本发明属于纳米材料合成与检测，具体涉及聚集诱导发光（aie）型金纳米簇的合成及其应用。
背景技术：
1、金纳米簇通常由几个到几十个原子组成，核心尺寸小2 nm，由于尺寸降低至接近金属原子与纳米颗粒之间电子的费米波长，金属纳米簇出现强量子尺寸效应。金纳米簇的合成方法种类很多，其合成方法通常是选取蛋白、多肽、硫醇、聚合物等作为模板或保护剂，合成具有不同波长发射的荧光纳米簇。通常，金属纳米簇具有强荧光发射，荧光稳定且荧光波长可调节，可作为荧光探针用于环境分析和传感，包括对重金属、生物分子等分析检测及成像研究。[jin rc, zeng cj, zhou m, chen yx. atomically precise colloidalmetal nanoclusters and nanoparticles: fundamentals and opportunities.chemical reviews, 2016, 116(18): 10346-10413] 金纳米簇因其制备方法简单、斯托克斯位移大、水溶性好、毒性低、生物相容性好等优点，在污染物监测、催化、细胞成像和生物分析传感等领域引起了广泛关注。然而，绝大多数金纳米簇具有聚集诱导淬灭效应（acq），使金纳米簇由于配体运动的能量消除效应和自淬灭效应往往表现出较低的量子产率和稳定性，这极大地限制了金纳米簇在化学传感中的应用。因此，需要开发一种新的策略来提高金纳米簇的发光和稳定性。由于acq现象的普遍影响，有关聚集诱导发射（aie）型金纳米簇的研究仍然较少。aie理论为解决荧光金纳米簇聚集诱导淬灭的问题提供了新的途径，并且与具有acq特性的关闭式传感器相比，aie型开启式荧光传感器具有更高的灵敏度和选择性。 ［zhang, l.; xu, y.; xu, j.; zhang, h.; zhao, t.; jia, l. intelligentmulticolor nano-sensor based on nontoxic dual fluoroprobe and mofs forcolorful consecutive detection of hg2+ and cysteine. j. hazard. mater. 2022,430, 128478］。此外， “单传感器多分析物”的新概念即“多元检测探针”引起了研究人员的广泛兴趣。同时检测多个目标的能力可以缩短分析处理时间，降低成本。因此，设计一种基于aie理论的荧光探针，通过聚集态和分散态之间的转换，实现对不同分析物的无干扰同步检测，是极具创新性的。
2、有毒重金属（如汞，银等），可导致严重疾病和环境污染问题，对人类健康和生态系统构成严重威胁。特别是银离子（ag+）和汞离子（hg2+）分布广泛，易在食物链中积累并难以被生物降解，所以对其在自然水体中的浓度追踪具有重要意义。高剂量ag+暴露可引发多种疾病，如银中毒、皮肤和肝脏损伤、胃痛、生长缓慢、心脏肿大等［an, j.; chen, r.; chen,m. an ultrasensitive turn-on ratiometric fluorescent probes for detection ofag+ based on carbon dots/sio2 and gold nanoclusters. sens. actuators b chem.2021, 329, 129097 。汞被认为是更危险的，因为所有形式的汞，包括单质和离子汞最终被细菌活动转化为甲基汞，然后通过食物链在动物体内富集。hg2+可导致神经和免疫系统紊乱，肺、肾、脑的不可逆损伤，甚至可诱发肢端痛(粉红病)、hunter-russell综合征、水俣病等可怕的疾病［cheng, z.; wei, j.; gu, l.; zou, l.; wang, t.; chen, l.; li, y.;yang, y. dnazyme-based biosensors for mercury (ⅱ) detection: rationalconstruction, advances and perspectives. j. hazard. mater. 2022, 431,128606.］。鉴于此，有效监测和准确检测环境中ag+和hg2+的含量，防止重金属对人类健康造成影响具有重要意义。
3、过氧化氢（h2o2）是临床生物化学、能源、食品、制药、酶催化和环境监测的重要参与者。h2o2的异常积累会引起氧化应激和一些严重的疾病，如心血管疾病、糖尿病、癌症、帕金森和阿尔茨海默症［wang, s.; hu, z.; wei, q.; zhang, h.; tang, w.; sun, y.;duan, h.; dai, z.; liu, q.; zheng, x. diatomic active sites nanozymes:enhanced peroxidase-like activity for dopamine and intracellular h2o2detection. nano res. 2022, 15, 4266-4273.］。谷胱甘肽（gsh）是一种细胞内生物硫醇，在维持细胞内氧化还原状态、参与细胞内信号转导、免疫应答、基因转录调控等方面发挥关键作用［lu, w.; chen, s.; zhang, h.; qiu, j.; liu, x. fenc single atomnanozymes with dual enzyme-mimicking activities for colorimetric detection ofhydrogen peroxide and glutathione. j. materiomics 2022, 8(6), 1251-1259］由于肿瘤细胞中存在过量的gsh，因此，gsh同时被认为是一种肿瘤生物标志物［lu, w.; chen,s.; zhang, h.; qiu, j.; liu, x. fenc single atom nanozymes with dual enzyme-mimicking activities for colorimetric detection of hydrogen peroxide andglutathione. j. materiomics 2022, 8(6), 1251-1259.］。考虑到h2o2和gsh对人体健康监测方面的重要作用，且h2o2和gsh的细胞内失衡也与重大疾病密切相关，因此，血液中h2o2和gsh的定量分析对临床诊断至关重要。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供聚集诱导发光（aie）型金纳米簇的合成及其应用。
2、聚集诱导发光型金纳米簇nac/gsh-auncs，它是由下述方法制备的：
3、1）容器中加入2.43 mm氯金酸溶液20 ml，然后取0.01~0.05m nac溶液0-5ml和0.01m gsh溶液0-5ml，迅速依次加入所述氯金酸溶液中，室温下剧烈搅拌25~35min，混匀；所述的氯金酸：nac：gsh物质的量比为0.972：（1-5）：1；
4、2）在60~100℃下回流处理12~36 h，得到淡黄色的nac/gsh-auncs水溶液，冷却至室温；
5、所述的氯金酸：nac：gsh物质的量比为0.972：1：1；
6、所述的nac溶液添加量为0.01 m、5ml；
7、所述的gsh溶液添加量为5ml；
8、所述的回流温度为80℃，回流时间为24h。
9、所述的聚集诱导发光型金纳米簇nac/gsh-auncs在检测重金属离子及生物小分子方面的应用；
10、所述的重金属离子为ag+和/或hg2+；
11、所述的生物小分子为h2o2和/或gsh。
12、聚集诱导发光型金纳米簇nac/gsh-auncs检测ag+和hg2+的方法，它包括：
13、1）标准曲线的绘制：取nac/gsh-auncs溶液与等体积的超纯水混合，测定其空白组的荧光强度值i0，取nac/gsh-auncs溶液与不同已知浓度的ag+和hg2+溶液混合后，分别测定600 nm处的荧光强度值i并计算对应的相对荧光强度值i0/i，分别建立相对荧光强度值i0/i与ag+和hg2+浓度对应的标准曲线；
14、2）荧光检测ag+：取nac/gsh-auncs溶液与待测浓度的ag+溶液混合后，测定其荧光强度值i并计算其相对荧光强度值i0/i，根据以上标准曲线得到待测溶液中ag+的浓度；
15、3）荧光检测hg2+：取nac/gsh-auncs溶液与待测浓度的hg2+溶液混合后，测定其荧光强度值i并计算其相对荧光强度值i0/i，依据所述标准曲线得到待测溶液中hg2+的浓度；
16、所述步骤1）中不同已知浓度的ag+溶液中ag+的浓度范围为0-10 μm，待测溶液中ag+浓度的适用范围为0.001-0.100 μm；
17、所述步骤1）中不同已知浓度的hg2+溶液中hg2+的浓度在0-200 μm之间，待测溶液中hg2+浓度在0-100 μm；
18、所述nac/gsh-auncs溶液与ag+反应时间为0-6 min，优选反应时间为1 min；
19、所述nac/gsh-auncs溶液与hg2+溶液的反应时间为1-10 min，优选反应时间为1min；
20、所述的反应均在室温下进行。
21、所述的荧光检测条件为：激发波长380 nm, 激发狭缝和发射狭缝宽度3 nm，记录nac/gsh-auncs在600 nm处的发射强度对ag+和hg2+进行定量分析。
22、聚集诱导发光型金纳米簇nac/gsh-auncs检测h2o2的方法，它包括：
23、1）首先将30%的h2o2溶液稀释成不同浓度的h2o2溶液，然后将等量的不同浓度的h2o2溶液分别加入相同体积的空白溶液中，得到多组待测溶液：其中空白溶液含有超纯水、hac-naac缓冲溶液、tmb和所述的金纳米簇nac/gsh-auncs；
24、2）体系室温反应5 min后，分别测定待测溶液的吸光度；
25、3）标准曲线的绘制：以待测溶液中h2o2的加入浓度为横坐标，以测定的652 nm处的吸光度值为纵坐标，作线性拟合求出方程；
26、4）将含未知浓度的h2o2的待测溶液加入至空白溶液中，然后测定吸光度a，根据线性方程，代入吸光度值计算出待测溶液中h2o2的浓度；
27、所述hac-naac缓冲溶液的用量为250 μl、0.2 m；
28、所述tmb的用量为50 μl、0-2.00 mm；
29、所述金纳米簇nac/gsh-auncs的用量为0-200 μl，优选为75 μl。
30、步骤1）中所述不同浓度的h2o2溶液中，h2o2的浓度为0.03–1 mm，所述待测溶液中h2o2浓度为0.03-0.20 mm；
31、所述hac-naac缓冲溶液的ph为3.6-5.6，所述tmb由浓度为0-2.0 mm，所述nac/gsh-auncs由0-200 μl。
32、聚集诱导发光型金纳米簇nac/gsh-auncs检测gsh的方法，它包括：
33、1）首先配制成不同浓度的gsh溶液，然后将等体积的不同浓度的gsh溶液分别加入同体积的空白溶液中，得到多组待测溶液：其中空白溶液含有超纯水、hac-naac缓冲溶液、tmb、h2o2和所述的金纳米簇nac/gsh-auncs；
34、2）体系室温反应5 min后，分别测定待测溶液的吸光度；
35、3）标准曲线的绘制：以待测溶液中gsh的加入浓度为横坐标，以测定的652 nm处的吸光度值为纵坐标，作线性拟合求出方程；
36、4）将含未知浓度的gsh的待测溶液加入至空白溶液中，然后测定吸光度a，根据线性方程，代入吸光度值计算出待测溶液中gsh的浓度；
37、步骤1）所述hac-naac缓冲溶液的用量为250 μl，0.2 m；所述tmb的用量为50 μl，1.80 mm；所述h2o2的用量为50 μl，1.50 mm；
38、所述金纳米簇nac/gsh-auncs的用量为75 μl；
39、步骤1）中不同浓度的gsh溶液中gsh的浓度在0.50–60 μm之间，所述待测溶液中h2o2浓度为0.50-8.00 μm；
40、所述hac-naac缓冲溶液的ph为3.6-5.6，所述tmb浓度为0-2.0 mm，所述h2o2浓度为0-2.0 mm。
41、发明详述：
42、本发明的目的是提供一种聚集诱导发光型荧光金纳米簇及其合成方法。
43、本发明的另一目的是开发一种多元荧光-比色双模式探针，能检测并区分两种重金属离子ag+和hg2+的荧光探针；金纳米簇nac/gsh-auncs作为荧光探针可实现对ag+ 和hg2+进行多元检测。当nac/gsh-auncs探针溶液中加入一定浓度的ag+ 时会发生荧光的显著增强现象，相反，加入一定浓度的hg2+时会发生荧光的明显淬灭现象，以此，nac/gsh-auncs可实现ag+ 和hg2+的特异性检测，区分于其他金属离子，且检测的二种目标物ag+ 和hg2+现象完全相反，可区分识别。nac/gsh-auncs荧光探针的相对荧光强度（i0/i）与ag+ 和hg2+的浓度之间都具有良好的线性关系，通过线性关系方程对未知浓度样品进行定量分析。
44、同时具备纳米酶的性能，可通过催化h2o2氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（tmb）使其变蓝，达到比色检测h2o2的目的，并在此结果基础上借助还原机制检测血清中的gsh。对于h2o2和gsh的比色检测，金纳米簇固有的纳米酶活性起着重要作用。通过实验研究发现，nac/gsh-auncs具有过氧化物模拟酶活性，在h2o2存在的情况下，nac/gsh-auncs可以催化h2o2分解产生羟基自由基（∙oh），从而将无色的tmb底物氧化为可溶性的oxtmb，相应溶液颜色变为蓝色。向以上nac/gsh-auncs-tmb体系中加入不同浓度的h2o2，体系中生成的蓝色的oxtmb的量也会不同，由此根据比色法便可对h2o2的浓度实施定量检测。然而，gsh作为生物硫醇，具有强还原性，可以抑制显色过程，使得nac/gsh-auncs-tmb-h2o2体系褪色。随着不同浓度gsh的加入，体系的褪色程度也不同，以此通过比色法对gsh进行定性和定量检测。
45、本发明所述的聚集诱导发光型金纳米簇为n-乙酰-l-半胱氨酸和谷胱甘肽同时作为还原剂和稳定剂的金纳米簇。
46、聚集诱导发光型金纳米簇通过荧光模式可检测出水溶液中含有的微量的ag+和hg2+，通过比色模式可检测出水溶液样品中的h2o2和gsh浓度。
47、本发明的目的是提供能同时检测水溶液中ag+和hg2+及基于其类过氧化物酶活性连续比色检测h2o2和gsh的方法。
48、本发明具有如下有益效果：
49、1、本发明使用的nac和gsh作为双配体保护的聚集诱导发光型金纳米簇材料，经过优化和调控，可得到光学性能稳定的金纳米簇，且可作为多元检测探针实现对ag+、hg2+及生物分子h2o2、gsh的检测；
50、2、本发明利用银离子、汞离子与聚集诱导发光型金纳米簇之间的亲金属相互作用，来调节金纳米簇颗粒的团聚状态，从而改变其发射强度，银离子使得金纳米簇的荧光显著增强，汞离子使得金纳米簇的荧光明显降低；这种荧光增强和淬灭现象可用于银离子和汞离子的检测；
51、3、本发明构建的可用于ag+、hg2+、h2o2和gsh的双模式检测方法，选择性好、灵敏度高，检出限低，其中银离子的检出限可低至0.87 nm。