一种比率型荧光探针的制备方法及其在酪氨酸酶检测中的应用

一种比率型荧光探针的制备方法及其在酪氨酸酶检测中的应用
【技术领域】
1.本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测酪氨酸酶的比率型荧光探针及其制备方法和应用。
【技术背景】
2.酪氨酸酶(tyr)是存在于黑色素细胞中的一种含铜氧化酶，是黑色素合成的限速酶，主要参与合成黑色素的反应，即单酚羟基化和邻苯二酚向邻醌的转化。不同生物制剂中酪氨酸酶的物理性质和化学性质均有所不同。对人类来说，酪氨酸酶的表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量，其异常表达可能导致黑色素沉着和严重的白癜风。研究表明,酪氨酸酶在黑色素瘤细胞中过表达，因此被用作黑色素瘤诊断的特异性生物标志物。
3.目前，已有多种技术(比色法、高效液相色谱法、分光光度法、电化学检测法等)被应用于酪氨酸酶的检测中，例如一种具有“固相抗体-待测抗原-标记抗体”三明治结构的sers传感器(专利号：zl201910337215.5)通过磁性基底的吸附和表面增强拉曼探针的增强作用，对酪氨酸酶进行检测。还有科学家通过对萤光素类物质的化学修饰，连接具有与酪氨酸酶反应特异性的基团，合成了一类可用于酪氨酸酶检测的生物发光探针(专利号：zl201810188419.2)。与其他检测方法相比，荧光分析法具有选择性高、操作简便、能够实现实时监控等特点，在生物活性分子检测中显示出越来越广泛的应用前景。
4.荧光探针的设计和开发是荧光分析技术的重点。我们前期利用能够发出蓝色荧光的碳点构建了酪氨酸酶响应探针(analytica chimica acta,2021,1169)。与单一荧光发射的探针相比，具有多重发射峰且不同发射峰对待检测物响应性不同步的荧光物质能够构建比率型荧光探针，利用不同发射峰的强度对比值的变化标定待检测物的浓度，该方法可以有效地消除探针自身、样品及设备等因素引起的背景误差，从而可以获得更加准确的结果。
5.基于以上事实，我们合成了一种荧光金纳米簇y-auncs，并对其进一步修饰，构建了一种可以检测酪氨酸酶活性浓度的比率型荧光探针，该探针灵敏度高、检测下限低，具有较大应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提供一种比率型荧光探针，用于高灵敏度和高选择性地检测酪氨酸酶活性浓度。
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
8.一种检测酪氨酸酶的比率型荧光探针的制备方法，具体步骤如下：
9.1)将氯金酸溶液与三肽ycy(酪氨酸-半胱氨酸-酪氨酸)溶液混合均匀，在高温水浴下反应，反应完毕后将样品离心，取上清液，透析纯化后即可制得金纳米簇y-auncs。
10.2)向y-auncs溶液中加入短肽ycy，得到比率型荧光探针y-auncs@ycy。
11.3)其中，所述步骤1)中反应温度为65-80℃，优选地，为70℃。
12.其中，所述步骤1)中反应时间为7-12h，优选地，为9h。
13.其中，所述步骤1)中ycy溶液与氯金酸溶液的终浓度比为1-2.5:2，优选地，为1.50:2。
14.其中，所述步骤2)中加入ycy的量为0.25-1.5mm，优选地，为0.5mm。
15.本发明还提供了一种荧光探针y-auncs@ycy对酪氨酸酶活性浓度的检测方法，该方法步骤如下：
16.1)利用荧光分光光度计测量y-auncs@ycy在300nm激发下荧光发射图谱。
17.2)用缓冲溶液配置不同浓度的酪氨酸酶溶液，分别与y-auncs@ycy混合。
18.3)将所述步骤2)获得的溶液利用荧光分光光度计分别在激发波长300nm下测量其荧光发射图谱。
19.4)将所述步骤1)和所述步骤3)中所得谱图在420nm处的荧光强度a和在780nm处的荧光强度b的比值进行数据处理后作图，可得该比值与酪氨酸酶活性浓度的关系。
20.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
21.1)探针y-auncs@ycy为比率型荧光探针，同荧光强度响应型相比，可以通过不同波长处荧光强度的比值反映信息，进而可以有效克服样品、设备等背景因素带来的误差，使结果更准确。
22.2)y-auncs@ycy合成操作简便，经济性强，且制备出的y-auncs@ycy水溶性好，稳定性好，在实际应用中具有广泛的应用前景。
23.3)y-auncs@ycy对酪氨酸酶的特异性强，具有很好的抗干扰能力；并且该比率变化值与酪氨酸酶浓度有很强的线性关系，检测下限低，可以实现对酪氨酸酶的准确定量分析。
【附图说明】
24.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，用于解释本说明，但并不构成对本发明的限制。附图如下：
25.图1为本发明提供的比率型荧光探针y-auncs@ycy的tem图。
26.图2为本发明提供的实施例3中y-auncs@ycy对酪氨酸酶的响应性分析图。
27.图3为本发明提供的实施例4中y-auncs@ycy与不同浓度酪氨酸酶反应40分钟后，y-auncs@ycy特征荧光强度比值与酪氨酸酶浓度之间的关系图。
28.图4为本发明提供的实施例4中y-auncs@ycy特征荧光强度比值与酪氨酸酶活性浓度的线性曲线。
【具体实施方式】
29.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
30.实施例1
31.荧光金纳米簇y-auncs的制备方法如下：
32.1)将50ul 20mm氯金酸溶液和55ul 15mm三肽ycy溶液混合均匀，使用超纯水将其定容至500ul，置于70℃水浴锅中反应9小时。
33.2)将样品取出后移至离心管，设定转速1300rpm，离心15分钟后取其上清液，用超
纯水将其透析纯化，即可得到y-auncs，将其置于4℃冰箱中避光保存。
34.实施例2
35.比率型荧光探针y-auncs@ycy的制备方法如下：
36.向实施例1中制得的y-auncs中加入0.5mm三肽ycy，即可制得荧光探针y-auncs@ycy，
37.所得y-auncs@ycy置于4℃冰箱中避光保存。
38.实施例3
39.比率型荧光探针y-auncs@ycy对酪氨酸酶的响应性分析：
40.1)用10.0mm磷酸盐缓冲溶液将酪氨酸酶溶液配制成10u/ml的溶液；依次量取100ul酪氨酸酶溶液和100ul实施例2中制备得到的y-auncs@ycy溶液加入比色皿中混合均匀，将其置于荧光分光光度计中，测量其在激发波长为300nm下的荧光发射图谱；将该混合溶液置于20℃条件下反应40分钟后再次测量其荧光发射图谱(图2)。由图2可得，随时间增长，y-auncs@ycy和酪氨酸酶混合溶液在420nm处的荧光强度上升，在780nm处的荧光强度下降，即该混合液在420nm处的荧光强度a和在780nm处的荧光强度b的比值变大，其对酪氨酸酶具有较好的响应性。
41.2)用10.0mm磷酸盐缓冲溶液将酪氨酸酶配制成活性浓度为0u/ml、0.02u/ml、0.04u/ml、0.08u/ml、0.12u/ml、0.16u/ml、0.2u/ml、0.4u/ml、0.8u/ml、1.2u/ml、1.6u/ml、2u/ml、4u/ml、8u/ml、12u/ml、16u/ml、20u/ml的溶液；依次量取100ul实施例2中制备得到的y-auncs@ycy溶液和100ul不同活性浓度的酪氨酸酶溶液加入比色皿中混合，在20℃中反应40分钟后将溶液置于荧光分光光度计中，分别测量该混合溶液的荧光光谱图。
42.图3以酪氨酸酶活性浓度为横坐标，以该溶液在420nm处荧光强度a和在780nm处的荧光强度b的比值归一化为纵坐标作图得到的荧光探针auncs@ycy对酪氨酸酶的工作曲线。
43.图4为在0-1.0u/ml的酪氨酸酶活性浓度下，以酪氨酸酶活性浓度为横坐标，以溶液在420nm处荧光强度a和在780nm处的荧光强度b的比值归一化为纵坐标作图得到的荧光探针auncs@ycy对酪氨酸酶的线性曲线。由图可得在0-0.1u/ml段活性浓度下，酪氨酸酶活性浓度与该特征比值之间有着良好的线性关系，线性方程为y＝4.89x r2＝0.997。作图所用的荧光强度值皆是在300nm激发波长下所得的。
44.以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；且以上实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。