高，如雌激素，肝炎等，也使T4升高但FT4不升高；精神病及一些非甲状腺疾病病人，极少数人会出现T4升高，但并无甲状腺功能亢进症状，原发病缓解后T4 恢复正常。甲状腺功能减低时，T4降低，且T4的降低先于T3的降低，甲状腺缺乏或先天性 发育不良及甲状腺全切后，血清TT4降低。各种原因所致的甲低病例中，FT4均显著低于正 常范围，但妊娠36周后，FT4呈正常生理性降低。酶联免疫吸附法(ELISA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是目前国内市场上检测甲状腺功能相关指标的主要手段。但由于 ELISA方法操作繁琐、耗时较长，且检测范围以及灵敏度不如CLIA，目前已逐步处于被淘汰 的阶段。虽然CLIA检测结果准确、灵敏度高，但由于国内目前技术不够成熟，主要还是应用 国外的电化学发光(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)等自动化免疫检测 仪，其操作体系封闭，必须配备昂贵的仪器以及专用的试剂盒，成本高且只能进行单指标检 测(一般医院对甲状腺功能进行检测时会同时对多项指标进行检测)，在国内不易推广。因此市场上需要一种成本更低、检测范围广，能够节省检测时间、提高检测效率的 甲状腺功能类检测产品。
发明内容
本发明要提供一种专门用于甲状腺功能检测的蛋白芯片及其试剂盒。解决目前市 场上甲状腺功能检测产品检测能力单一、检测成本高，并且没有集成化的缺点。本发明的技术方案如下提供一种甲状腺功能检测蛋白芯片，包括基板和位于基 板上的反应孔，所述的反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被有游离三碘甲状腺 原氨酸抗体、游甲状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体 中两种或两种以上抗体的微点阵。所述的反应孔由两类组成，一类反应孔包被有游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲 状腺素抗体，另一类反应孔包被有三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗 体。所述的两类反应孔按1 1的数量排列于基板上。所述的各类反应孔数量为4-30。所述的游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲 状腺素抗体、促甲状腺激素抗体在固相载体上各有2-8个点样点，在每一反应孔内还包被
有一定位基准点。所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。本发明还提供了一种甲状腺功能检测蛋白芯片试剂盒，它包括权利要求1所述的 甲状腺功能检测蛋白芯片。还包括酶标工作液和检测液、阴性对照、阳性对照品。所述的酶标工作液由HRP标记的抗体、抗原或抗原类似物组成，所述的检测液由 发光物和过氧化氢二种试剂组成。所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。本发明将目前医院最常检测的甲状腺功能项目集中于一张芯片上，可同时对同一 血清的5项指标进行检测。该发明可以大大节省时间和资源，提高检测效率、降低检测成 本。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 一种甲状腺功能检测蛋白芯片的制备其步骤主要是(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，在奇数列反应孔中用 FT3抗体和FT4抗体作为包被的抗体，在偶数列反应孔中用T3抗体、T4抗体和TSH抗体作 为包被的抗体；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维 素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。上述用于检测甲状腺功能的蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤1.甲状腺功能检测相关抗原抗体等的确定用于制备甲状腺功能检测蛋白芯片检测指标抗原的购买自Fitzgerald ；FT3、FT4 类似物购买自 Sigma-aldrich ；所采用的检测抗体买自Meridian life。2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点 阵形式为10X5矩形阵列，当点直径为0. Imm,点横向间距为0. 6mm，抗体阵列的大小为 6mmX5mm ；点样后贴膜，封闭；最后将芯片干燥、包装后于4°C保存。3.蛋白芯片组装用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。实施例2 试剂盒的制备一种甲状腺功能检测蛋白芯片试剂盒，由甲状腺功能检测蛋白芯片，标准品，质控 品，样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于 包装盒内，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法1.甲状腺功能检测蛋白芯片为6X8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见 ZL032298900。2.标准品提供12管，每管0. 2ml。用含有3% BSA和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)配 置，其中T3、I^FTSaF1M和TSH标准品的终浓度见下表CC ( pg/ml) 标准品 I标准品II标准品III标准品IV 标准品V 标准品VIT3 00.751. 53.0 6.0 10.0T4 02.05.010.0 15.0 25.0FT3 00.92.25.0 9.0 19.0FT4 02.08.040.0 80.0 120.0TSH 00. 52.05.0 10.0 25.0
3.质控品提供4瓶，每瓶0. 2ml。
质控品分为4个浓度，分别是质控品I、质控品II、质控品III、质控品IV。这四个 质控品为分别含有不同浓度的不同抗原混合液。
质控品是用含有3% BSA和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)配制，下表显示T3、T4、FT3、FT4和TSH质控品的终浓度及质控界限。cc (U /ml)质控品I 质控品II 质控品III 质控品IVT32. 484.41(±15%)(±15DT4
FT3(士 15%)(±15%)1.37 7.10(±15%) (±15%)FT43. 79 70. 60(±15%) (±15%)TSH1.4615.48(±15幻(±15%)上述质控品质控界限测定方法如下分别由2个实验人员按照标准实验操作检测质控品，重复4次/板，每天每人重复 测2块芯片，重复检测10天，分别计算质控品的均值和标准差，质控界限为X士 15%。4.样本稀释液由3% BSA和0.05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而 成。提供1瓶，9ml。用于稀释血清样本(体积比1 1)。5.酶标工作液由3% BSA和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)配成溶液， 酶标工作液I含有HRP标记的T3、T4抗原和TSH单克隆抗体；酶标工作液II含有HRP标记的FT3、FT4类似物，以上两种酶标工作液均含有检测抗体HRP-羊抗兔IgG。提供1. 5ml，各 1瓶。6.浓缩洗涤液(IOX)为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成磷酸二氢钾6. 8g，磷酸氢二钠7. lg， TWEEN-2010ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。提供50ml，1瓶。使用前用 450ml去离子水稀释，混勻。7.检测液使用 PIERCE 公司的SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate 作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。实施例3 蛋白芯片及试剂盒的应用及检测本发明所述的用于检测甲状腺功能的蛋白芯片的应用，主要采用竞争法和双抗夹 心法检测人血液中的相关指标。方法是将人血清加于芯片表面，再加入酶标工作液，直接进 行反应；加入检测液后1分钟，扫描并收集信号，样本点的信号强度与血清中抗原的浓度成 线性关系。在上述用于检测甲状腺功能的蛋白芯片试剂盒的应用中，其抗原抗体反应及检测 的具体使用方法如下(1)对喷点抗体、阳性对照、阴性对照的芯片用3% BSA溶液进行封闭，室温2小 时，封闭基片表面非特异性位点；(2)甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥；(3)在芯片的反应区域，加入人血清样品、标准品，质控品；每孔加IOOul ；(4)在基数列加入酶标工作液I，在偶数列加入酶标工作液II，50ul/每孔。置于 恒温反应仪中37°C，振荡反应1小时，使充分反应；(5)反应结束后，在反应仪上洗涤5次，洗液量设置为每孔350ul。(6)将 PIERCE 公司的 SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1 1混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列 加60ul，进行化学发光；(7)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。
权利要求
1.一种甲状腺功能检测蛋白芯片，包括基板和位于基板上的反应孔，其特征在于所 述的反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被有游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲 状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体中两种或两种以上 抗体的微点阵。
2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的反应孔由两类组成，一类反应孔包 被有游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体，另一类反应孔包被有三碘甲状腺原氨 酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体。
3.如权利要求2所述的反应板，其特征在于，所述的两类反应孔按1 1的数量排列于 基板上。
4.如权利要求3所述的反应板，其特征在于，所述的各类反应孔数量为4-30。
5.如权利要求1或2所述的反应板，其特征在于，所述的游离三碘甲状腺原氨酸抗体、 游甲状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体在固相载体上 各有2-8个点样点，在每一反应孔内还包被有一定位基准点。
6.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。
7.一种甲状腺功能检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的甲状 腺功能检测蛋白芯片。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标工作液和检测液、阴性对照、 阳性对照品。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的抗体、抗 原或抗原类似物组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其 衍生物。
全文摘要
本发明公开了一种甲状腺功能检测蛋白芯片及其试剂盒，该试剂盒包括甲状腺功能检测蛋白芯片，芯片上包被有游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)抗体、游离甲状腺素(FT4)抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体(T3)、甲状腺素(T4)抗体、促甲状腺激素(TSH)抗体。本发明可以定量检测出病人血清FT3、FT4、T3、T4、TSH的含量，用于辅助诊断甲状腺功能紊乱疾病。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，采用的化学发光法能提高检测的灵敏度，并能够同时检测出多项指标，大大节约了时间和成本。
文档编号G01N33/544GK102095869SQ20091020038
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者汪宁梅, 王通, 穆宇豪, 穆海东 申请人:上海裕隆生物科技有限公司