一种比率荧光探针及其制备方法和应用

本发明涉及荧光探针，具体涉及一种比率荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、生物胺的生物活性影响着人类健康，是维持人体正常生理活动所不可缺少的物质，它可调节体温、血压、消化、影响细胞等组织生理结构的形成。在生物胺中，酪胺的生理毒性仅次于组胺。人体中的酪胺通过单胺氧化酶途径代谢，而单胺氧化酶抑制剂常被用于治疗抑郁症、帕金森症。而当在接受单胺氧化酶抑制剂治疗的人群在摄入含酪胺食品时，由于酪胺代谢能力下降，而面临更高的酪胺中毒风险。酪胺中毒又被称为“奶酪反应”，表现为偏头痛、心率加快、恶心、呕吐、呼吸紊乱和血糖升高。酪胺对人体健康和食品品质造成负面影响，严格控制食物生产和流通过程中酪胺的含量具有很高的社会价值和经济价值。

2、因此，迫切需要能够建立定量和直观检测酪胺的荧光检测方法，这对保证食品安全和饮食健康至关重要。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供一种比率荧光探针及其制备方法和应用。该比率荧光探针可实时/现场目视定量检测酪胺，灵敏度高，检测限为1.023μm，检测过程便携、快速且成本低廉。

2、为解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种比率荧光探针，该比率荧光探针由异硫氰酸盐染料修饰半导体聚合物量子点(pdots)制备得到纳米颗粒，其在530nm处和581nm处分别具有较强的荧光发射峰；其中，异硫氰酸盐染料为异硫氰酸罗丹明b；半导体聚合物量子点由聚苯乙烯马来酸酐共聚物和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]构成。

4、本发明中异硫氰酸罗丹明b(rbi)作为异硫氰酸盐修饰由聚苯乙烯马来酸酐共聚物(psma)和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)](pf8bt)构成的半导体聚合物量子点得到pf8bt-rbi比率荧光探针。异硫氰酸罗丹明b和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的荧光作为酪胺的荧光检测信号，rbi作为能量受体，pf8bt作为能量供体，基于荧光共振能量转移(fret)机理构建pf8bt-rbi比率荧光探针，pf8bt能量供体吸收能量后转移到rbi能量受体，rbi能量受体发射荧光。根据待检测物酪胺的浓度变化，使得pf8bt能量供体荧光和rbi能量受体荧光强度发生变化，再通过pf8bt、rbi这两者的荧光强度比率与被检测物的浓度呈现线性关系，从而实现待测物质中酪胺的浓度的定量检测。同时，pf8bt和rbi荧光强度的增减导致荧光探针荧光颜色的变化，含酪胺的物质加入pf8bt-rbi比率荧光探针后，溶液在350nm紫外灯激发下会由橙黄色变为黄绿色，实现了可视化检测酪胺。本发明的比率荧光探针对酪胺的检测限为1.023μm，低于酪胺残留允许限，可以准确检测浓度范围在0-250μm的酪胺；可实时/现场目视定量检测酪胺，使检测过程便携、快速且成本低廉，满足水产品新鲜度和安全性的检测需求。

5、第二方面，本发明还提供上述比率荧光探针的制备方法，包括：

6、步骤1：将异硫氰酸罗丹明b的二甲基亚砜溶液，聚苯乙烯马来酸酐共聚物的四氢呋喃溶液和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的四氢呋喃溶液混合，并用四氢呋喃定容，得到溶液a；

7、步骤2：在0℃冰水浴和超声的条件下，将所述溶液a一次性注入超纯水中，持续超声1-2min，再向其中通入气体吹扫同时加热升温去除四氢呋喃后，收集剩余液体用超纯水定容，过滤，所得滤液即为比率荧光探针；

8、步骤1中所述溶液a中异硫氰酸罗丹明b、聚苯乙烯马来酸酐共聚物和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的质量比为0.005-0.05：0.1-1：1；

9、所述步骤2中溶液a与超纯水体积比为2-5：10；

10、所述步骤2中在通入气体吹扫同时加热升温去除四氢呋喃时的温度为95-110℃，保温时间为25-30min；

11、所述比率荧光探针的制备方法所制的比率荧光探针的粒径为10-200nm。

12、本发明使用pdots作为比率荧光传感器的纳米结构，通过再沉淀法将荧光染料嵌入pdots中。其中异硫氰酸罗丹明b、聚苯乙烯马来酸酐共聚物和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的结构如式(i)所示

13、

14、上述三种物质均可商业购买得到，省略了复杂的制备过程。

15、上述步骤1中硫氰酸罗丹明b的二甲基亚砜溶液，聚苯乙烯马来酸酐共聚物和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的四氢呋喃溶液无特定加入顺序，能够将各物料达到混合均匀的状态即可。

16、上述步骤2中，将溶液a一次性注入超纯水中，侧重一次性无停顿快速的注入，所述快速是指在实验者的条件和设备能力范围内的最快速度。

17、示例性地，根据实验习惯，本发明提供一种比率荧光探针的制备方法，包括：

18、步骤1：将异硫氰酸罗丹明b的二甲基亚砜溶液和聚苯乙烯马来酸酐共聚物的四氢呋喃溶液，依次加入聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的四氢呋喃溶液中混合，并用四氢呋喃定容，得到溶液a；

19、步骤2：在0℃冰水浴和超声的条件下，将所述溶液a一次性注入超纯水中，持续超声1-2min，再向其中通入气体吹扫同时加热升温去除四氢呋喃后，收集剩余液体用超纯水定容，过滤，所得滤液即为比率荧光探针；

20、步骤1中所述溶液a中异硫氰酸罗丹明b、聚苯乙烯马来酸酐共聚物和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的质量比为0.005-0.05：0.1-1：1；

21、所述步骤2中溶液a与超纯水体积比为2-5：10；

22、所述步骤2中在通入气体吹扫同时加热升温去除四氢呋喃时的温度为95-110℃，保温时间为25-30min。

23、本发明的异硫氰酸罗丹明b(rbi)作为能量受体，所产生的荧光发射峰位于581±5nm，聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)](pf8bt)作为能量供体，所产生的荧光发射峰位于530±5nm。基于荧光共振能量转移(fret)机理构建pf8bt-rbi比率荧光探针，pf8bt能量供体吸收能量后转移到rbi能量受体，rbi能量受体发射荧光。根据待检测物酪胺的浓度变化，使得pf8bt供体荧光和rbi受体荧光强度发生变化，再通过pf8bt、rbi这两者的荧光强度比率与被检测物的浓度呈现线性关系，从而实现待测物质中酪胺的浓度的定量检测。

24、优选地，所述异硫氰酸罗丹明b的二甲基亚砜溶液浓度为1-2mg/ml；所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物的四氢呋喃溶液浓度为1-2mg/ml；所述聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的四氢呋喃溶液浓度为1-2mg/ml。

25、优选地，所述溶液a中异硫氰酸罗丹明b、聚苯乙烯马来酸酐共聚物和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-alt-(苯并[2,1,3]噻二唑-4,8-二基)]的质量比为0.02：0.8：1。

26、过多的异硫氰酸罗丹明b会增加溶液中的游离荧光染料，从而降低有效反应；而过少的异硫氰酸罗丹明b会降低异硫氰酸罗丹明b的荧光强度，从而降低仪器误差的兼容性而降低检测结果的准确性。

27、优选地，所述收集剩余液体用超纯水定容至10ml。

28、优选地，步骤2中气体为氮气、氩气或者氦气中的任意一种或其组合。

29、优选地，所述过滤为以0.22μm水相滤头过滤。

30、本发明中，溶剂中的四氢呋喃被挥发完全，剩余的二甲基亚砜的含量≤2‰，不会影响水相滤头的过滤性能，满足使用要求。

31、第三方面，本发明还提供上述的比率荧光探针或上述比率荧光探针的制备方法得到的比率荧光探针用于酪胺检测中的应用。

32、第四方面，本发明还提供上述比率荧光探针检测酪胺的方法，包括：将所述比率荧光探针与待测酪胺按比例混合，制成反应体系，在25-30℃下反应10-20min后，采用荧光光谱仪进行光谱检测，通过比率荧光探针在30nm处和581nm处的荧光强度变化，实现对酪胺的检测。

33、优选地，反应体系制备方法包括：加入50μl比率荧光探针、30μl待测酪胺和适量的缓冲液，制成1ml反应体系；所述缓冲液为pbs缓冲液，ph 7-7.5。

34、优选地，采用荧光光谱仪进行光谱检测，记录荧光发射峰值在530nm的荧光强度i530，581nm的荧光强度i581，计算i530/i581的比值得到荧光发射峰值比率数值，利用荧光发射峰值比率数值与酪胺浓度间的函数关系得到校正曲线，利用所述校正曲线计算得到待测酪胺的浓度。

35、本发明的比率荧光探针，在无酪胺存在的条件下，pf8bt能量供体被激发后将能量传递给rbi能量受体，rbi能量受体发射荧光；在酪胺存在的条件下，rbi能量受体的异硫氰酸基团与氨基发生加成反应，并进一步导致rbi发生分子内电荷转移，从而猝灭了rbi的荧光，pf8bt能量供体被激发时，pf8bt能量供体发射荧光。根据的酪胺浓度不同，pf8bt和rbi的两个发射波长的荧光强度发生变化，实现比率荧光检测酪胺的含量。

36、具体解释为：pf8bt能量供体和rbi能量受体对空间位置的改变非常灵敏。

37、当pf8bt能量供体和rbi能量受体足够接近时，由于pf8bt能量供体的荧光发射光谱和rbi能量受体的紫外吸收光谱发生了重叠，pf8bt能量供体的发色基团会将能量高效率地转移至rbi能量受体的发色基团上，导致pf8bt能量供体的发射荧光被减弱或消失，而此时，检测到rbi能量受体在581nm的荧光强度。

38、当pf8bt能量供体和rbi能量受体的相对空间位置被改变后，例如，比率荧光探针中加入待测物质酪胺后，酪胺的氨基与rbi的异硫氰酸基团发生加成反应，使rbi发生荧光猝灭，导致pf8bt能量供体和rbi能量受体的相对空间位置发生改变而无法发生荧光共振能量转移，此时检测到pf8bt能量受体在530nm的荧光。根据待检测物酪胺的浓度变化，使得pf8bt供体荧光和rbi受体荧光强度发生变化，再通过pf8bt、rbi这两者的荧光强度比率与被检测物的浓度呈现线性关系，从而实现待测物质中酪胺的浓度的检测。

39、优选地，所述荧光测试的条件包括：荧光激发波长为460-485nm，荧光发射光谱观察范围为520-600nm。

40、第五方面，本发明还提供上述比率荧光探针检测酪胺的方法用于检测养殖水、水产品、肉类中的酪胺的应用。