一种检测脂滴极性的荧光探针及其应用的制作方法

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种检测脂滴极性的荧光探针及其应用。

背景技术：

脂滴由于其特殊的结构和生理功能，最近得到广大研究者的关注。脂滴作为富含脂质的亚细胞器，在真核细胞中广泛存在，由中性脂质的核心组成，所述中性脂质由安装相关蛋白质的单层磷脂包围。除了作为能量储存器外，脂滴还参与各种生理过程，包括细胞活化，迁移，增殖，凋亡等。越来越多的证据表明脂滴的异常与癌症发展有关。据报道，癌细胞中脂滴的数量高于正常细胞，因为脂滴提供的大量能量是癌细胞更快的增殖所必需的。因此，脂滴的数量可被视为癌症诊断的潜在肿瘤标志物。此外，由于癌细胞中脂质代谢的特定改变，癌细胞中脂滴的极性低于正常细胞。因此，结合两个指标（脂滴的数量和极性）将为癌症诊断提供更可靠和准确的信息。然而，就我们所知，通过监测脂滴的数量和极性变化来诊断癌症的研究尚未实现。

癌症是全世界公认的绝症之一，每年都有大量的人死于癌症。尽管癌症是重要的疾病，但是如果我们及时诊断与治疗，癌症死亡率是可以控制的。目前通过肿瘤标志物来诊断癌症已经为热点，尽管现有的一些肿瘤标记物已经大大提高了癌症诊断率，但是由于它们具有入侵性以及操作不方便等缺点而限制了它们的广泛应用。因此，发展新的肿瘤标记物对癌症的诊断与治疗具有十分重要的意义。近年来，脂滴因其独特的结构与性能广泛地引起大家的关注。脂滴除了为细胞提供能量以外，还与许多重要的生理活动有关。已经有报道称，由于脂滴的新陈代谢机理不同，所以脂滴在癌细胞中的极性会比在正常细胞中大。因此，脂滴的极性可以作为区分癌细胞与正常细胞的一个重要指标。所以，检测脂滴的极性将会为癌症的诊断提供重要的指导信息。

目前，荧光成像技术由于其高灵敏度、无创检测和高选择性，已成为检测生物微极性环境的有力工具。因此，发展一种新的极性探针检测细胞内脂滴的极性对于癌症的诊断和临床研究具有重要的意义。

技术实现要素：

针对目前现有技术中存在的问题，本发明提供一种能检测脂滴内极性的荧光探针。该探针具有低毒性，良好的光学稳定性，能准确定位脂滴及对极性特异性响应，利用本发明的探针通过荧光成像技术检测癌细胞。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测细胞脂滴内极性的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测细胞脂滴内极性的荧光探针，其化学结构式如式（i）所示：

式（i）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）3-硝基-7-二乙胺基香豆素（1）与氯化锡于浓盐酸中搅拌反应，分离提纯得化合物3-氨基-7-二乙胺基香豆素（2）：

；

（2）3-氨基-7-二乙胺基香豆素（2）与对氟硝基苯于二甲基亚砜中反应后，加入氟化铯催化反应，140℃回流反应，反应结束后分离提纯得化合物3-（双4-硝基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素（3）：

；

（3）3-（双4-硝基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素（3）与水合肼、钯炭于乙醇中反应，分离、提纯得荧光探针3-（双4-氨基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素：

。

步骤（1）中，所述物料3-硝基-7-二乙胺基香豆素与氯化锡的物质的量比为1:3。

步骤（1）中，所述分离提纯步骤为向反应液中加入氢氧化钠溶液中和，直至溶液呈现中性，析出黄色沉淀，抽滤，固体以二氯甲烷/甲醇=20:1v/v为淋洗液过硅胶柱，得到化合物3-氨基-7-二乙胺基香豆素。

步骤（2）中，所述物料3-氨基-7-二乙胺基香豆素与对氟硝基苯的物质的量比为1:2。

步骤（2）中，所述分离提纯步骤为将反应液用去离子水析出黄色沉淀，抽滤后的固体以二氯甲烷/甲醇=20:1v/v为淋洗液过硅胶柱，得到化合物3-（双4-硝基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素。

步骤（3）中，所述反应物料3-（双4-硝基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素（3）、水合肼与钯炭的物质的量比为1:2:2。

步骤（3）中，所述分离提纯步骤为将反应液中加入去离子水，析出黄色沉淀，抽滤后固体以二氯甲烷/甲醇=20:1v/v为淋洗液过硅胶柱得到化合物3-（双4-氨基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素，即荧光探针。

一种上述荧光探针在检测细胞中脂滴内极性的应用。

本发明的机理如下：

由于香豆素羰基结构是一个强吸电子基团，二乙胺基是一个供电子基团，所以在探针结构中，存在由“二乙胺基”部分向“羰基”部分发生的电子转移，即分子内电子转移（ict）效应。正是这种ict效应使探针具有“溶剂化效应”。在一定的极性范围内，如四氢呋喃溶剂极性之前，由于“负溶剂效应”占主要作用，使得探针随着极性溶剂极性的增加荧光强度逐渐增大；随着溶剂极性进一步增大四氢呋喃溶剂极性之后，由于“正溶剂效应”占主导作用，使得探针荧光强度随着极性的变化而减小。然而，无论在正常细胞中还是在癌细胞中，脂滴的极性都会在四氢呋喃极性之前，并且，癌细胞中脂滴的极性会小于正常细胞中脂滴的极性。所以当探针在极性较小的癌细胞脂滴环境中会发出较强的荧光，而在极性较大的正常细胞脂滴环境中会发出较弱的荧光。因此，正常细胞与癌细胞可以通过荧光强度的变化进行区分，从而实现诊断癌症的诊断。

本发明具有以下优点：

本发明提供的荧光探针能区分正常细胞与癌细胞，准确的定位于脂滴，具有较高的灵敏度，良好的光学稳定性以及对极性特异性响应，实现了对细胞内脂滴极性的检测。利用本发明的探针通过荧光成像技术可于评价和研究细胞中脂滴的含量，对研究获得细胞中脂滴的生理功能有潜在的应用价值。同时，该探针的合成步骤简单、纯化方便、收率高。

附图说明

图1是荧光探针的¹hnmr图谱；

图2是荧光探针在不同极性溶剂中的紫外光谱。探针的浓度：5µm；

图3是荧光探针在不同极性的溶剂中的荧光光谱。其中激发波长为415nm；探针的浓度：10µm；

图4是荧光探针在小鼠成纤维细胞（3t3）与小鼠乳腺癌细胞（4t-1）的细胞成像测试。探针浓度为10μm，激发波长为405nm；

图5是荧光探针在小鼠肿瘤组织中的组织成像测试。探针浓度为10μm，激发波长为405nm。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

（1）化合物3-氨基-7-二乙胺基香豆素的合成：3-硝基-7-二乙胺基香豆素（1）与氯化锡于浓盐酸中搅拌（摩尔比为1:3），反应6小时，加入氢氧化钠溶液中和，直至溶液呈现中性，析出黄色沉淀，抽滤，纯化得到化合物3-氨基-7-二乙胺基香豆素（2）：

;

（2）化合物3-（双4-硝基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素的合成：3-氨基-7-二乙胺基香豆素（2）与对氟硝基苯于二甲基亚砜中搅拌（摩尔比为1:2），反应1小时后，加入催化剂-氟化铯，反应12小时，用去离子水析出黄色沉淀，抽滤纯化得到化合物3-（双4-硝基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素（3）：

；

（3）荧光探针的合成：3-（双4-硝基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素（3）与水合肼、钯炭于乙醇中（摩尔比为1:2:2），反应12小时，用去离子水析出黄色沉淀，抽滤纯化得到化合物3-（双4-氨基苯基）氨基-7-二乙基氨基香豆素3，即为探针：

；

其¹hnmr图谱如图1。

实施例2荧光探针在不同极性溶剂中的紫外光谱

配制浓度为1mm的荧光探针的母液作为备用，二甲基亚砜为溶剂。加入10μl探针母液于2ml不同极性的溶剂中，探针终浓度为5μm。溶剂按照极性从小到大排列依次为：甲苯，1，4-二氧六环，四氢呋喃，二氯甲烷，二甲基亚砜，甲醇，去离子水。检测各溶剂的紫外吸收光谱，如图2所示：该探针在不同极性的溶剂中具有不同的最大吸收波长。

实施例3荧光探针在不同极性的溶剂中的荧光光谱

配制10ml浓度为1mm的实施例所得荧光探针的母液作为备用，二甲基亚砜为溶剂。加20μl探针母液于2ml不同极性的溶剂中，探针终浓度为10μm。溶剂按照极性从小到大排列依次为：甲苯，1，4-二氧六环，四氢呋喃，二氯甲烷，二甲基亚砜，甲醇，去离子水。激发波长为415nm，检测荧光探针在各溶剂中荧光光谱，如图3所示。由图3可知，随着极性的增加，该探针的最大发射波长呈现明显的红移趋势。

实施例4荧光探针在3t3细胞与4t-1细胞的细胞成像测试

配制10ml浓度为1mm的实施例所得荧光探针的母液作为备用，二甲基亚砜为溶剂。将10μl的探针母液分别加入3t3和4t-1细胞中孵育20min。待培养结束后，用荧光显微镜在单光子模式下分别拍摄3t3和4t-1细胞荧光照片，激发波长为405nm，如图4所述。由图4可知，荧光探针在小鼠乳腺癌细胞（4t-1）中进行聚集，发射出绿色的荧光，而在小鼠成纤维细胞（3t3）中，荧光探针没有发出荧光。

实施例5荧光探针在小鼠乳腺肿瘤细胞中与商业化脂滴染料的共定位

配制浓度为1mm的实施例所得荧光探针的二甲基亚飒的测试母液待用；配制浓度为20μm的市售的尼罗红脂滴的专用定位剂的二甲基亚飒的测试母液待用。将适当密度的小鼠乳腺肿瘤细胞接种到灭菌的成像培养皿中，在培养箱中培养，待细胞贴壁后，同时分别向三组细胞中加入脂滴商业化染料尼罗红、荧光探针、尼罗红+探针，使荧光探针最终浓度为10μm，尼罗红最终浓度为5μm。半小时后，弃掉培养基，用pbs缓冲液（ph=7.2）冲洗细胞3次，随后进行荧光成像，绿色激发波长为405nm，红色激发波长为561nm。用荧光显微镜在单光子模式下分别拍摄用尼罗红、荧光探针和尼罗红+探针共同孵育细胞的荧光照片，如图5所示。由图5可知，荧光探针在细胞中，发射出绿色荧光；尼罗红在细胞中，发射出红色荧光；而尼罗红+探针在细胞中，发射出交叠的黄色荧光。实验结果表明，该探针能准确定位细胞内脂滴。