一种核黄素-氧化石墨烯荧光探针及其应用

1.本发明属于荧光探针技术领域，尤其涉及一种核黄素-氧化石墨烯荧光探针及其应用。


背景技术：

2.诺氟沙星(nox)是一类典型的喹诺酮类抗生素，因其良好的抗菌性被广泛应用于治疗人类及动植物的疾病。给药的nox有部分会随着尿液被排出，继而流入环境中。nox在水体中和动物食品中的残留不仅会引起遗传毒性，而且会导致耐药性细菌的产生。如今，在不同的水体中，甚至在饮用水中都检测到了nox。环境中不断积累的nox不仅对环境造成污染，且在一定程度上威胁人类和动植物的健康，尽管环境中nox以较低的浓度存在，但由于生物富集作用，nox在生物体内不断富集，随着时间的推移会对环境造成更严重的危害。因此，为了有效处理nox造成的污染问题，首先应该实现对氟沙星浓度的有效检测；
3.目前已经开发出许多有效的方法来实现对诺氟沙星浓度的检测，如高效液相色谱法(hplc)、免疫测定法、电化学方法等。这些方法都实现了对诺氟沙星浓度的有效监控，然而，这些方法大多都存在一些问题，例如前处理步骤复杂、仪器昂贵、试剂损耗量大等问题；
4.荧光探针检测技术由于其操作简单、成本低、环境友好、高灵敏度和选择性好等优点，吸引了大量的研究兴趣。探针和目标物质之间的相互作用可以引起探针荧光的变化，从而实现对目标物质的检测。目前存在有许多类型的荧光探针，由于它们能够在复杂的基质中精确、快速的检测目标物质，近年来已被广泛应用于制药、食品和其他行业；
5.因此，研发一种能够高效且快速检测诺氟沙星含量的荧光探针，具有较好的应用前景。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种核黄素-氧化石墨烯荧光探针及其应用，具体涉及一种核黄素-氧化石墨烯荧光探针及其在诺氟沙星含量检测中的应用。
7.本发明的具体技术方案包括：
8.本发明提供了一种核黄素-氧化石墨烯荧光探针，结构包括核黄素和氧化石墨烯，核黄素通过π-π共轭、氢键与氧化石墨烯结合并吸附在氧化石墨烯表面。
9.作为本发明的进一步优化方案，所述核黄素-氧化石墨烯荧光探针的制备方法为：将核黄素稀释液与氧化石墨烯分散液经振荡混合均匀后，室温静置，使核黄素在氧化石墨烯表面充分吸附，即获得核黄素-氧化石墨烯荧光探针。
10.作为本发明的进一步优化方案，所述氧化石墨烯分散液的浓度为25.0mg/l，核黄素稀释液的浓度为1.0μm。
11.本发明还提供了如上述任一所述的核黄素-氧化石墨烯荧光探针在诺氟沙星含量检测中的应用。
12.作为本发明的进一步优化方案，将核黄素-氧化石墨烯荧光探针加入含诺氟沙星的待测样品中，待测样品中的诺氟沙星对氧化石墨烯表面的核黄素进行置换，使核黄素从氧化石墨烯表面解吸附，核黄素的荧光得以恢复，以荧光强度的变化量测定待测样品中诺氟沙星的含量。
13.作为本发明的进一步优化方案，具体为兽药中诺氟沙星含量的检测。
14.作为本发明的进一步优化方案，所述诺氟沙星含量的检测下限为23.3μg/l。
15.本发明提出了一种核黄素-氧化石墨烯荧光探针，核黄素(以下记为rf)，一般被称为维生素b2，是一种重要的维生素，在细胞内外广泛存在。根据核黄素的化学结构显示，它是一种带有核糖醇侧链的异咯嗪环衍生物。rf在波长为375至500nm的激发波长下会发出荧光，并且rf和氧化石墨烯(以下记为go)的芳香环之间的相互作用以及氢键作用，能够使go淬灭rf的荧光，在测定诺氟沙星(以下记为nox)含量时，rf通过π-π共轭、氢键与go结合，吸附在go表面；在nox加入后，nox对go表面吸附的rf进行置换，使rf从go表面解吸附，荧光得以恢复，通过这样“关-开”的荧光探针实现nox含量的检测，并以荧光强度的变化量测定nox的含量，最终结论得出荧光探针检测nox含量的检测下限低至23.3μg/l，本发明提出的荧光探针能够实现在较低浓度下检测nox。
16.综上所述，本发明的有益效果为：
17.(1)本发明利用rf与nox在go表面竞争吸附，通过荧光强度的变化实现对nox浓度的测定，不仅能够在较低浓度下检测nox，且对于不同的阴离子具有良好的抗干扰能力，选择性好，使得诺氟沙星检测无需复杂的前处理，检测难度降低；
18.(2)本发明区别于传统方法的前处理复杂、仪器昂贵、需要耗费大量试剂等不足，具有操作简便、快速高效、灵敏度高的优势，应用前景好。
附图说明
19.图1为rf@go荧光探针测定nox含量的原理示意图；
20.图2为rf的三维荧光光谱图；
21.图3为不同浓度go淬灭rf荧光的荧光光谱图；
22.图4为不同浓度go淬灭rf荧光的标准工作曲线图(0.0-75.0mg/l)；
23.图5为标准工作曲线图(0.0-10.0mg/l)；
24.图6为图5中nox浓度0.1-2.0mg/l之间曲线的线性拟合工作曲线图；
25.图7为rf@go荧光探针检测各浓度诺氟沙星标准工作溶液的荧光光谱图；
26.图8为rf@go荧光探针检测诺氟沙星注射液的荧光光谱图；
27.图9为其他常见阴离子与nox竞争时，rf@go荧光探针的荧光变化图。
具体实施方式
28.实施例1
29.本实施例提供一种核黄素-氧化石墨烯荧光探针，该荧光探针的结构包括核黄素和氧化石墨烯，核黄素通过π-π共轭、氢键与氧化石墨烯结合并吸附在氧化石墨烯表面，将核黄素-氧化石墨烯荧光探针加入含诺氟沙星的待测样品中，待测样品中的诺氟沙星对氧化石墨烯表面的核黄素进行置换，使核黄素从氧化石墨烯表面解吸附，核黄素的荧光得以
恢复，以荧光强度的变化量测定待测样品中诺氟沙星的含量(图1)。下面结合具体实施例及附图对该荧光探针和制备方法以及利用该荧光探针进行诺氟沙星含量的具体检测过程进行详细阐述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
30.一、材料
31.本实施例所用的rf购买自sigma，go、nox购买自aladdin；其他所述使用的试剂无特别说明均为市购，试剂均为分析级，另外，本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法。
32.二、方法
33.1、rf@go荧光探针的制备
34.(1)配制rf、go溶液
35.将go薄片分散在水中，配制成浓度为0.5g/l的go分散液，配制浓度为5.0μm的rf溶液，rf的三维荧光光谱图如图2所示。
36.(2)调整rf@go的用量比例
37.取0.2mlrf溶液于pe管中，分别取不同体积的go溶液加入到pe管中，加入去离子水使溶液总体积为2.0ml，最终pe管中go浓度分别为0、0.5、1.5、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、50、75mg/l，在室温静置0.5h，使rf在go表面充分吸附，然后在激发波长450nm条件下测定540nm的荧光强度，记为i0，不同浓度go淬灭rf荧光的荧光光谱图如图3所示，以i0对go的浓度关系，做标准工作曲线(图4)，根据标准工作曲线选择最佳浓度比例，选择go浓度为25.0mg/l，rf浓度为1.0μm来制备荧光探针。
38.(3)制备检测用rf@go荧光探针
39.按上述方法取0.1mlgo分散液、0.2mlrf溶液置于pe管内，振荡混合均匀后，在室温静置0.5h，使rf在go表面充分吸附，即获得检测用rf@go荧光探针。
40.2、标准工作曲线的绘制
41.(1)配制浓度范围在0.2-10.0mg/lnox标准工作溶液，分别取1.0ml不同浓度nox加入到到上述制得的检测用rf@go探针中，加入0.7ml去离子水使得溶液总体积为2.0ml，在室温静置0.5h，使rf充分解吸附，然后在450nm激发波长下测定540nm的荧光强度，记为i
标
；
42.(2)将1.7ml去离子水加入到所述检测用rf@go溶液中，室温静置0.5h，作为空白样品，在激发波长为450nm条件下测定540nm的荧光强度，记为i1；
43.3、以i1对诺氟沙星的浓度关系，做标准工作曲线(图5)；另外，图6为图5中nox浓度0.1-2.0mg/l之间曲线的线性拟合工作曲线图i1＝1595.37672c+283.24904。
44.4、待测样品检测
45.(1)将1.0ml不同浓度待测样品加入到所述检测rf@go溶液中，加入去离子水使溶液总体积为2.0ml，室温静置0.5h，使rf充分解吸附，然后在激发波长为450nm条件下测定540nm的荧光强度，记为i
样品
，图7为0.0-10.0mg/l各浓度诺氟沙星标准工作溶液的荧光光谱图；
46.(2)根据步骤2的标准工作曲线，获得所述待测样品的nox含量。
47.三、验证试验
48.1、rf@go荧光探针对诺氟沙星实际样品的检测
49.取市购的诺氟沙星注射液，其诺氟沙星浓度为20.0g/l，将其稀释至0.2、2.0、4.0mg/l，分别取1.0ml不同浓度待测溶液加入到所述rf@go溶液中，加入0.7ml去离子水使溶液总体积为2.0ml，按上述方法进行检测，测得浓度分别为0.19、2.28、3.76mg/l(图8)，证明利用本发明提供的荧光探针误差复位较小，可靠性高。
50.2、rf@go荧光探针检测诺氟沙星的选择性
51.按上述方法取0.1mlgo分散液、0.2mlrf溶液置于pe管内，分别加入0.5mlnox溶液和等浓度其他常见的阴离子(f-、cl-、br-、i-、no
3-、no
2-、so
42-、co
32-、hpo
42-、po
43-)，加入去离子水使混合溶液总体积为2ml，在激发波长为450nm条件下测定540处的荧光强度，其中，rf、go、nox浓度分别为1.0μm、25.0mg/l、5.0mg/l。
52.结果分析：图9为rf@go在其他阴离子干扰下对nox的选择性，从图中可以看出，阴离子对nox的检测几乎没有影响，证明了本发明提供的荧光探针对nox的选择性良好，原因可能是由于go和诺氟沙星之间有更强的氢键联系，使得诺氟沙星的检测在复杂的结构中无需提前分离，降低了检测的难度。
53.3、rf@go荧光探针的检测性能
54.根据所得标准工作曲线，计算检测下限。rf@go荧光探针的荧光发射光谱被测量了10次，并计算了空白测量的标准偏差(12.3657)，根据标准曲线的斜率计算检测下限。
55.公式如下：lod＝3sd/k；
56.其中sd是空白测量的标准偏差，k是校准曲线的斜率。
57.经计算lod＝3sd/k＝12.3657
×3÷
1595.37672＝0.023252877，最终得出荧光探针检测nox含量的检出下限为23.3μg/l。
58.结论：本发明提供的rf@go荧光探针，其利用rf与nox在go表面竞争吸附，通过荧光强度的变化实现对nox浓度的测定，不仅能够在较低浓度下检测诺氟沙星，且对于不同的阴离子具有良好的抗干扰能力，选择性高，使得诺氟沙星检测无需从复杂的结构中提前分离，检测难度降低；
59.综上，本发明避免了传统方法的前处理复杂、仪器昂贵、需要耗费大量的试剂等不足，具有操作简便、快速高效、灵敏度高的优势。
60.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。