复合颗粒的制作方法

本发明涉及复合发光颗粒及其作为发光标记物的用途。本发明还涉及制备所述复合颗粒的方法。

发明背景

由于其亲水性，氧化硅纳米颗粒在含水溶剂(例如含水生物缓冲剂)中形成高度稳定的悬浮液，甚至在非常高的固体含量下也是如此。已经公开了氧化硅纳米颗粒和发光材料作为标记或检测试剂。

nanoscaleres.lett.,2011,vol.6,p328公开了在氧化硅基质中捕集小分子。

langmuir,1992,vol.8,pp2921-2931公开了染料与硅烷偶联剂的偶联，然后将其纳入氧化硅球中。

j.mater.chem.,2013,vol.1,pp3297-3304,behrendt等人描述了氧化硅-lep纳米颗粒，其中lep与氧化硅共价结合。发光聚合物具有悬挂于聚合物主链的烷氧基硅烷基团，该基团在纳米颗粒形成期间与氧化硅单体反应。

nanoscale，2013，vol.5，pp8593-8601，geng等人描述了氧化硅-共轭聚合物(cp)纳米颗粒，其中lep具有悬挂的非极性烷基侧链，并且其中纳米颗粒具有“sio2@cp@sio2”结构。

chem.mater.,2014,vol.26,pp1874-1880,geng等人公开了负载聚(9,9-二己基芴-交替-2,1,3-苯并噻二唑)(pfbt)的纳米颗粒。

本发明的一个目的是提供结构稳定的发光颗粒。

本发明的又一个目的是提供具有高胶体稳定性的发光颗粒。

本发明的又一个目的是提供所述发光颗粒的简单合成。

发明概述

本发明人已发现，氧化硅聚合物和取代有极性基团的发光聚合物的组合能够提供具有良好胶体形成性质的稳定的发光颗粒。

因此，在本发明的第一方面，提供了一种复合颗粒，其包含氧化硅聚合物和发光聚合物，所述发光聚合物包含主链和悬挂于该主链的极性基团。

在第二方面，本发明提供一种胶体悬浮液，其包含悬浮在液体中的根据本发明第一方面的复合颗粒。

在第三方面，本发明提供了用于制备根据本发明第一方面的复合颗粒的方法，包括在发光聚合物存在下通过氧化硅单体的聚合形成氧化硅聚合物。

本发明人已发现，通过在颗粒表面上提供聚醚基团，可以增强包含氧化硅的颗粒的胶体稳定性，特别是在盐水溶液中的胶体稳定性。

因此，在第四方面，本发明提供了包含氧化硅的颗粒，所述颗粒具有在其表面上的聚醚基团。

在第五方面，本发明提供了一种胶体，其包含液体和第四方面的颗粒。所述液体优选是质子液体，任选为水或醇。所述液体可包含溶解在其中的一种或多种盐。所述液体可以是缓冲溶液。

在第六方面，本发明提供了形成根据第四方面的颗粒的方法，该方法包括使包含反应性基团和聚醚基团的化合物与颗粒反应以使聚醚基团共价结合到颗粒表面的步骤。

颗粒表面上的反应可以是反应性基团与表面上的氧化硅之间的反应，或者可以是氧化硅表面上的另一反应性基团(任选胺基)与化合物的反应性基团之间的反应。

第四方面的颗粒可包含氧化硅或由氧化硅组成。

第四方面的颗粒可包含氧化硅和至少一种发光材料。所述发光材料可以是聚合的或非聚合的。所述发光材料可以或可以不与颗粒共价结合。所述颗粒可以是根据第一方面的复合颗粒。

附图说明

现在将参考附图更详细地描述本发明，其中：

图1是根据本发明实施方案的蓝色发光氧化硅-lep纳米颗粒的平均数％对直径(nm)的坐标图；

图2是根据本发明实施方案的蓝色发光氧化硅-lep纳米颗粒的吸收光谱；

图3是根据本发明实施方案的蓝色发光氧化硅-lep纳米颗粒的光致发光光谱；

图4是未经表面处理的复合颗粒和已被处理从而在其表面形成氨基的复合颗粒的在甲醇中的胶体悬浮液的尺寸分布图；

图5是未经表面处理的复合颗粒和已被处理从而在其表面形成氨基的复合颗粒的在水中的胶体悬浮液的尺寸分布图；

图6是未经表面处理的复合颗粒和已被处理从而在其表面形成聚乙二醇链的复合颗粒的在磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)中的胶体悬浮液的尺寸分布图；

图7是根据一个实施方案的绿色发光复合纳米颗粒的紫外吸收光谱；

图8是根据一个实施方案的绿色发光复合纳米颗粒的光致发光光谱；

图9是根据一个实施方案的绿色发光复合纳米颗粒的z-平均直径相对于发光聚合物浓度的坐标图；

图10是根据一个实施方案的绿色发光复合纳米颗粒的z-平均直径相对于碱体积(basevolume)的坐标图；

图11是根据一个实施方案的绿色发光复合纳米颗粒的z-平均直径相对于硅酸盐体积的坐标图；和

图12是根据一个实施方案的绿色发光复合纳米颗粒的z-平均直径相对于总稀释度的坐标图。

发明详述

本发明的第一方面提供了一种复合颗粒，其包含氧化硅聚合物和发光聚合物的混合物，所述发光聚合物包含主链和悬挂于主链的极性基团。

本文所用的“氧化硅聚合物”是指包含硅氧烷基团的聚合物。氧化硅聚合物可具有包含交替的si和o原子或由交替的si和o原子组成的直链、支化或交联的主链。

氧化硅聚合物可以形成其中分散有发光聚合物的基质。复合材料的发光聚合物和氧化硅聚合物彼此不共价结合。因此，在颗粒的形成期间，不需要用反应性基团取代氧化硅聚合物和/或发光聚合物以形成这种共价键。

发光聚合物可以发射荧光、磷光或其组合。

发光聚合物可以是均聚物，或者可以是包含两种或更多种不同重复单元的共聚物。

发光聚合物可以包含在聚合物主链中、悬挂于聚合物主链或作为聚合物主链的端基的发光基团。在磷光聚合物的情形中，磷光金属络合物(优选磷光铱络合物)可以提供在聚合物主链中、悬挂于聚合物主链或作为聚合物主链的端基。

发光聚合物可以具有非共轭主链或者可以是共轭聚合物。“共轭聚合物”是指在聚合物主链中包含与相邻重复单元直接共轭的重复单元的聚合物。共轭发光聚合物包括但不限于包含沿聚合物主链彼此共轭的亚芳基、杂亚芳基和亚乙烯基中的一种或多种的聚合物。

发光聚合物可具有直链、支化或交联的主链。

发光聚合物可包含被至少一个极性基团取代的聚合物主链中的一个或多个重复单元。所述一个或多个极性基团可以是所述重复单元的仅有取代基，或者所述重复单元可以进一步取代有一个或多个非极性基团，任选地一个或多个c1-40烃基。取代有一个或多个极性基团的重复单元可以是聚合物的仅有重复单元，或者该聚合物可以包含一种或多种其它共聚重复单元，其中所述或每个共聚重复单元是未取代的或取代有非极性基团，任选地一个或多个c1-40烃基基团。

本文所述的c1-40烃基包括但不限于c1-20烷基、未取代的苯基和取代有一个或多个c1-20烷基的苯基。

本文所用的“极性基团”可以指使得发光聚合物在醇溶剂中具有至少0.0005mg/ml的溶解度的一种或多种基团，优选具有至少0.001、0.01、0.1、1、5或10mg/ml的溶解度。在25℃下测量溶解度。优选地，所述醇溶剂是c1-10醇，更优选甲醇。

极性基团优选是能够形成氢键或离子基团的基团。

在本发明第一方面的一个实施方案中，发光聚合物包含式-o(r³o)q-r⁴的极性基团，其中r³在每次出现时是c1-10亚烷基，任选c1-5亚烷基，其中该亚烷基的一个或多个不相邻的非末端c原子可以被o替换，r⁴是h或c1-5烷基，并且q是至少1，任选1-10。优选地，q为至少2。更优选地，q为2至5。在式-o(r³o)q-r⁴的所有极性基团中q的值可以相同。在相同聚合物的极性基团之间q的值可以不同。

本文中关于r³使用的“c1-5亚烷基”是指式-(ch2)f-的基团，其中f为1-5。

优选地，发光聚合物包含式-o(ch2ch2o)qr⁴的极性基团，其中q为至少1，任选1-10，并且r⁴为c1-5烷基，优选甲基。q优选为至少2。更优选地，q为2至5，最优选q为3。

在本发明第一方面的一个实施方案中，发光聚合物包含式-n(r⁵)2的极性基团，其中r⁵是h或c1-12烃基。优选地，每个r⁵是c1-12烃基。

在本发明第一方面的一个实施方案中，发光聚合物包含极性基团，所述极性基团是离子基团，其可以是阴离子型、阳离子型或两性离子型。优选地，离子基团是阴离子基团。

示例性的阴离子基团是：-coo^-；磺酸根基团；氢氧根；硫酸根；磷酸根；亚磷酸根；或膦酸根。

示例性的阳离子基团是-n(r⁵)3⁺，其中r⁵在每次出现时是h或c1-12烃基。优选地，每个r⁵是c1-12烃基。

包含阳离子或阴离子基团的发光聚合物包含抗衡离子以平衡这些离子基团的电荷。

阴离子或阳离子基团和抗衡离子可以具有相同的化合价，其中抗衡离子平衡每个阴离子或阳离子基团的电荷。

阴离子或阳离子基团可以是单价的或多价的。优选地，阴离子和阳离子基团是单价的。

发光聚合物可包含多个阴离子或阳离子极性基团，其中两个或更多个阴离子或阳离子基团的电荷被单个抗衡离子平衡。任选地，极性基团包括含有二价或三价抗衡离子的阴离子或阳离子基团。

抗衡离子任选为阳离子，任选金属阳离子，任选li⁺、na⁺、k⁺、cs⁺，优选cs⁺，或者有机阳离子，任选铵，如四烷基铵、乙基甲基咪唑鎓或吡啶鎓。

抗衡离子任选为阴离子，任选为卤离子；磺酸根基团，任选甲磺酸根或甲苯磺酸根；氢氧根；羧酸根；硫酸根；磷酸根；亚磷酸根；膦酸根；或硼酸根。

在本发明第一方面的一个实施方案中，发光聚合物包含选自如下的极性基团：式-o(r³o)q-r⁴的基团，式-n(r⁵)2的基团，式or⁴的基团，和/或离子基团。优选地，发光聚合物包含选自如下的极性基团：式-o(ch2ch2o)qr⁴的基团，式-n(r⁵)2的基团，和/或式-coo^-的阴离子基团。优选地，极性基团选自于由如下构成的组：式-o(r³o)q-r⁴的基团，式-n(r⁵)2的基团，和/或离子基团。优选地，极性基团选自于由如下构成的组：式-o(ch2ch2o)qr⁴的聚乙二醇(peg)基团，式-n(r⁵)2的基团，和/或式-coo^-的阴离子基团。r³、r⁴、r⁵和q如关于本发明的其它实施方案所述。

任选地，发光聚合物的主链是共轭聚合物。任选地，该共轭发光聚合物的主链包含式(i)的重复单元：

其中ar¹是亚芳基或杂亚芳基；sp是间隔基团；m是0或1；r¹在每次出现时独立地为极性基团；如果m为0则n为1，并且如果m为1则n为至少1，任选为1、2、3或4；r²在每次出现时独立地是非极性基团；p为0或正整数；q为至少1，任选为1、2、3或4；并且其中sp、r¹和r²在每次出现时可以独立地相同或不同。

优选地，m为1且n为2-4，更优选为4。p优选为0。

式(i)的ar¹任选为c6-20亚芳基或5-20元杂亚芳基。ar¹优选为c6-20亚芳基，任选为亚苯基、芴、苯并芴、菲、萘或蒽，更优选为芴或亚苯基，最优选为芴。

sp-(r¹)n可以是支化基团，任选为树枝状基团，取代有极性基团，任选为-nh2或-oh基团取代，例如聚乙烯亚胺。

优选地，sp选自：

-c1-20亚烷基或亚苯基-c1-20亚烷基，其中一个或多个不相邻c原子可以被o、s、n或c＝o替换；

-c6-20亚芳基或5-20元杂亚芳基，更优选亚苯基，除所述一个或多个取代基r¹之外，其可以是未取代的或取代有一个或多个非极性取代基，任选一个或多个c1-20烷基。

本文所用的“亚烷基”是指支化或直链的二价烷基链。

本文所用的烷基的“非末端c原子”是指除正烷基末端处的甲基或支化烷基链末端处的甲基以外的c原子。

更优选地，sp选自：

-c1-20亚烷基，其中一个或多个不相邻c原子可以被o、s或co替换；和

-c6-20亚芳基或5-20元杂亚芳基，甚至更优选亚苯基，其可以是未取代的或取代有一个或多个非极性取代基。

r¹可以是如本文任何地方所述的极性基团。优选地，r¹是：

-式-o(ch2ch2o)qr⁴的聚乙二醇(peg)基团，其中q为至少1，任选1-10，并且r⁴为c1-5烷基，优选甲基；

-式-n(r⁵)2的基团，其中r⁵是h或c1-12烃基；或

-式-coo^-的阴离子基团。

在n为至少2的情形中，每个r¹可以在每次出现时独立地相同或不同。优选地，与给定sp基团连接的每个r¹是不同的。

在p是正整数(任选1、2、3或4)的情形中，基团r²可以选自：

-烷基，任选c1-20烷基；和

-芳基和杂芳基，其可以是未取代的或取代有一个或多个取代基，优选为取代有一个或多个c1-20烷基的苯基；

-芳基或杂芳基基团的直链或支化链，每个所述基团可独立地被取代，例如式-(ar³)s的基团，其中每个ar³独立地为芳基或杂芳基且s为至少2，优选为苯基的支化链或直链，每个苯基可以是未取代的或取代有一个或多个c1-20烷基；和

-可交联基团，例如包含双键的基团如乙烯基或丙烯酸酯基团，或苯并环丁烷基团。

优选地，每个r²(当存在时)独立地选自c1-40烃基，并且更优选地选自c1-20烷基；未取代的苯基；取代有一个或多个c1-20烷基的苯基；和苯基的直链或支化链，其中每个苯基可以是未取代的或取代有一个或多个取代基。

本文所述的聚合物可包含仅一种形式的式(i)重复单元或由仅一种形式的式(i)重复单元组成，或者可包含两种或更多种不同的式(i)重复单元或由两种或更多种不同的式(i)重复单元组成。

任选地，包含一种或多种式(i)重复单元的聚合物是包含一种或多种共聚重复单元的共聚物。

如果存在共聚重复单元，则式(i)的重复单元可以形成聚合物重复单元的0.1-99摩尔％，任选50-99摩尔％或80-99摩尔％。优选地，式(i)的重复单元形成聚合物重复单元的至少50摩尔％，更优选至少60、70、80、90、95、98或99摩尔％。最优选地，聚合物的重复单元由一种或多种式(i)的重复单元组成。

可以选择聚合物的所述或每个重复单元以产生聚合物的期望发射颜色。

本文所述的复合颗粒的蓝色发光聚合物可具有峰值不大于500nm、优选400-500nm、任选400-490nm的光致发光光谱。

本文所述的复合颗粒的绿色发光聚合物可具有峰值大于500nm直至580nm、任选大于500nm直至540nm的光致发光光谱。

本文所述的复合颗粒的红色发光聚合物可具有峰值不大于超过580nm直至630nm、任选585nm直至625nm的光致发光光谱。

可以使用hamamatsu提供的装置c9920-02在溶液中测量本文所述的发光聚合物的光致发光光谱。

包含式(i)单元的聚合物的主链可以是非共轭的或共轭的。

所述聚合物优选是共轭聚合物，该共轭聚合物包含彼此共轭的式(i)重复单元和/或与式(i)重复单元相邻的共聚重复单元的芳族或杂芳族基团共轭的式(i)重复单元。示例性的共轭聚合物包括含以下重复单元的聚合物：亚芳基亚乙烯基重复单元；亚芳基重复单元；杂亚芳基重复单元；胺重复单元；及其组合。

如果存在，则所述或每个共聚重复单元可以是未取代的或取代有一个或多个非极性取代基，任选地一个或多个重复单元包含选自如下的基团或由如下的基团组成：一个或多个选自c6-20亚芳基和5-20元杂亚芳基，其中每个所述亚芳基或杂亚芳基在每次出现时独立地可以是未取代的或取代有一个或多个非极性取代基。

聚合物的亚芳基重复单元包括但不限于：芴，优选2,7-连接的芴；亚苯基，优选1,4-连接的亚苯基；萘，蒽，茚并芴，菲和二氢菲重复单元。亚芳基共聚重复单元可选自式(iii)-(vi)的重复单元：

其中r¹³在每次出现时独立地是取代基；c为0、1、2、3或4，优选为1或2；每个d独立地为0、1、2或3，优选为0或1；并且e为0、1或2，优选为2。

在聚合物主链中包含一个或多个未取代或取代的5-20元杂亚芳基或由其组成的重复单元包括但不限于：噻吩重复单元、联噻吩重复单元、苯并噻二唑重复单元、及其组合。示例性的杂亚芳基共聚重复单元包括式(vii)、(viii)和(ix)的重复单元：

其中r¹³在每次出现时独立地是取代基，并且f是0、1或2。

r¹³在每次出现时可以独立地是包含极性基团或由极性基团组成的基团，任选为极性取代基-(sp)m-(r¹)n，或非极性取代基r²，其中sp、m、r¹和r²如关于式(i)所述。

取代有一个或多个极性基团的亚芳基重复单元或杂亚芳基重复单元(任选为取代有式-(sp)m-(r¹)n的一个基团的式(iii)-(ix)的重复单元)是式(i)的重复单元。

亚芳基重复单元或杂亚芳基重复单元，任选为式(iii)-(ix)的重复单元，所述重复单元是未取代的或仅被一个或多个非极性基团取代，是聚合物的共聚重复单元。

聚合物的胺重复单元可具有式(xii)：

其中ar⁸、ar⁹和ar¹⁰在每次出现时独立地选自取代或未取代的芳基或杂芳基，g为0、1或2，优选0或1，r¹³在每次出现时独立地为取代基，并且x、y和z各自独立地为1、2或3。

当g为1或2时r⁹在每次出现时可以相同或不同，r⁹优选地选自烷基(任选为c1-20烷基)、ar¹¹以及ar¹¹基团的支化链或直链，其中ar¹¹在每次出现时独立地是取代或未取代的芳基或杂芳基。

直接结合到相同n原子的选自ar⁸、ar⁹和(如果存在时的)ar¹⁰和ar¹¹的任意两个芳族或杂芳族基团可以通过直接键或二价连接原子或基团连接。优选的二价连接原子和基团包括o、s、取代的n、和取代的c。

ar⁸和ar¹⁰优选为c6-20芳基，更优选为苯基，其可以是未取代的或取代有一个或多个取代基。

在g＝0的情形中，ar⁹优选为c6-20芳基，更优选苯基，其可以是未取代的或取代有一个或多个取代基。

在g＝1的情形中，ar⁹优选为c6-20芳基，更优选苯基或多环芳族基团，例如萘、苝、蒽或芴，其可以是未取代的或取代有一个或多个取代基。

r⁹优选为ar¹¹或ar¹¹基团的支化链或直链。ar¹¹在每次出现时优选为苯基，该苯基可以是未取代的或者取代有一个或多个取代基。

示例性的基团r⁹包括以下，它们各自可以是未取代的或者取代有一个或多个取代基，并且其中*表示与n的连接点：

x，y和z优选各自为1。

ar⁸、ar⁹和(如果存在时的)ar¹⁰和ar¹¹各自独立地是未取代的或取代有一个或多个(任选1、2、3或4个)取代基。

取代基可以独立地是包含极性基团或由极性基团组成的基团，任选为极性取代基-(sp)m-(r¹)n或非极性取代基r²，其中sp、m、r¹和r²如关于式(i)所述。

ar⁸、ar⁹和(如果存在时的)ar¹⁰和ar¹¹的优选取代基是c1-40烃基，优选c1-20烷基。

优选的式(xii)重复单元包括式(xii-1)、(xii-2)和(xii-3)的未取代单元或取代单元：

优选地，包含式(xii)的重复单元的聚合物还包含一种或多种亚芳基重复单元，任选为选自式(iii)-(ix)的一种或多种亚芳基重复单元。任选地，发光聚合物的0.1-50摩尔％是一种或多种式(xii)的重复单元。任选地，发光聚合物的重复单元包含如下重复单元或由以下重复单元组成：一种或多种式(xii)的重复单元和一种或多种亚芳基重复单元，任选地一种或多种式(iii)-(ix)的重复单元。

在磷光共轭聚合物的情形中，可以在主链中、在侧基中和/或作为聚合物的端基提供磷光基团，优选金属络合物，更优选铱络合物。包含铱络合物的示例性共轭重复单元具有下式：

优选地，式(i)的重复单元是式(ia)的重复单元：

其中r²、p、sp、r¹和n在每次出现时独立地如关于式(i)的重复单元所述。优选地，n在每次出现时为2。优选地，p在每次出现时为0。

式(ia)的示例性重复单元是：

任选地，氧化硅聚合物包含式iia和/或iib的重复单元：

其中r⁶在每次出现时独立地选自h或c1-12烃基，任选h或c1-12烷基。任选地，氧化硅聚合物还包含式(iic)的重复单元：

将理解，式(ii)重复单元的si原子与聚合物主链中的o原子或式or⁶的基团结合。

优选地，复合颗粒的总重量的至少0.1重量％由发光聚合物组成。优选地，复合颗粒的总重量的至少1、10、25或50重量％由发光聚合物组成。

优选地，复合颗粒的总重量的至少50重量％由氧化硅聚合物组成。优选地，复合颗粒的总重量的至少60、70、80、90、95、98、99、99.5、99.9重量％由氧化硅聚合物组成。

在本发明的第一方面的一个实施方案中，复合颗粒的总重量的至少70重量％由发光聚合物和氧化硅聚合物组成。优选地，复合颗粒的总重量的至少80、90、95、98、99、99.5、99.9重量％由发光聚合物和氧化硅组成。更优选地，复合颗粒基本上由发光聚合物和氧化硅聚合物组成。

在本发明的第一方面的一个实施方案中，复合颗粒是纳米颗粒。优选地，通过malvernzetasizernanozs测量，纳米颗粒的数均直径不大于5000nm，更优选不大于2500nm，1000nm，900nm，800nm，700nm，600nm，500nm或400nm。优选地，纳米颗粒包含具有如下数均直径的颗粒：5-5000nm，任选10-1000nm，优选25-600nm，更优选50-500nm，最优选75-400nm，通过malvernzetasizernanozs测量。

可以作为胶体悬浮液提供复合颗粒，所述胶体悬浮液包含悬浮在液体中的复合颗粒。优选地，液体选自水、c1-10醇及其混合物。优选地，所述胶体悬浮液不包含表面活性剂。

复合颗粒是荧光的或磷光的。优选地，复合颗粒是荧光的。优选地，复合颗粒用作荧光探针，更优选用作免疫检定中的荧光探针，例如横向流动或固态免疫检定。任选地，复合颗粒用于荧光显微术或流式细胞术。

根据本发明的第三方面，可以在发光聚合物存在下通过氧化硅单体的聚合而形成本发明第一方面的任何实施方案的复合颗粒。

在一个实施方案中，该方法包括用碱处理氧化硅单体和发光聚合物的溶液，或通过将氧化硅单体的溶液添加到发光聚合物和碱的溶液中，其中该溶液的溶剂是水、一种或多种c1-10醇或其组合。

在另一实施方案中，该方法包括在酸性条件下在单体和发光聚合物的溶液中使氧化硅单体聚合。

将理解，如此形成的复合颗粒的氧化硅聚合物和发光聚合物的混合物可以是均匀的或可以不是均匀的，并且可以包括但不限于包封在颗粒内的发光聚合物的一个或多个链和/或延伸穿过颗粒的一个或多个链。

发光聚合物的极性基团可以增强聚合物在极性溶剂中的溶解度，并且可以防止聚合物呈现紧密盘绕的形态，与其中不存在极性基团的发光聚合物被置于极性溶剂中的情况相比而言。

可以在发光聚合物存在下在氧化硅单体的一步聚合工艺由发光聚合物和氧化硅单体形成所述复合颗粒。

任选地，氧化硅单体是烷氧基硅烷，优选三烷氧基硅烷或四烷氧基硅烷，任选c1-12三烷氧基硅烷或四烷氧基硅烷，例如原硅酸四乙酯。氧化硅单体可以仅被烷氧基取代，或者可以被一种或多种基团取代。在一个实施方案中，氧化硅单体被聚醚基团取代。在另一实施方案中，氧化硅单体被反应性结合基团取代，如下面更详细所述，其在氧化硅单体的聚合期间不反应或者其在氧化硅单体的聚合期间受到保护。

任选地，该溶液包含离子溶剂或质子溶剂或者由离子溶剂或质子溶剂组成，优选为选自水、醇及其混合物的溶剂。示例性的醇包括但不限于甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇及其混合物。优选地，该溶液包含选自甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物的醇溶剂或由所述醇溶剂组成，更优选地该溶液包含选自甲醇、乙醇或其混合物的溶剂或由所述溶剂组成。优选地，溶剂体系不包含除水之外的非醇溶剂。

在本发明第三方面的一个实施方案中，碱是水性碱，优选氢氧化物如金属氢氧化物(优选碱金属氢氧化物、氢氧化铵或四烷基氢氧化铵)在水中的溶液，优选10-40％w/wnh3在水中的溶液，优选20-30％w/wnh3在水中的溶液。

在本发明第三方面的一个实施方案中，发光聚合物:氧化硅单体的重量比为1:1至1:500，优选1:3至1:300，或1:5至1:200，最优选1:10至1:100。本发明人已发现，通过选择发光聚合物:氧化硅重量比可以调节颗粒的直径。

在本发明第三方面的一个实施方案中，溶液中的发光聚合物的浓度在25℃下为至少0.0005mg/ml，优选至少0.001、0.01、0.1、1或10mg/ml。

任选地，形成复合颗粒的方法包括以下步骤：

(a)将发光聚合物溶解在溶剂体系中，该溶剂体系选自一种或多种质子溶剂，任选水、醇及其组合；

(b)向步骤(a)中获得的溶液添加碱；和

(c)向步骤(b)的溶液添加氧化硅单体的溶液。

任选地，在均质溶液中进行该方法。

复合颗粒可在形成后分离并再次悬浮在水性溶剂、有机溶剂或其混合物中。可以通过离心从反应混合物中分离复合颗粒。

在复合颗粒表面处的氧化硅可以反应从而将受体共价结合到氧化硅的表面上。受体可以与氧化硅表面直接结合或与氧化硅表面间隔开。

将受体结合到氧化硅表面的链优选包含胶体稳定基团或由胶体稳定基团组成，所述胶体稳定基团增强胶体的稳定性，所述胶体包含在一种或多种溶质可溶解于其中的质子液体(如水或醇)中的复合颗粒。所述液体可以是缓冲溶液。

-在一个实施方案中，所述受体在包括以下步骤的方法中与所述复合纳米颗粒共价结合：在所述氧化硅的表面处形成第一反应性基团rg1；

-使反应性基团与包含能够与第一反应性基团反应的第二反应性基团rg2的化合物反应从而形成共价键以及第三反应性基团rg3；和

-使第三反应性基团rg3与受体反应以使受体与复合纳米颗粒共价结合。

在复合颗粒表面的氧化硅可以与取代有反应性结合基团bg1的有机硅烷反应，任选地与式(x)的有机硅烷反应：

(r⁷o)3si-sp¹-rg1

(x)

其中r⁷是h或取代基，优选c1-10烷基；

sp¹是间隔基团；和

rg1是第一个反应性基团。

任选地，rg1选自于由如下构成的组：

胺，优选-n(r⁸)2，其中r8在每次出现时是h或取代基，优选h或c1-5烷基，更优选h；

羧酸或其酯，任选n-羟基琥珀酰亚胺酯；

烯烃；炔烃；sh；或叠氮化物。

示例性的有机硅烷是3-氨基丙基三乙氧基硅烷。

反应性结合基团bg1与式(xi)化合物反应

rg2-sp2-rg3

(xi)

其中rg2是能够与rg1反应形成共价键的基团；sp2是间隔基团；并且rg3是能够与受体结合的反应性结合基团。

任选地，rg1是胺并且rg2是能够与所述胺反应的基团，任选为能够与胺反应形成酰胺、任选羧酸或酰基氯的基团。

sp1和sp2可以各自根据它们的胶体稳定性质而选择。

本发明人已经发现，在氧化硅颗粒表面的聚醚链间隔基团可以使包含颗粒的胶体稳定，特别是在水性缓冲溶液液体中，例如盐浓度大于10mm的水性缓冲液。

本文所用的“聚醚链”是指包含至少两个醚基的二价链。

任选地，sp¹和sp²各自独立地选自直链或支化的二价亚烷基链，其中一个或多个不相邻c原子可以被o、s、c(＝o)、c(＝o)o、c(＝o)nr¹²或nr¹²替换，其中r12在每次出现时独立地选自h和c1-12烃基，任选c1-12烷基。

优选地，sp1和sp2中的至少一个包含式(xi)的重复单元或由其组成：

-((cr¹⁴r¹⁵)bo)c-

(xi)

其中r¹⁴和r¹⁵各自独立地为h或c1-6烷基并且b为至少1，任选为1-5，优选2，c为至少2，任选为2-1000，优选10-500、10-200或10-100。式(xi)的基团可以是多分散性的。式(xi)基团的mn可以为至少500，任选至少2000。

优选地，sp¹和sp²中的至少一个包含聚乙二醇链或由聚乙二醇链组成。

任选地，基团sp¹和sp²之一具有1-10个原子的链长度，任选地c1-10亚烷基链，并且sp¹和sp²中的另一个包含式(xi)的重复单元。

结合基团bg3可以与受体反应，该受体可以是合成基团或者受体包括但不限于：生物材料，任选为肽，碳水化合物，抗体，抗原，酶，蛋白质，细胞受体，dna，rna，pna，适体和天然产品；生物衍生材料，任选为重组抗体，修饰蛋白质(engineeredproteins)；和生物模拟物，任选合成受体，仿生催化剂，组合配体和印迹聚合物。优选的生物受体是链霉亲和素(streptavidin)。

将理解，可以使用其它方法使受体和/或胶体稳定基团共价结合到氧化硅颗粒的表面，包括但不限于：使取代有胶体稳定基团的氧化硅单体和/或未受保护或受保护的反应性基团rg1聚合；以及使复合颗粒与式(r⁷o)3si-sp¹-rg3的化合物反应，其中sp1包含胶体稳定基团。

在使用中，在其表面具有受体基团的颗粒可以与样品中的目标生物分子结合。生物分子包括但不限于dna、rna、肽、碳水化合物、抗体、抗原、酶、蛋白质和激素。优选的生物分子是生物素。

可以使样品固定在与本文所述的复合纳米颗粒接触的表面上，优选用包含本文所述的复合纳米颗粒的胶体悬浮液处理过。

本文所述的发光聚合物或氧化硅聚合物的通过凝胶渗透色谱法测量的聚苯乙烯当量数均分子量(mn)可以在约1×10³至1×10⁸的范围内，并且优选在1×10⁴至5×10⁶的范围内。本文所述聚合物的聚苯乙烯当量重均分子量(mw)可以为1×10³至1×10⁸，且优选为1×10⁴至1×10⁷。

如本文所述的聚合物适宜地是无定形聚合物。

如本文所述的复合颗粒可以用于但不限于生物成像荧光显微术、流式细胞术和基于荧光的免疫检定。

实施例1

通过斯德博工艺形成蓝色发光氧化硅-lep复合纳米颗粒的方法：

通过加热至60℃持续1小时使wo2012/133229(通过引用将其内容并入本文)中公开的lep1溶解在甲醇(1mg/ml或10mg/ml)中，然后将溶液冷却到室温。向2ml该溶液中加入0.15ml氢氧化铵(30％水溶液)，然后快速添加包含原硅酸四乙酯(teos，0.2ml)和甲醇(0.5ml)的溶液，并在室温下搅拌。在室温下持续搅拌1小时，然后将溶液以14,000rpm离心10分钟，以便从含有过量未反应teos和氢氧化铵的上清液中分离所得的氧化硅-lep纳米颗粒。通过倾析除去上清液，并使用轻柔的超声处理在2.5ml新鲜甲醇中使分离的纳米颗粒球团再分散。使由离心、倾析和再分散于甲醇(2.5ml)中组成的洗涤循环重复另外两次，然后使用2.5ml去离子水进行三次类似的洗涤。最后，将纳米颗粒再分散在1.5ml去离子水中，以使用malvernzetasizernanozs通过动态光散射测量颗粒尺寸。

通过以14,000rpm离心10分钟从1ml分散体中分离固体纳米颗粒来测定刚制备的纳米颗粒悬浮液的固体含量(纳米颗粒质量/体积)。通过离心、倾析和再分散(如上所述)用甲醇洗涤两次并使固体球团干燥过夜之后，使用微量天平测定固体的质量。

使用cary5000uv-vis-ir光谱仪测定刚制备的纳米颗粒分散体的光密度。

使用配备有积分球附件的hamamatsuc9920-02pl量子产率光谱仪来测定在水分散体中的纳米颗粒的光致发光量子产率。

表1用不同的lep1和teos比例制备的氧化硅-lep纳米颗粒的plqy

这些复合颗粒的尺寸分布、吸收光谱和光致发光光谱示于图1-3中。

由于它们的极高的荧光亮度、在水性缓冲液中的稳定性和易于表面附着于到生物分子，所制备的氧化硅-lep纳米颗粒特别适合用作荧光示踪剂或用于光学传感检定的标签。

复合纳米颗粒的氨基改性

向复合纳米颗粒在甲醇中的3ml悬浮液(通过动态光散射测量的数均直径＝165nm，固体含量～4mg/ml)中加入120μl的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，并在室温下搅拌该悬浮液1小时。使该悬浮液以14,000rpm离心2分钟，以便从含有过量的未反应(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的上清液中分离所得氧化硅-lep纳米颗粒。通过倾析除去上清液，并使用温柔的超声处理将分离的纳米颗粒球团再分散在3ml新鲜甲醇中。将由离心、倾析和再分散于甲醇(3ml)中组成的洗涤循环重复另外两次，最后再分散于3ml甲醇中。为了制备用于动态光散射分析的样品，将100μl悬浮液离心并如上所述倾析上清液，并将分离的纳米颗粒再次悬浮于1ml甲醇或水中。

氨基改性的复合纳米颗粒的聚乙二醇化

将上述实施例中形成的氨基改性复合纳米颗粒在甲醇中的悬浮液的1ml以14,000rpm离心2分钟，通过倾析上清液分离纳米颗粒。使用α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧丙基)氨基]乙基}聚乙二醇(mr＝2000g/mol，10mg)、n-(3-氨基丙基)-n-乙基碳二亚胺(2.1mg)和n-羟基琥珀酰亚胺(2.5mg)在甲醇中的1ml溶液以通过温柔的超声处理使纳米颗粒球团再分散，并将所得悬浮液在室温下搅拌1小时。将悬浮液以14,000rpm离心2分钟以便使所得氧化硅-lep纳米颗粒从含有过量的未反应聚乙二醇化试剂的上清液分离。通过倾析除去上清液，并使用温柔的超声处理将分离的纳米颗粒球团再分散在1ml新鲜甲醇中。将由离心、倾析和再分散于甲醇(1ml)中组成的洗涤循环重复另外两次。在最后的离心和倾析之前，将悬浮液等分成四个250μl部分，并在使用前将所得球团储存在-20℃。

链霉亲和素与聚乙二醇化复合纳米颗粒的共轭

通过温柔的超声处理将上述实施例中的一种分离的聚乙二醇化复合纳米颗粒球团再次悬浮于1ml磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)中，然后立即加入50μl链霉亲和素在相同缓冲液中的溶液(1mg/ml)。将悬浮液在室温下搅拌1小时，然后添加到填充有sephacryls-300hr分离介质(用150ml磷酸盐缓冲盐水预洗涤)的4.5cm高、3cm直径的圆柱的顶部。用相同的缓冲液洗脱该圆柱，从而收集1.5ml级分。选择含有最高浓度的纳米颗粒(基于荧光强度)的圆柱级分用于随后的生物检定。

评价复合纳米颗粒在各种分散剂中的胶体稳定性

以下测试用于确定裸复合纳米颗粒和官能化的复合纳米颗粒(由相同批次生产)在各种分散剂中的相对稳定性。在离心和倾析后，通过在浴超声仪中超声处理5分钟，将分离的复合纳米颗粒(～0.4mg)再次分散在分散剂(1ml)中。就在dls分析之前，将纳米颗粒悬浮液超声处理另外一分钟，然后使用malvernzetasizernanozs进行分析。表2显示了通过dls测定的裸复合纳米颗粒和表面改性复合纳米颗粒在各种分散剂中的多分散性指数(pdi)，并且图4-6显示了相应的数均尺寸分布。

表2

制备用于生物检定的生物素-bsa改性的载玻片

将用(3-氨基丙基)硅烷的自组装单层官能化的玻璃显微镜载玻片浸入含有琥珀酸酐(1g)和三甲胺(1.3ml)在乙腈(50ml)中的溶液持续16小时，然后用新鲜的乙腈(50ml)洗涤三次。干燥后，将grace-biolabssecureseal成像间隔物固定到所得羧基官能化载玻片的表面，以便分离四个圆形区域(直径＝9mm)，用于随后的结合检定。在载玻片的每个分离区域内加入80μl的含有n-(3-氨基丙基)-n-乙基碳二亚胺(77.0mg)和n-羟基磺基琥珀酰亚胺(33.0mg)的1ml溶液。在室温下放置30分钟后，除去溶液并将分离的区域用水(80μl)洗涤三次。在除去最后一次洗涤溶液之后，向所述区域中的两个加入80μl的生物素化牛血清白蛋白(50μg/ml)在磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)中的溶液，并向两个剩余区域加入80μl的封闭缓冲液，该封闭缓冲液在含有0.01重量％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)中包含牛血清白蛋白(3重量％)。在室温下1小时之后，从含有生物素化的牛血清白蛋白溶液的两个区域中除去溶液，并在其位置加入80μl上述封闭缓冲液。在室温下再过一小时后，从所有四个区域除去溶液，并用含0.01重量％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)将每一个区域洗涤三次。

使用链霉亲和素改性的复合纳米颗粒的生物素结合检定

向上述实施例中产生的每个牛血清白蛋白改性区域(两个生物素化并且两个非生物素化)添加60μl的含有前面实施例中描述的链霉亲和素改性的复合纳米颗粒的圆柱级分。在室温下放置1小时之后，除去溶液并用80μl的含0.01重量％tween-20的磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)洗涤三次，并用80μl去离子水洗涤一次。在空气中干燥后，使用基于显微镜的光谱仪测量四个检定区域中每一个的荧光强度，使用汞灯作为激发源(λex＝365nm)并且使用光纤光谱仪用于检测。如图x所示，含有生物素的两个检定的平均积分荧光强度高于非生物素化的对照区域的平均积分荧光强度，这证明si-lep纳米颗粒已通过特异性链霉亲和素-生物素相互作用而固定在表面上。

实施例2

使用lep2作为共轭聚合物，通过按照与实施例1相同的斯德博工艺，得到发绿光的氧化硅-lep复合颗粒。

这些纳米颗粒的紫外吸收和光致发光光谱分别示于图7和8中。

发现该氧化硅-lep2复合纳米颗粒的光致发光量子产率(plqy)为46％。

所述颗粒具有以下尺寸：

z平均值-195.5nm

数量平均值-137.0nm

强度平均值-225.5nm

所述颗粒具有0.131的pdi。

可通过改变共轭聚合物的浓度、硅酸盐体积、碱体积和/或总稀释度来控制复合纳米颗粒的尺寸，分别如图9-12所示，其中通过动态光散射测量z-平均直径。

虽然关于具体的示例性实施方案描述了本发明，然而将意识到在不偏离下列权利要求所述的本发明范围的情况下，本文所公开特征的各种修改、改变和/或组合对本领域技术人员而言将是明显的。