一种防污酶在无机涂层表面的固定化方法与流程

本发明属于防污酶固定化技术领域，具体涉及一种防污酶在无机涂层表面的固定化方法，采用烷氧基硅烷、氨基硅烷、硅溶胶制备表面含有氨基基团的无机涂层，基于戊二醛的连接作用将防污酶形成防污酶共价固定在无机涂层表面。

背景技术：

海洋污损生物也称为海洋附着生物，是生长在船底和海中一切设施表面的动物、植物和微生物的总称，污损生物附着生长过程称为生物污损。海洋生物污损对船舶、水下装备和海上人工设施造成严重危害，必须采用有效措施防止海洋生物对其造成的污损附着。有机锡防污涂料因严重危害海洋生态和环境，已被禁止使用；现有技术中广泛使用的含铜元素防污涂料由于会导致海湾铜元素累积，并同样导致严重海洋生态环境问题，在一些国家已被限制使用并面临禁用的趋势。针对海洋生物污损对船舶及海上人工设施造成严重危害以及传统有毒防污涂料面临禁用和限制使用的背景，开发环境友好型海洋防污涂料具有重要意义，其中酶基防污涂层技术由于其环保性、高效性和广普性已引起世界各国广泛关注和深入研究，成为新型对环境友好防污材料发展的重要方向之一。研究发现，海洋污损生物附着基础大抵相同，其黏附物质包含蛋白质类、多糖类和脂质类等物质。基于酶的分解作用直接分解黏附物质可以对其附着产生有效的抑制作用，例如蛋白酶分解蛋白类黏附物质、淀粉酶分解多糖类黏附物质、脂肪酶分解脂质类黏附物质等。利用酶对污损生物黏附物质高效的水解活性和良好的环境友好性发展酶基防污涂层材料是海洋防污技术重要发展趋势，防污酶的固定化处理是其应用过程中的重要环节。

根据作用力将防污酶常用的固定方法分为物理吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。酶固定化载体主要有无机载体和有机载体两大类，无机载体主要有硅藻土、硅胶、多孔玻璃和介孔分子筛等多孔无机材料，有机载体主要包括天然高分子载体(如海藻酸钠、纤维素、壳聚糖等)和合成有机高分子载体(如大孔树脂、合成纤维等)。gatenholm等证实包埋在涂料里的细菌仍可保持活力并产生生物活性成分；holmstrom等则探讨了影响固定于凝胶中细菌活力的因素及所需条件；dandavate、yilmaz分别将假丝酵母脂肪酶共价固定在硅纳米粒子和玻璃微珠表面，获得可重复利用和用于酯化合成的酶制剂；huijs等人通过聚合物中的乙酰乙酸基、醛基、氯甲基等进行酶的固定化。固定化酶及防污测试结果表明，通过涂层粘结剂的官能团共价连接固定酶能够产生有效的防污作用，以这种方式应用的酶在涂层中体现出显著的防污效果，另外固定化也提高了酶防污性能。biolocus公司申请的美国专利us20080038241公开了一种用有机硅-丙烯酸自抛光树脂作为成膜物，用酶催化产生过氧化物作防污剂的防污涂料；韩国大学研究与商业基金申请了用酶与纤维混合物作防污物质的防污涂料；国际知名的丹麦酶制剂公司genecor公司与著名涂料生产厂商hempel公司合作研发基于葡萄糖化酶和己糖氧化酶联合作用生产双氧水的防污新技术，目前该技术已经成功应用到防污涂料中，并已开始实船应用。

海洋防腐领域应用的防腐涂料主要有环氧类、聚氨酯类、橡胶类、氟树脂类、有机硅树脂类、聚脲弹性体类等，在水下海洋环境中，通常是以配套体系的方式应用，如防腐底漆、中间连接漆、防污面漆体系，即防腐涂层与防污涂层通过连接漆粘结，配套应用。中国专利201810373368.0公开的一种防污酶在氧化石墨烯表面的固定化方法，工艺过程包括分散、氨基化、醛基化和固定化共四个步骤，其关键过程是防污酶在氧化石墨烯粉体表面的固定化，用于制备防海生物附着材料，并不提供防腐蚀性能；中国专利201610250733.x公开的一种共价固定防污酶的温敏自抛光树脂制备方法，包括温敏自抛光树脂的制备和共价固定防污酶两个步骤，其中共价固定防污酶过程涉及防污酶在树脂微粒表面固定，固定后含酶树脂重新分散于二甲苯溶液中，形成防海生物附着用涂料树脂，本树脂在海洋环境下可逐步水解，只具有单一的防污功能，并不提供防腐蚀性能，另外涂层的透明度较差，也不具有水下观察窗防污应用潜力。以上专利方法均不适用于防污酶在有机涂层表面的固定化，如果一种涂层同时具备良好的防腐性能和防污性能，将能够很大程度的降低成本并拓展应用领域，目前该方面的应用尚鲜见报道。因此，根据海洋船舶、海洋结构物、水下装备观察窗等海洋污损环境对绿色防污涂层的迫切需求，提出一种防污酶在无机涂层表面的固定化方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，研发设计一种防污酶在无机涂层表面的固定化方法，使得共价固定防污酶后的无机涂层在具备良好防腐性能的同时也具备较好的防污性能。

为了实现上述目的，本发明涉及的防污酶在无机涂层表面的固定化方法的工艺过程包括制备有机涂层、交联处理和固定化防污酶共三个步骤：

(一)制备有机涂层：将烷氧基硅烷加入ph值为4.0-5.0的硅溶胶调中，于45-60℃下水解0.5-2h，形成混合液，在混合液中加入氨基烷氧基硅烷，混合均匀后涂覆在涂膜片上，涂膜片上形成有机涂层；

硅溶胶与烷氧基硅烷的质量比值为0.8-1.3，氨基烷氧基硅烷的质量占混合液的质量的0.1-5.0％；

(二)交联处理：将戊二醛加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为5％的戊二醛溶液，将涂膜片浸入到戊二醛溶液中，进行5h的戊二醛交联处理，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，除去残余的戊二醛，完成交联处理；

(三)固定化防污酶：将防污酶加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为5-20％的防污酶溶液，将步骤(二)交联处理后的涂膜片浸入防污酶溶液中，在5-30℃下浸泡5h，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，将清洗后的样品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，完成防污酶在有机涂层表面的固定化。

本发明涉及的烷氧基硅烷为正硅酸乙酯烷、甲基三乙氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷中的一种或几种。

本发明涉及的氨基烷氧基硅烷为二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷和(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷中的一种或几种。

本发明涉及的防污酶为蛋白酶、淀粉酶、几丁质酶和溶菌酶中的一种或几种。

本发明与现有技术相比，使用烷氧基硅烷、氨基硅烷、硅溶胶制备表面含有氨基基团的无机涂层，将防污酶通过戊二醛的连接作用固定于透明的硅溶胶无机涂层表面，使无机涂层在具有良好防腐性能的同时具备了较好的防污性能，应用于海洋船舶、结构物(船坞、钻井平台、墩和桩)等的表面防污以及水下装备观察窗等关键部位的防腐防污，还能够为酶基防污涂层材料的制备提供技术支撑；其制备方法简单可行，所用原料便宜易得，大大降低了制作成本，硅溶胶无机涂层固定化防污酶具有较好的透明性和良好的防腐与防污性能，在海洋环境中的表面防污和防腐防污方面应用前景广阔。

附图说明：

图1为本发明的工艺流程框图。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步描述。

实施例1：

本实施例涉及的防污酶在无机涂层表面的固定化方法的工艺过程包括制备有机涂层、交联处理和固定化防污酶共三个步骤：

(一)制备有机涂层：将正硅酸乙酯烷加入ph值为4.0的硅溶胶调中，于45℃下水解1h，形成混合液，在混合液中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，混合均匀后涂覆在涂膜片上，涂膜片上形成有机涂层；

硅溶胶与正硅酸乙酯烷的质量比值为0.8，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的质量占混合液的质量的0.1％；

(二)交联处理：将戊二醛加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为5％的戊二醛溶液，将涂膜片浸入到戊二醛溶液中，进行5h的戊二醛交联处理，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，除去残余的戊二醛，完成交联处理；

(三)固定化防污酶：将蛋白酶加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为20％的蛋白酶溶液，将步骤(二)交联处理后的涂膜片浸入蛋白酶溶液中，在5℃下浸泡5h，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，将清洗后的样品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，完成防污酶在有机涂层表面的固定化。

实施例2：

本实施例涉及的防污酶在无机涂层表面的固定化方法的工艺过程包括制备有机涂层、交联处理和固定化防污酶共三个步骤：

(一)制备有机涂层：将甲基三乙氧基硅烷加入ph值为5.0的硅溶胶调中，于50℃下水解2h，形成混合液，在混合液中加入(3-氨丙基)三甲氧基硅烷，混合均匀后涂覆在涂膜片上，涂膜片上形成有机涂层；

硅溶胶与甲基三乙氧基硅烷的质量比值为1.3，(3-氨丙基)三甲氧基硅烷的质量占混合液的质量的3.0％；

(二)交联处理：将戊二醛加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为5％的戊二醛溶液，将涂膜片浸入到戊二醛溶液中，进行5h的戊二醛交联处理，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，除去残余的戊二醛，完成交联处理；

(三)固定化防污酶：将蛋白酶加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为10％的蛋白酶溶液，将步骤(二)交联处理后的涂膜片浸入蛋白酶溶液中，在10℃下浸泡5h，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，将清洗后的样品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，完成防污酶在有机涂层表面的固定化。

实施例3：

本实施例涉及的防污酶在无机涂层表面的固定化方法的工艺过程包括制备有机涂层、交联处理和固定化防污酶共三个步骤：

(一)制备有机涂层：将甲基三甲氧基硅烷加入ph值为5.0的硅溶胶调中，于60℃下水解0.5h，形成混合液，在混合液中加入(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，混合均匀后涂覆在涂膜片上，涂膜片上形成有机涂层；

硅溶胶与甲基三甲氧基硅烷的质量比值为1.0，(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的质量占混合液的质量的5.0％；

(二)交联处理：将戊二醛加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为5％的戊二醛溶液，将涂膜片浸入到戊二醛溶液中，进行5h的戊二醛交联处理，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，除去残余的戊二醛，完成交联处理；

(三)固定化防污酶：将蛋白酶加入到ph值为7的磷酸盐缓冲液中，配制成质量百分比浓度为5％的蛋白酶溶液，将步骤(二)交联处理后的涂膜片浸入蛋白酶溶液中，在30℃下浸泡5h，然后用ph值为7的磷酸盐缓冲液清洗涂膜片3次，将清洗后的样品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，完成防污酶在有机涂层表面的固定化。本实施例制备的固定化防污酶通过中性盐雾法进行耐蚀性能测试的结果是1000h内无显著腐蚀。

本实施例制备的固定化防污酶进行抑制硅藻附着性能测试时，以不含蛋白酶的载玻片为对照空白，将底栖硅藻的浓度用灭菌海水稀释为1.0×10⁶个/ml，2小时后硅藻在对照空白载玻片表面的附着量为144个/mm²，硅藻在固定化防污酶载玻片表面的附着量为31个/cm²，测试结果表明，固定化蛋白酶对硅藻的附着具有良好的抑制作用。