本发明涉及一种含有醛基结构的荧光素二乙酸酯荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
荧光素的荧光基团是最常见的共价标记蛋白的荧光衍生试剂。荧光素二乙酸酯(FDA)水解是被广泛接受的作为一个精确而简单测量总微生物活性的方法。这种方法具有简便,快速,灵敏的优点,并且荧光素二乙酸酯(FDA)水解广泛应用于作为衡量总微生物活性的指示。用于植物细胞染色、测定花粉的生活力和离体细胞活力检测等研究，因此细胞的荧光素染色标记应用广泛。荧光素二乙酸酯(FDA)是荧光素的二乙酸酯，亲脂性高于荧光素，易透过细胞膜被细胞所吸收。荧光素二乙酸酯(FDA)本身的荧光较弱，但进入细胞内的荧光素二乙酸酯(FDA)经脂酶水解成有荧光的荧光素，使细胞产生荧光，可用于研究细胞特性及细胞生长环境。荧光素二乙酸酯(FDA)可透过细胞膜并作为荧光素在活细胞内积累。由于荧光素较BCECF或钙黄绿素的亲水性低。
作为活细胞标记探针必须具备：(1)探针能特异性与细胞内特定底物结合；(2)探针标记产物信号强，可区分未标记细胞；(3)探针对目标细胞无损伤；(4)背景荧光干扰小，即荧光产物很少从细胞内渗漏出。荧光素二乙酸酯、氨基荧光素和异硫氰酸酯荧光素等曾用于标记活细胞，但荧光产物的渗漏问题未得到很好的解决。因此急需研发具有特异选择性的荧光素二乙酸酯。
技术实现要素：
本发明提供一种含有醛基结构的荧光素二乙酸酯荧光探针及其制备方法和作为对活细胞内水解酶活性指示的应用。该荧光探针既改善了其亲脂性又增强了特异选择性，减少进入细胞后水解荧光素的反渗透，同时具有较好的化学、光稳定性，较好的溶解性和生物兼容性。显微成像实验表明这类探针具有较好的细胞靶向性、通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
本发明采用的技术方案为：
一种含有醛基结构的荧光素二乙酸酯荧光探针，所述荧光探针为A-FDA荧光探针，A-FDA荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示:
所述的含有醛基结构的荧光素二乙酸酯荧光探针的制备方法，包括如下步骤：将荧光素单醛与碳酸钾加入到乙醚中，加入二氯甲烷以至溶解；滴加适量乙酸酐，室温下，磁力搅拌反应6h；对反应物进行抽滤，取下滤液，旋干，经硅胶柱层析提纯，得到白色固体即目标产物A-FDA荧光探针。所述二氯甲烷加入量为1-6滴。所述乙酸酐的加入量为3-8ml。
所述荧光素单醛与碳酸钾与乙醚的摩尔比为1:(1-3):(2-4)。
所述荧光素单醛的合成：取荧光素于烧瓶中，向烧瓶中加入氯仿和15-冠-5，在向烧瓶中缓慢滴加NaOH溶液，油浴55℃，反应7h后，取产物，进行酸化、抽滤、干燥、过柱提纯得到荧光素单醛。
制备反应式如下:
一种含有醛基结构的荧光素二乙酸酯荧光探针作为水解酶荧光探针的应用，主要用于检测活细胞酶指示。本发明的荧光探针可用于多种样品，如土壤、堆肥样品微生物活性的分析。
本发明具有以下有益效果：
本发明的荧光探针分子中的醛基能够改善其亲脂性和特异选择性，同时减少进入细胞后水解荧光素的反渗透，应用到细胞活性的检测，优化分析条件。另外，该探针还具有较好的化学稳定性，较好的溶解性和生物兼容性，不受其他常见的金属离子等物种的干扰。
附图说明
图1是实施例1制备的A-FDA对活细胞的荧光显微成像。
图2是A-FDA在细胞中停留时间的荧光响应。
图3是A-FDA在不同pH时水解程度的荧光响应图谱。
图4是实施例2的A-FDA测定土壤水解酶的图谱。Ab1：为土壤自身产生的物质的吸收图谱；Ab2为A-FDA在pH为7.4条件下水解的吸收图谱；Ac1为有A-FDA和土壤同时存在下的吸收图谱
具体实施方式
实施例1一种含有醛基结构的荧光素二乙酸酯荧光探针(A-FDA荧光探针)的制备方法
将1mol荧光素单醛与2mol碳酸钾加入到3mol乙醚中，加入3滴二氯甲烷以至溶解，滴加5ml乙酸酐，室温下，磁力搅拌反应6h，对反应物进行抽滤，取下滤液，旋干，经硅胶柱层析提纯，得到白色固体即目标产物A-FDA荧光探针。
HRMS：444.0845。
制备反应式如下：
其中，荧光素单醛合成方法为：取2g荧光素于烧瓶中，向烧瓶中加入12ml氯仿、0.4ml15-冠-5，在向烧瓶中缓慢滴加NaOH溶液，油浴55℃，反应7h后，取产物，进行酸化、抽滤、干燥、过柱提纯得到荧光素单醛。
[1]A-FDA在不同pH时水解程度的荧光响应
取0.0444gA-FDA于5ml容量瓶中，加入CHCl2溶解，定容至5ml，得到2×10-5M的A-FDA母液。分别取0.05mlFDA、A-FDA母液于比色皿中，加入3ml甲醇，充分搅拌均匀，等待5min，使其充分水解，测试荧光强度。由图3可以看出，在pH为1～3时随着pH增大，荧光强度基本保持不变。在pH范围为4-7时有轻微变化，当pH>9时，荧光强度明显增强，并随着pH增大而不断增大。
[2]荧光显微成像
进行对比试验，一组用A-FDA溶液对Hela细胞株或线虫染色，另一组为空白试验。向含有活细胞为Hela细胞株或线虫的培养皿中，加入浓度为5×10-5M的Rh-pH1的二甲基亚砜溶液，与细胞培养液混合均匀，染色5min后，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。实验结果发现，染有A-FDA的Hela细胞株或线虫中呈现出明显的荧光，如图1所示，实验结果表明，A-FDA具有较好的细胞膜透过性，能够定位于细胞中。结果显示探针具有很好的透膜性，可以进入细胞并在细胞中检测衡量总微生物活性的指示。
[3]停留时间测定
染色10min后细胞用去离子水洗3次后，将细胞加入一定量的培养基继续培养，然后分别间隔1、2、3、4、5h采集荧光图片，以荧光图片的荧光强度为纵坐标，时间为横坐标得出的数据图，如图2所示，该图表明A-FDA染色后在细胞内停留时间较长。
实施例2、A-FDA荧光探针测定土壤水解酶
取2g土壤于125ml锥形瓶中，向锥形瓶中加入15ml磷酸缓冲溶液(pH＝7.4,60mM)，向锥形瓶中加入0.2mlA-FDA溶液(3mM)，在30℃条件下，培养1h加入终止剂(体积比为2:1的氯仿甲醇混合溶液)取样品于15ml离心瓶中，2000转，离心3min，抽滤上清液，进行测试，结果如图4所示得到Ac1；设置量对照组，一组为：取2g土壤于锥形瓶中，加入15ml磷酸缓冲溶液(pH＝7.4,60mM)，向锥形瓶中加入0.2ml丙酮，30℃恒温震荡培养1h，加入终止剂，离心得上清液，进行测试，结果如图4所示得到Ab1；另一组为：向锥形瓶中加入等量磷酸缓冲溶液、0.2mlA-FDA溶液，在30℃条件下培养1h，加入终止剂，加入等量终止剂，同等条件离心，取上清液测试，结果如图4所示得到Ab2。
土壤活性表征为：公式：(Ac1-Ab1)/{C(A-FDA)×Soil×time}得到：74(M-1Fluoresceing-1soil-1h)。可见，A-FDA可对土壤微生物活性进行检测。