一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法和用途

本发明涉及荧光探针测定分析，具体为一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法和用途。

背景技术：

1、四环素类抗生素(tcs)是20世纪40年代发现的一类广谱抗生素，其中包括金霉素(ctc)、土霉素(otc)和四环素(tc)等，它们通过阻止氨酰基-trna与核糖体受体位点的连接从而抑制蛋白质的合成，主要对阻止氨酰基-trna与核糖体革兰氏阳性和革兰氏性细菌、衣原体、支原体和立克次体等非典型生物以及原生动物的寄生虫具有活性。由于其有效性高且成本低廉，在很早以前已经广泛地应用于杀菌剂、医学和动物饲料添加剂。但如果人类长期使用含有抗生素的食物，抗生素可在体内蓄积，产生较强的毒副作用和耐药菌，导致抗生素类药物效果变差甚至无效，使病菌趁虚而入，引发疾病。此外，如果饲料中添加四环素类抗生素，则随畜禽粪便污染土壤与河流，严重危害环境和食品安全。因此，建立快速、可靠有效的抗生素检测方法，对食品及饲料安全检测、环境保护和人体健康，均有积极意义。

2、现有技术中，目前食品中最常见tcs(ctc、otc和tc)的测定方法主要由高效液相色谱法(hplc)、紫外-可见分光光度法(uv-vis)、液相色谱-质谱法(lc/ms)、酶联免疫吸附法等，uv-vis操作简便但灵敏度较低；hplc和lc/ms灵敏度高但设备昂贵，操作成本较高；酶联免疫吸附法简便易行但存在交叉反应、假阳性问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法和用途，以解决上述背景技术中提出的设备昂贵，操作成本较高；酶联免疫吸附法简便易行但存在交叉反应、假阳性问题的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

3、步骤一：所述准确称取l-脯氨酸粉末，用双蒸水溶解定容，配制成100μl储备液；

4、步骤二：所述准确称取海藻酸钠粉末，用双蒸水溶解定容，配制成50μl储备液；

5、步骤三：所述准确称取氯金酸粉末，用双蒸水溶解定容，配制成800μl储备液；

6、步骤四：所述将100μl储备液、50μl储备液和800μl储备液依次混合，水浴孵化后取出，1000rpm离心10min后取上清液，获得的pro-sa-auncs。

7、优选的，所述步骤四中，反应体系使用haucl4和pro储备液体积配比7.5：1～9：1均有荧光表现。

8、优选的，所述步骤四中，5～12.5mmol/l海藻酸钠储备液均可稳定该探针，提高荧光强度。

9、优选的，所述步骤四中，探针合成孵化温度在85～100℃合成该探针，合成之后的探针保存环境为低温冰箱、避光保存。

10、优选的，所述荧光探针分别用来检测ctc、otc和tc三种四环素类抗生素；

11、可应用于在实际样本中三种tcs检测，具体步骤如下：

12、(1)、含抗生素液体样本在固相萃取小组中富集抗生素；

13、(2)、将(1)所得溶液中加入pro-sa-auncs；

14、(3)、将(2)所得溶液避光恒温孵育后，将反应体系转移用于荧光光谱仪检测。

15、优选的，所述(1)中所述具体流程为：牛奶样本上样于固相萃取小柱上，用缓冲液洗脱，该液体样品取样量为2～8ml，使用的缓冲液为ph＝3～5的磷酸盐缓冲液，用量为1～2ml。

16、优选的，所述(2)中pro-sa-auncs的用量为300～800μl。

17、优选的，所述(3)中恒温温度为25℃，孵育时间为7min，荧光最佳激发波长为322nm。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

19、1、本发明中以脯氨酸和海藻酸钠为还原剂和稳定剂，制备pro-sa-auncs，相对于现在的技术，该方法具有更好操作步骤，而没有复杂的分离、固定化或功能化过程。因此，所述的荧光探针具有操作简便、分析成本低、检测时间短、灵敏度高和选择性好等优点，能够应用于食品、药品中金霉素(ctc)、土霉素(otc)和四环素(tc)等四环素类抗生素(tcs)快速检测，在食品、药品生化测定领域有较好的应用前景，具广泛推广潜力。

20、2、本发明中运用荧光光度法，具有操作简便、分析成本低、检测时间短、灵敏度高和选择性好等优点。

技术特征：

1.一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤四中，反应体系使用haucl4和pro储备液体积配比7.5：1～9：1均有荧光表现。

3.根据权利要求1所述的一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤四中，5～12.5mmol/l海藻酸钠储备液均可稳定该探针，提高荧光强度。

4.根据权利要求3所述的一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤四中，探针合成孵化温度在85～100℃合成该探针，合成之后的探针保存环境为低温冰箱、避光保存。

5.一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的用途，适用于权利要求1-4任意一项所述的一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述荧光探针分别用来检测ctc、otc和tc三种四环素类抗生素；

6.根据权利要求5所述的一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的用途，其特征在于：所述(1)中所述具体流程为：牛奶样本上样于固相萃取小柱上，用缓冲液洗脱，该液体样品取样量为2～8ml，使用的缓冲液为ph＝3～5的磷酸盐缓冲液，用量为1～2ml。

7.根据权利要求5所述的一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的用途，其特征在于：所述(2)中pro-sa-auncs的用量为300～800μl。

8.根据权利要求5所述的一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的用途，其特征在于：所述(3)中恒温温度为25℃，孵育时间为7min，荧光最佳激发波长为322nm。

技术总结
本发明公开了一种检测三种四环素类抗生素的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：所述步骤一：材料准备，材料包括珠芽位置位于叶柄底端的半夏和加入的蔗糖合酶PtSUS6,所述步骤二：加入蔗糖合酶PtSUS6，通过重组的方式将编码蔗糖合酶PtSUS6的多核苷酸引入半夏中,所述步骤三：提供携带表达载体的农杆菌和表达载体含有蔗糖合酶PtSUS6的多核苷酸,所述步骤四：利用农杆菌将编码蔗糖合酶PtSUS6的多核苷酸转入半夏。本发明中通过半夏蔗糖合酶基因的遗传操作，显著促进株芽的发育和萌发，减缓半夏逆境倒苗，延长半夏光合作用时间而达到增产的目的，有助于耐逆境半夏种植资源的培育，提升产业价值。

技术研发人员：李少光,姚宏,陈冰,李志军,陈艳,韩胜男,罗秋
受保护的技术使用者：福建医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24