本发明涉及墨黑色素的制备方法，特别涉及海洋动物墨黑色素的制备工艺。
背景技术
墨黑色素(melanin)一词来源于希腊，由瑞士化学家berzelius首先提出，是一种不溶于水的生物大分子多聚体，还是已知唯一能够保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体，它广泛存在于动植物体内。海洋动物墨黑色素主要分布在软体动物门(mollusca)头足纲(cephalopoda)。墨黑色素是墨鱼、鱿鱼、章鱼等海洋头足类生物的墨汁中所含有的生物大分子多聚体的代称，是已知唯一能够保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体。含有多肽片断、酸性多糖、酪氨酸酶等多种生物活性成分。具有清除自由基和结合潜在毒性离子（如一些过渡金属）的特性，应用潜力巨大。
《本草拾遗》中有“腹中墨，主治血刺心痛”的记载。现代科学研究发现具有提高免疫功能、诱生细胞因子、高效抑制抗肿瘤活性，抗病毒、自由基清除剂、腹腔止血等多种生物活性作用。目前，海洋头足类动物墨黑色素的提取方法主要有高速离心法、酸/碱水解法、酶解法、碱溶酸沉法等，但现有的提取方法存在着一些缺点和不足：高速离心法制得的墨黑色素纯度不高；酸碱水解法制备墨黑色的纯度较高，但水解过程过于剧烈，会破坏墨黑色素，不利于保持墨黑色素的完成性和生物活性；传统的酶解法制得的墨黑色素结构完整，但无法实现墨黑色素与其他不被蛋白质分解的杂质分离；碱溶酸沉法提取的墨黑色素结构完整、纯度高，但无法提取与多糖、蛋白质结合的墨黑色素，提取率较低。此外，不同分子量的墨黑色素生理活性不尽相同，用途也不同。
技术实现要素：
为此，需要提供一种不同分子量墨黑色素的制备方法，为不同分子量的墨黑色素的进一步研究和墨黑色素的产业化生产提供原料。
为实现上述目的，发明人提供了一种海洋动物墨黑色素的制备方法
s1：将海洋头足纲动物腹部剖开，取出墨囊，
s2：将墨囊置于低温高速匀浆机中进行匀浆后剪开墨囊，得到匀浆墨汁
s3：将匀浆墨汁加入1-5倍体积的蒸馏水，进行超声波提取,得到提取液；
s4：向提取液加入蛋白酶进行酶水解反应，得到第一混合溶液；
s5：将第一混合液进行加热终止酶解反应，得到第二混合溶液，其中加热后煮沸时间控制在10~20min；
s6：将第二混合溶液自然冷却，冷却后调节第二混合溶液的ph值为6.8-7.2,得到第三混合溶液；将第三混合溶液进行离心，离心速度为8000-12000r/min，离心时间为10-20分钟，离心后弃除上清液，得到可溶性墨黑色素沉淀物；
s7：取可溶性墨黑色素沉淀物，加入10倍质量0.05mol/l的naoh溶液，进行溶解，得到第四混合溶液；
s8：将第四混合溶液采用截留分子量从大到小的超滤膜依次进行分离，分别得到相应分子量的可溶性墨黑色素沉淀的溶液；
s9：分别将s8步骤得到的不同分子量的可溶性墨黑色素沉淀的溶液调节ph值为6.8-7.2后8000-12000r/min离心，离心时间为10-20分钟，离心后弃除上清液，分别得到不同分子量的可溶性黑色素。
进一步地，所述s1步骤中，所述海洋头足纲动物为鱿鱼、章鱼或乌贼。
进一步地，所述s2步骤中，所述匀浆温度控制为0℃~10℃，匀浆转速控制为8000~12000r/min，匀浆时间为30~120s。
进一步地，所述s3步骤中，超声提取频率为50hz，提取温度为40-60℃，提取时间20~40min；
进一步地，所述s4步骤中，采用0.02-0.1mol/l的磷酸盐溶液控制水解过程的ph值为7.0-9.0。
进一步地，所述s4步骤中，所诉蛋白酶为碱性蛋白酶，其中，所述蛋白酶活性为6000-10000u/g墨囊，蛋白酶水解时间为2-8小时，水解温度为40-60℃。
进一步地，所述s6步骤中，采用0.02-0.1mol/l的磷酸盐溶液调节冷却后调节第二混合溶液的ph值为6.8-7.2。
进一步地，本发明制备的不同分子量墨黑色素，在药品、保健食品、营养食品和化妆品领域的应用。
区别于现有技术，上述技术方案采用超声和酶法提取可溶性墨黑色素，并用超滤膜分离不同分子量的墨黑色素，该方法用简单易行。采用超声和定向保温酶解提取可溶性墨黑色素，超声波有助于定向分离墨囊中的蛋白质和墨黑色素，将整个墨囊放入超声波中进行处理，可以使墨汁在挤出时，挂壁现象降低，提高墨汁的得率。酶法提取条件温和，有利于保持天然墨黑色素形态结构的稳定，超滤膜技术可获得不同分子量的可溶性墨黑色素，具有耗时短，提取率高，适用于工业生产等优点。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
实施例1:鱿鱼不同分子量墨黑色素提取
将鱿鱼腹部剖开，取出墨囊，墨囊洗净后进行称重；将墨囊置于低温高速匀浆机中，低温高速匀浆，匀浆温度为5℃，匀浆转速为10000r/min，匀浆时间80s；剪开囊膜，挤出匀浆后墨汁。收集上述墨汁，将墨汁用3倍体积的蒸馏水稀释后放入超声波提取器进行超声波提取，提取频率为50hz，提取温度为50℃，提取时间30min；提取液中加入0.05mol/l的磷酸盐溶液作为ph调节剂，调节ph值为8.0，加入碱性蛋白酶，蛋白酶的加入量为8000u/g墨囊，搅拌酶解提取，提取温度50℃，提取时间5h；加热酶解提取液，煮沸时间控制在10~20min，终止酶解反应；冷却后加入0.05mol/l的磷酸盐溶液ph值调节剂，调节ph值为6.8-7.2，10000r/min离心10~20min，得可溶性墨黑色素沉淀物；取可溶性墨黑色素沉淀物50g，加入500g的0.05mol/l的氢氧化钠溶解，放入膜分离装置中，开泵预平衡，超滤液和截留液返回循环药液，待药液循环平衡30min，操作压力为0.7mpa，分子截留温度为30℃，至药液全部滤过，收集超滤液；截留液经过截留分子量为50000和10000的超滤膜分离，分别收集滤液，得到分子量分别为小于10000、10000~50000、大于50000的墨黑色素溶液；向不同分子量的墨黑色素溶液中加入1.0mol/l的盐酸溶液调节ph为6.8-7.2，10000r/min离心15min，得不同分子量的可溶性墨黑色素沉淀物。其中，分子量小于10000的墨黑色素31.3g，分子量为10000~50000的墨黑色素11.7g，分子量大于50000的墨黑色素0.5g。
实施例2：章鱼不同分子量可溶性墨黑色素提取
将鱿鱼腹部剖开，取出墨囊，墨囊洗净后进行称重；将墨囊置于低温高速匀浆机中，低温高速匀浆，匀浆温度为0℃，匀浆转速为12000r/min，匀浆时间30s；剪开囊膜，挤出匀浆后墨汁。收集上述墨汁，将墨汁用5倍体积的蒸馏水稀释后放入超声波提取器进行超声波提取，提取频率为50hz，提取温度为40℃，提取时间40min；提取液中加入0.1mol/l的磷酸盐溶液作为ph调节剂，调节ph值为9.0，加入碱性蛋白酶，蛋白酶的加入量为10000u/g墨囊，搅拌酶解，温度40℃，时间8h；加热酶解提取液，煮沸时间控制在10~20min，终止酶解反应；冷却后加入0.01mol/l的磷酸盐溶液ph值调节剂，调节ph值为6.8-7.2，12000r/min离心10min，得可溶性墨黑色素沉淀物；取可溶性墨黑色素沉淀物50g，加入500g的0.05mol/l的氢氧化钠溶解，放入膜分离装置中，开泵预平衡，超滤液和截留液返回循环药液，待药液循环平衡30min，操作压力为0.6mpa，分子截留温度为40℃，至药液全部滤过，收集超滤液；截留液分别经过截留分子量分别为50000和10000的超滤膜分离，分别收集超滤液，得到分子量分别为小于10000、10000~50000、大于50000的墨黑色素溶液；向不同分子量的墨黑色素溶液中加入1.0mol/l的盐酸溶液调节ph为6.8-7.2，8000r/min离心20min，得不同分子量的可溶性墨黑色素沉淀物。其中，分子量小于10000的墨黑色素15.66g，分子量为10000~50000的墨黑色素20.88g，分子量大于50000的墨黑色素6.35g。
实施例3乌贼不同分子量可溶性墨黑色素提取
将乌贼腹部剖开，取出墨囊，墨囊洗净后进行称重；将墨囊置于低温高速匀浆机中，低温高速匀浆，匀浆温度为10℃，匀浆转速为8000r/min，匀浆时间120s；剪开囊膜，挤出匀浆后墨汁。收集上述墨汁，将墨汁用1倍体积的蒸馏水稀释后放入超声波提取器进行超声波提取，提取频率为50hz，提取温度为60℃，提取时间20min；提取液中加入0.02mol/l的磷酸盐溶液作为ph调节剂，调节ph值为7.0，加入碱性蛋白酶，蛋白酶的加入量为6000u/g墨囊，搅拌酶解，温度60℃，时间2h；加热酶解提取液，煮沸时间控制在10~20min，终止酶解反应；冷却后加入0.01mol/l的磷酸盐溶液ph值调节剂，调节ph值为6.8-7.2，8000r/min离心20min，得可溶性墨黑色素沉淀物；取可溶性墨黑色素沉淀物50g，加入500g的0.05mol/l的氢氧化钠溶解，放入膜分离装置中，开泵预平衡，超滤液和截留液返回循环药液，待药液循环平衡30min，操作压力为0.8mpa，分子截留温度为20℃，至药液全部滤过，收集超滤液；截留液分别经过截留分子量分别为50000、30000和10000的超滤膜分离，分别收集超滤液，得到分子量分别为小于10000、10000~30000、30000~50000、大于50000的墨黑色素溶液；向不同分子量的墨黑色素溶液中加入1.0mol/l的盐酸溶液调节ph为6.8-7.2，12000r/min离心10min，得不同分子量的可溶性墨黑色素沉淀物。其中，分子量小于10000的墨黑色素25.39g，分子量为10000~30000的墨黑色素7.88g，分子量为30000~50000的墨黑色素8.64g，分子量大于50000的墨黑色素1.39g。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。