一种荧光纳米碳颗粒的制备方法及应用与流程

本发明专利涉及一种荧光纳米碳颗粒的制备方法，特别指用于生物医药学领域，如生物荧光标记、活体示踪成像等。其制备方法简单有效，可在常规实验室内进行制备。

背景技术：

近年来，荧光纳米粒子在生物医药学的多个方面得到广泛运用，如生物荧光标记、活体示踪成像等。在众多制备荧光纳米粒子的方法中，采用纳米银、纳米锌、碳纳米管或石墨烯等昂贵纳米材料，使用掺杂金属离子及表面钝化peg等方式修饰纳米粒子，可以获得较高荧光量子产率的纳米粒子。如专利cn201810813435.6提供了一种以氮杂环类有机物和柠檬酸为原料，利用微波反应器中加热碳化制备荧光纳米碳点的方法。专利cn201511031216.5提供了一种将含有羧基的有机酸与有机胺，在水热釜中，进行水热反应制备近全光谱荧光纳米碳点的方法。专利cn201810299331.8提供了一种将双亲分子、有机前驱体与溶胶混合得到囊泡包裹的荧光碳纳米材料。然而由于上述这些制备方法工艺步骤繁琐，原料成本较高等因素，导致荧光纳米粒子的合成难以规模化生产。此外，一些对生物体有毒害的纳米颗粒，也极大地限制了这类技术的发展。因此寻找低毒或无毒、制备简单、成本低廉和环境友好的荧光纳米颗粒受到广大研究者的重视。

纳米碳溶胶属于碳纳米材料的一种，利用脉冲式电极法电解石墨制备而成，可溶于水且成本相对低廉。相比其它纳米粒子的合成，纳米碳溶胶具备良好的生物相容性、低毒性等特点。近年来，纳米碳溶胶在植物生产、生物医学等领域得到应用，但其示踪技术尚未突破，关于纳米碳溶胶的荧光颗粒制备以及在示踪方面的应用尚未报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的荧光纳米粒子制作成本高，工艺复杂，难以大规模制备的特点，以纳米碳溶胶为基础材料，提供了一种有效、成本低廉而且制作工艺简单的荧光纳米碳颗粒制备方法。该纳米碳颗粒是在水的媒介下发生表面官能团的变化，进而对纳米碳材料进行改性，其中反应是需要edc作为本合成方法中的羧基活化剂。

本发明主要是通过以下技术方案来实现的：

一种荧光纳米碳颗粒的合成方法，它是由纳米碳颗粒上的羧基基团经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）活化后与5-氨基荧光素反应制备而成，使得纳米碳颗粒带有5-氨基荧光素的荧光基团。

该合成方法具体分为三步，第一步，采用稀释后的氨水调节纳米碳溶胶的ph至7.5-8.5，加入edc活化纳米碳颗粒的表面羧基基团，活化反应时间为连续搅拌至少4h；第二步，将5-氨基荧光素溶液逐渐加入到已活化后的纳米碳溶胶胶液中，对纳米碳颗粒的表面官能团进行改性，使得纳米碳颗粒的表面修饰荧光集团，改性反应时间为连续搅拌至少12h；第三步，利用乙醇洗脱纳米碳颗粒上的5-氨基荧光素，收集沉淀的纳米碳颗粒，第三步需多次重复，以保证彻底洗脱5-氨基荧光素。

本发明更具体是说，用于改性的反应试剂是由浓度0.9-1.2mg/ml的纳米碳溶胶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）以及5-氨基荧光素组成。具体步骤如下：

步骤1羧基官能团活化：

取25-50ml的纳米碳溶胶（碳颗粒含量在0.9-1.2mg/ml），使用稀释后的0.1n的氨水调节其ph为7.8-8.5，超声30min。加入一定量的edc进行活化，纳米碳溶胶中碳颗粒与edc的质量比为1:30~40，然后使用0.1n的氨水调节其ph为6.0，连续搅拌4h。此时，纳米碳颗粒表面羧基官能团被edc充分活化。

步骤2制备：

配制2g/l的5-氨基荧光素溶液，加入到步骤1中活化后的纳米碳溶胶胶液中，活化后的纳米碳溶胶胶液与5-氨基荧光素溶液的体积比为1:3~6，连续搅拌12h。

步骤3分离和提纯：

取一定量上述溶液于离心管中，加入乙醇，洗脱反应液中的5-氨基荧光素，重复多次，直至洗脱液中无荧光出现，荧光强度用紫外分析仪对洗脱液鉴定。收集沉淀的荧光纳米碳颗粒，冷冻干燥机中冻干保存。

本发明的优点在于：采用本方法能够有效的合成荧光纳米碳颗粒，解决了动植物细胞的成像问题和纳米碳颗粒的示踪问题。本发明所使用材料成本低廉、制备过程中不需要繁琐的工艺流程，显著降低了成本和制作工艺的难度，并可在常规实验室制备得到；制备的荧光纳米碳颗粒可应用于在动植物细胞的荧光标记、活体示踪成像。

附图说明

图1为本发明荧光纳米碳颗粒荧光强度；

图2激光共聚焦显微镜图片对比图。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施实例，可以更清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1

（1）取25ml浓度为1mg/ml的纳米碳溶胶，使用0.1n的氨水调节其ph为8.0，超声30min。

（2）加入30mg的edc于反应液中，采用0.1n的氨水调节其ph为6.0，连续搅拌4h，使得纳米碳颗粒表面羧基官能团被edc充分活化。

（3）将10mg的5-氨基荧光素溶于少量乙醇中，再加入5ml的超纯水充分溶解，制备5-氨基荧光素溶液。

（4）将步骤（3）溶液缓缓加入到步骤（2）中已活化的纳米碳溶胶胶液中，活化纳米碳溶胶胶液与5-氨基荧光素溶液体积比为1:5，连续搅拌12h，使纳米碳溶胶的表面官能团与5-氨基荧光素充分反应。

（5）取200μl上述溶液于1.5ml离心管中，加入1ml乙醇，常温条件下12000r/min离心，洗脱纳米碳颗粒溶胶中的5-氨基荧光素。收集沉淀的纳米碳颗粒，再次加入1ml乙醇，超声5min，分散纳米碳颗粒。

（6）继续使用乙醇洗脱，重复多次，直至洗脱液中无荧光出现（荧光强度用紫外分析仪（海骥辉公司，az-zf-7a）对洗脱液鉴定）。收集沉淀的荧光纳米碳颗粒。

（7）将收集到的纳米碳颗粒置于冷冻干燥机中冻干保存。

（8）以洋葱内表皮细胞作为材料进行荧光观察。将冻干后的荧光纳米碳颗粒溶于水后得到荧光纳米碳溶胶。撕取洋葱内表皮细胞，浸泡于0.9%的nacl溶液中，然后加入纳米碳颗粒处理（对照：加入纳米碳溶胶，处理：加入本发明制备的荧光纳米碳溶胶；最终浓度均为100mg/l）。暗处孵育12h后，使用动态超高分辨单双光子激光共聚焦显微镜（德国leica公司）制片观察。

具体实施效果：结合图1和图2可以看出，本方法合成的荧光纳米颗粒在515nm附近有明显的荧光峰值。与对照相比，使用本方法合成的荧光纳米碳颗粒发出绿色的荧光，主要分布在细胞壁内部，少量进入洋葱表皮细胞中，细胞成像效果良好，可用于生物医学实验。

技术特征：

技术总结
一种荧光纳米碳颗粒的合成方法，是由纳米碳颗粒上的羧基基团经过1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化后与5‑氨基荧光素反应制备而成，使得纳米碳颗粒带有5‑氨基荧光素的荧光基团。该纳米碳颗粒是在水的媒介下发生表面官能团的变化，进而对纳米碳材料进行改性，其中反应是需要EDC作为本合成方法中的羧基活化剂。采用本方法能够有效的合成荧光纳米碳颗粒，解决了动植物细胞的成像问题和纳米碳颗粒的示踪问题。本发明所使用材料成本低廉、制备过程中不需要繁琐的工艺流程，显著降低了成本和制作工艺的难度，并可在常规实验室制备得到；制备的荧光纳米碳颗粒可应用于在动植物细胞的荧光标记、活体示踪成像。

技术研发人员：梁太波;张艳玲;赵振杰;戴华鑫;王爱国;王广山;翟振;孟祥宇
受保护的技术使用者：中国烟草总公司郑州烟草研究院
技术研发日：2019.04.26
技术公布日：2019.06.21