用于污染农田治理的含多价噬菌体土壤修复剂及制备方法与流程

本发明涉及土壤修复，具体是涉及用于污染农田治理的含多价噬菌体土壤修复剂及制备方法。

背景技术：

1、由于我国现阶段畜禽粪便安全化处理技术或环境管理仍存在一定的不足或缺失，许多城郊畜牧业养殖厂周边的农田土壤常成为残留和滋生人畜共患抗性细菌的高风险热点区域，严重影响人体健康和环境安全。因而，针对抗性细菌污染农田土壤，开展必要的微生物修复技术研究非常迫切。

2、噬菌体疗法为修复上述污染土壤提供了一种全新途径。细菌噬菌体是一类较为专属捕食活体宿主细菌而存活的生物体，在土壤、水、空气乃至人/动物体表或肠道内均广泛分布了大量噬菌体，据估算其总量达到1031数量级。噬菌体疗法是指通过分离、筛选、纯化和富集宿主细菌的专属噬菌体之后，向污染土壤中添加特定噬菌体菌液，定向侵染灭活抗性细菌的修复方式。国外学者已成功将噬菌体疗法应用在灭活辣椒、番茄、葡萄等果蔬的植物病害细菌或人畜共患抗性细菌的食品安全保障领域。然而，使用噬菌体疗法来削减土壤中抗性细菌的生物修复技术研究则相对较少。此外，现有研究常认为噬菌体仅限于侵染某一“种”类的宿主细菌，而近年来学术界发现：一些噬菌体经过适当的基因改造或人工加速其宽宿主谱的表达，可针对同一“属”内几种高度同源性的宿主细菌，甚至针对不同种属之间的宿主细菌也具有一定广谱性捕食区间。这为噬菌体疗法广泛应用提供了有效地理论支撑。

3、通过农药对污染土壤中病菌进行修复，在修复污染土壤后，土壤内会残留大量农药，成为新的土壤污染源，而且农药在清除病菌的同时，还会杀死大量土壤中有益的微生菌，破坏土壤微生物生态环境，因此需要一种安全可靠的土壤修复剂，且不会对土壤造成新的污染。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了用于污染农田治理的含多价噬菌体土壤修复剂及制备方法。

2、本发明的技术方案是：用于污染农田治理的含多价噬菌体土壤修复剂，所述修复剂由以下重量份的成分组成：10-15份多价噬菌体ysz1r原液和13-20份多价噬菌体ysz5k原液、7-9份脱氧核苷酸溶液、10-15份玉米芯渣、8-12份大豆秸秆根渣、11-13份动物油脂、4-7份琼脂块、4-9份葡萄糖、5-7份氨基酸溶液、7-13份无机盐溶液；

3、所述玉米芯渣的粒度为2-5mm，所述大豆秸秆根渣的粒度为1-2mm，所述葡萄糖粉的粒度为80-100μm，琼脂块的粒度为5-10cm。

4、进一步地，上述的用于污染农田治理的含多价噬菌体土壤修复剂的制备方法，包括以下步骤：

5、s1、制备多价噬菌体原液：

6、将多价噬菌体ysz1r与lb培养液按质量比1:1混合，得到混合液a，多价噬菌体ysz5k与lb培养液按质量比1:1混合，得到混合液b，将混合液a和混合液b分别在25-35℃下摇床培养8-12h后，得到多价噬菌体ysz1r原液和多价噬菌体ysz5k原液；

7、s2、制备营养液：

8、按上述重量份取动物油脂玉米芯渣、大豆秸秆根渣、琼脂块加入至混料器中，混料器混料温度为80-100℃，混料过程中按上述重量份的成分加入无机盐溶液，搅拌持续1-2h，待各物料混合均匀后，降低混料器温度至25-30℃，按上述重量份的成分加入葡糖糖、氨基酸液、脱氧核苷酸溶液，再持续搅拌30-40min后得到营养液；

9、s3、多价噬菌体的转移：

10、将多价噬菌体ysz1r原液和多价噬菌体ysz5k原液按上述重量份加入至步骤s2中所得营养液中，并进行搅拌，搅拌速度为80-100rpm，搅拌时长为1-1.5h，搅拌完成后，得到混合物，将混合物转移至摇床在25-30℃下培养10-24h后，摇床培养完成后取出分装封袋，得到土壤修复剂。

11、进一步地，上述的用于污染农田治理的含多价噬菌体土壤修复剂的制备方法，所述多价噬菌体ysz1r和多价噬菌体ysz5k的制备方法，包括以下步骤：

12、s1-1、获取噬菌体原液：

13、取土壤加入无菌水中，土壤与无菌水的质量比为1：10，在25-28℃下进行振荡培养5-6h，然后进行离心处理，离心处理完成后取上清液，再将上清液经过细菌过滤膜进行除菌处理，得到过滤液，分别取生长到对数期的大肠杆菌k12悬液和铜绿假单胞菌pao1悬液与所述过滤液按体积比1:9混合，然后分别加入至lb培养液中培养，培养过程中均加入氯化钙固体至溶液终浓度1mol/l，在36-37℃在摇床培养12-15h后，分别经过离心处理，离心后分别取上清液进行滤膜除菌处理，得到含有噬菌体ysz1r的原液和含有噬菌体ysz5k的原液；

14、s1-2、噬菌体纯化：

15、将含有噬菌体ysz1r的原液与对数期的大肠杆菌k12悬液按体积比1:1混合，含有噬菌体ysz5k的原液和铜绿假单胞菌pao1悬液按体积比1:1混合，混合完成后分别在室温静置15-20min，取上清液得到噬菌体ysz1r混合液和噬菌体ysz5k混合液，再分别将噬菌体ysz1r混合液和噬菌体ysz5k混合液平铺倒入lb固体平板上，在36-37℃培养10-12h，分别挑取单个边缘清晰透明的噬菌斑得到噬菌体ysz1r菌斑和噬菌体ysz5k菌斑，将噬菌体ysz1r菌斑接入含有大肠杆菌k12的lb培养液体中，将噬菌体ysz1r菌斑接入含铜绿假单胞菌pao1的lb培养液体中，在36-37℃下振荡培养8-9h；然后进行离心处理，再进行滤膜除菌处理后，获得纯化的噬菌体ysz1r和纯化的噬菌体ysz5k；

16、s1-3、获取多价噬菌体：

17、纯化的噬菌体ysz1r与大肠杆菌k12悬液按体积比3:1混合，得到噬菌体ysz1r混合液，纯化的噬菌体ysz5k与铜绿假单胞菌pao1悬液按体积比3:1混合，得到噬菌体ysz5k混合液，将噬菌体ysz1r混合液和噬菌体ysz5k混合液分别加入lb培养液中，噬菌体ysz1r混合液和噬菌体ysz5k混合液分别与lb培养液的体积比为10:1，在36-37℃，振荡培养96h，获得多价噬菌体ysz1r和ysz5k。

18、进一步地，所述动物油脂是将动物脂肪进行破碎，破碎后将脂肪残渣在100-110℃加热30-40min，加热后经过滤网过滤，过滤后在80-90℃下进行超声波杀菌，超声波杀菌完成后冷却至室温，得到动物油脂。

19、说明：动物油脂里面含有噬菌体复制需要的脂肪等营养物质，有助于噬菌体的繁殖。

20、进一步地，所述无机盐溶液由以下质量百分比的成分组成：0.5-1％钾、1-3％钠、0.2-1.2％钙、0.3-0.8％铁、0.2-0.5％锌、0.1-0.5％铜、0.1-0.3％磷、0.1-0.2％硫、1-1.3％碘，余量为无菌水。

21、说明：无机盐溶液提供噬菌体的微量元素，调节噬菌体内外渗透压，促进噬菌体的繁殖。

22、进一步地，所述大豆秸秆根渣的制备方法为：将新鲜大豆秸秆根部剪下放入破碎机中进行破碎，破碎速度为100-180r/min，破碎时长为2-3h，破碎完成后先经过1mm筛网过滤，取筛上物，再经过2mm筛网过滤，取筛下物，得到破碎后得到大豆秸秆根渣。

23、说明：含有根瘤菌的大豆根部秸秆含有大量氮元素，为噬菌体的繁殖提供氮元素，且噬菌体吞噬根瘤菌有助于噬菌体的繁殖。

24、进一步地，所述脱氧核苷酸溶液由以下质量百分比的成分组成：1-3％脱氧核糖胞嘧啶核苷酸、4-5％脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、1-3％脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸、1-3％脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、2-4％脱氧核苷酸钠、余量无菌水。

25、说明：脱氧核苷酸有助于噬菌体复制和繁殖，有助于噬菌体遗传物质的复制。

26、进一步地，所述氨基酸溶液由以下摩尔百分比的成分组成：甘氨酸7-9％、丙氨酸3-4％、缬氨酸1-2％、亮氨酸0.6-0.8％、异亮氨酸0.5-0.9％、苯丙氨酸0.5-1.0％、蛋氨酸0.5-0.6％、色氨酸0.3-0.5％、脯氨酸0.8-1％、酪氨酸1-3％、胱氨酸0.1-0.2％、丝氨酸15-25％、苏氨酸7-8％、天门冬氨酸10-18％、谷氨酸1-3％、组氨酸1-2％、赖氨酸0.5-0.8％、精氨酸2-3％，余量为无菌水。

27、说明：氨基酸溶液有助于噬菌体的蛋白质外壳的合成，是噬菌体复制繁殖的必要元素。

28、进一步地，所述细菌过滤膜的膜孔径为0.22-0.35μm，步骤s1-1中所述摇床培养时摇床的电机转速为100-150rpm，步骤s1-1和步骤s1-2中的振荡培养时电机的转速为150-200rpm，步骤s1-3中的振荡培养时电机的200-250rpm。

29、说明：由于噬菌体比细菌更小，因此通过滤膜过滤，将细菌过滤，只留噬菌体，作为筛选噬菌体的方式，同时去除其他杂菌。

30、进一步地，所述离心处理的离心速度为8000-10000rpm，离心时长为5-8min。

31、说明：上述离心处理的离心速度能够高效进行离心处理，缩短了离心处理得时长，提高了生产效率。

32、本发明的有益效果是：

33、(1)本发明相比采用化学的方式降低土壤病菌的方式，本发明采用多价噬菌体，通过噬菌体对病菌进行消除，大量的噬菌体在杀死病菌后，会自然消亡，不会对土壤造成新的污染。

34、(2)本发明的土壤修复剂能够降低土壤中的有害病菌，提高农田种植物的产量，本发明土壤修复剂降低土壤中有害病菌的方式环保，适用于大规模推广。