一种细胞或类器官芯片及其制备方法与应用

本发明涉及细胞或组织培养，尤其涉及一种细胞或类器官芯片及其制备方法与应用。

背景技术：

1、随着3d打印技术的不断发展、应用和推广，使用和体验的人越来越多，应用的领域也是越来越广泛了。如何将3d打印应用于细胞培养也已成为又一个热点，例如，骨折、骨损、骨肿瘤等骨科医疗科学的骨细胞研究，皮组织细胞、口腔细胞、内脏各器官细胞等的培养，越来越多的科研人员都在研究，也报道或上市了一些产品。

2、传统的细胞培养装置、设备或支架都属于二维的平面培养模式，虽然在一定程度上可以满足很大一部分的产业需求，但也存在一些不足或缺陷，比如细胞在培养过程中增殖后细胞出现拥挤，部分无黏附着床空间，暴露在培养液表面等。三维培养支架的出现很好地解决了二维培养所存在的不足与缺陷，三维支架丰富的网络空间结构可以给细胞的增殖和黏附提供更大的附着比表面积，提高细胞的产量和质量，减少细胞之间彼此的接触和抑制，具有模拟人体或动物体的三维结构生长环境，有利于细胞与细胞之间及细胞与细胞外质之间的交互作用及代谢产物的排除，有利于细胞的分化及原属性功能的表达。

3、目前大部分的三维培养支架以聚己内酯等为原料，采用凝胶点胶或打印成型等得到三维细胞培养支架。由于其疏水性，不利于细胞的附着贴壁。故此，亟待开发一种具有良好的细胞亲和性、粘附性的三维细胞培养支架来满足生产发展的需求。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种细胞或类器官芯片及其制备方法和应用，其解决了现有技术中存在的细胞或类器官芯片粘附性差的问题。

2、本发明一方面提供了一种细胞或类器官芯片，具体的是一种高粘附性细胞或类器官芯片，其表面存在微槽、以及高粘附性分子层。本发明另一方面提供了一种细胞或类器官芯片的制备方法，具体的是一种高粘附性细胞或类器官芯片的制备方法。

3、具体的，本发明提供如下技术方案：

4、一种细胞或类器官芯片的制备方法，具体的是一种高粘附性细胞或类器官芯片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

5、s1：制备生物活性墨水，所述生物活性墨水包括分散介质和生物单元；

6、s2：在基底表面制造微槽，得到预处理的基底；

7、s3：将预处理的基底进行表面修饰，得到表面修饰的基底；

8、s4：将所述生物活性墨水经3d打印方法打印到表面修饰的基底上，得到所述细胞或类器官芯片。

9、在本发明一实施方式中，所述分散介质至少包括水凝胶交联前体和水凝胶粘附增强剂。

10、在本发明一实施方式中，所述分散介质中，水凝胶交联前体和水凝胶粘附增强剂的质量比为(1~10):0.5；示例性地，为1:0.5、2:0.5、3:0.5、4:0.5、5:0.5、6:0.5、7:0.5、8:0.5、9:0.5、10:0.5或介于其中的某一具体比例值。

11、在本发明一实施方式中，所述分散介质至少包括水凝胶交联前体，任选添加或不添加交联引发剂。当添加交联引发剂时，在形成生物墨水时所述水凝胶交联前体能够与对应的交联引发剂作用形成水凝胶。

12、在本发明一实施方式中，所述交联引发剂选自光引发剂、离子引发剂中的一种或几种。

13、在本发明一实施方式中，所述光引发剂包括但不限于苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(简称lap)、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（i2959）、2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯（tpo-l）中的至少一种。

14、在本发明一实施方式中，所述离子引发剂包括但不限于氯化钙溶液、氯化钡溶液中的至少一种。

15、在本发明一实施方式中，所述水凝胶交联前体选自光敏性水凝胶前体、离子型水凝胶前体、热固化水凝胶前体中的一种或几种。优选地，所述水凝胶交联前体为光敏性水凝胶前体和/或离子型水凝胶前体。

16、在本发明一实施方式中，所述热固化水凝胶前体包括但不限于基质胶、聚醚f127二丙烯酸酯中的至少一种。

17、在本发明一实施方式中，所述水凝胶交联前体包括光敏性水凝胶前体、离子型水凝胶前体、基质胶中的一种或几种。

18、在本发明一实施方式中，所述水凝胶交联前体包括基质胶，以及任选的光敏性水凝胶前体和/或离子型水凝胶前体。

19、在本发明一实施方式中，所述水凝胶交联前体包括基质胶、光敏性水凝胶前体和离子型水凝胶前体。

20、根据本发明的实施方案，按质量百分比，所述水凝胶交联前体中，所述基质胶的含量≤50%，优选所述基质胶的含量≤40%，进一步优选地，所述基质胶的含量≤30%，例如为35%、25%、20%、18%。

21、作为一个实例地，按质量百分比，所述水凝胶交联前体中，所述基质胶的含量为20%，光敏性水凝胶前体和/或离子型水凝胶前体的含量为80%。

22、在本发明一实施方式中，所述基质胶包括matrigel、cultrex bme、geltrex中的一种或几种。

23、在本发明一实施方式中，所述水凝胶交联前体包括光敏性水凝胶前体和离子型水凝胶前体，所述光敏性水凝胶前体和离子型水凝胶前体的质量比为1:(0~5)，优选所述光敏性水凝胶前体和离子型水凝胶前体的质量比为1:(0~3)，例如为1:1。

24、在本发明一实施方式中，所述光敏性水凝胶前体包括但不限于甲基丙烯酰化海藻酸钠（algma）、甲基丙烯酰化透明质酸（hama）、甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖、甲基丙烯酰化聚赖氨酸（plma）、甲基丙烯酰化明胶（gm）、甲基丙烯酰化丝素蛋白（silma）、甲基丙烯酰化葡聚糖（dexma）、甲基丙烯酰化硫酸软骨素（chsma）、聚醚f127二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、四臂聚乙二醇丙烯酸酯、以及其他丙烯酰化的材料（如丙烯酰化rgd肽、丙烯酰化聚乙二醇nhs酯）。

25、在本发明一实施方式中，所述离子型水凝胶前体包括但不限于羧甲基纤维素、海藻酸钠、羧甲基壳聚糖。

26、在本发明一实施方式中，所述水凝胶交联前体为光敏性水凝胶前体和离子型水凝胶前体的组合物。研究发现，当选择所述组合物作为水凝胶交联前体时，光敏性水凝胶前体和离子型水凝胶前体可以通过调控光固化时间来调控墨水的粘度，进而控制细胞的生长状态；由于离子交联的键合强度要强于光交联的键合强度，加入离子型水凝胶前体可以进一步强化水凝胶的空间骨架强度，提高水凝胶的稳定性，拓宽细胞生长环境的可调控范围。另外，光固化水凝胶前体中的甲基丙烯酰化海藻酸钠、甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸，既具有光固化性能，也具有离子固化性能，在使用时，即使不加入离子型水凝胶前体，也可以先进行光固化调控墨水的粘度，再进行离子固化加强凝胶的稳定性，有效调控细胞的生长环境，也就是说，当选择甲基丙烯酰化海藻酸钠、甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸作为光敏性水凝胶前体时，即使仅加入光敏性水凝胶前体，也可以达到与同时加入离子型水凝胶前体相同的效果。

27、在本发明一实施方式中，当所述水凝胶交联前体包括光敏性水凝胶前体时，所述分散介质包括光引发剂。

28、在本发明一实施方式中，所述光敏性水凝胶前体与光引发剂的质量比为(2~15):1；优选所述光敏性水凝胶前体与光引发剂的质量比为(3~12):1；例如为4:1、7:1、9:1、10:1、12:1。

29、在本发明一实施方式中，所述分散介质还至少包括水凝胶粘附增强剂，所述水凝胶粘附增强剂用于增强水凝胶对基底的粘附性。具体的，所述水凝胶粘附增强剂包括但不限于聚多巴胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙烯醇等中的至少一种。

30、作为一个实例，所述分散介质至少包括羧甲基纤维素和聚多巴胺。

31、作为一个实例，所述分散介质至少包括海藻酸盐、羧甲基纤维素和聚多巴胺。

32、作为一个实例，所述分散介质至少包括聚多巴胺、光敏性水凝胶前体和光引发剂。

33、作为一个实例，所述分散介质至少包括海藻酸盐、羧甲基纤维素、聚多巴胺和壳聚糖。

34、在本发明一实施方式中，在生物活性墨水中，所述分散介质中至少包括海藻酸盐、羧甲基纤维素、聚多巴胺、光敏性水凝胶前体和引发剂。

35、在本发明一具体实施方式中，所述海藻酸盐、羧甲基纤维素、聚多巴胺、光敏性水凝胶前体和引发剂的质量比为(1~5):1:0.5:(1~5):(0.05~0.25)。

36、示例性地，所述质量比中，海藻酸盐的配比为1~5中的任一点值，具体例如1、2、3、4或5。

37、示例性地，所述质量比中，光敏性水凝胶前体的配比为1~5中的任一点值，具体例如1、2、3、4或5。

38、示例性地，所述质量比中，引发剂的配比为0.05~0.25中的任一点值，具体例如0.05、0.10、0.15、0.20或0.25。

39、在本发明一具体实施方式中，所述光敏性水凝胶前体包括甲基丙烯酰化海藻酸钠。

40、在本发明一具体实施方式中，所述引发剂包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)。

41、在本发明一具体实施方式中，所述分散介质中还包括层粘蛋白、rgd多肽、细胞因子、抗生素、小分子化合物、纤维素酶、培养基中的一种或几种。

42、在本发明一具体实施方式中，所述层粘蛋白和/或rgd多肽的浓度为0.1-1mg/ml。

43、在本发明进一步的具体实施方式中，所述细胞因子包括但不限于：r-spondin细胞生长因子、mnoggin细胞生长因子、egf细胞生长因子、wnt3a细胞生长因子中的至少一种。

44、在本发明一具体实施方式中，所述细胞因子的浓度为50-100 ng/ml。

45、在本发明进一步的具体实施方式中，所述抗生素包括但不限于primocin™原代细胞抗生素。

46、在本发明一具体实施方式中，所述抗生素的浓度为50-100μg/ ml。

47、在本发明进一步的具体实施方式中，所述小分子化合物包括但不限于sb202190、gastrin i、a83-01、烟酰胺、prostaglandin e2、及n-乙酰-l-半胱氨酸中的至少一种。

48、在本发明一具体实施方式中，所述小分子化合物的浓度为10 nm-10 mm。

49、在本发明进一步的具体实施方式中，所述纤维素酶包括但不限于内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。

50、在本发明一具体实施方式中，所述纤维素酶的浓度为0.01-0.1%。

51、在本发明进一步的具体实施方式中，所述培养基包括但不限于dmem/f12培养基。

52、在本发明一实施方式中，所述生物单元包括细胞、组织或类器官。

53、在本发明一具体实施方式中，所述生物单元中细胞的浓度为104-106个/ml。

54、在本发明一具体实施方式中，所述细胞包含但不限于正常原代细胞、肿瘤原代细胞、细胞系、诱导多能干细胞等中的至少一种。

55、在本发明一具体实施方式中，所述组织包含但不限于细胞团、小块生物组织、细胞质基质等中的一种或多种。具体的，所述生物组织包含但不限于上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织中的一种或多种。

56、在本发明一具体实施方式中，所述类器官包括但不限于包括小肠类器官、胃类器官、结肠类器官、肺类器官、膀胱类器官、大脑类器官、肝脏类器官、胰腺类器官、肾脏类器官、卵巢类器官、食道类器官、心脏类器官中的一种或多种。

57、在本发明一实施方式中，步骤s2中，所述在基底表面制造微槽(也称微小沟槽)的方法包括光刻法、划片法、激光刻蚀法。

58、在本发明一具体实施方式中，所述微槽的宽度为10-200微米，优选为20-50微米；深度为10-100微米，优选为50微米。

59、在本发明一具体实施方式中，所述微槽形成的图案包括平行直线形、波浪形、十字交叉形，优选为平行直线形。平行直线形中，相邻微槽之间的距离为40-2000微米，优选为100-200微米。

60、在本发明一具体实施方式中，所述微槽横截面形状包括但不限于矩形、u形、v形、梯形。

61、在本发明一实施方式中，步骤s3中，所述表面修饰包括将基底表面进行多巴胺修饰。

62、在本发明一具体实施方式中，所述表面修饰包括以下步骤：

63、(1)将多巴胺盐溶解于缓冲液中，得到多巴胺水溶液；

64、(2)将预处理的基底浸入多巴胺水溶液中，加热，静置得到修饰的基底。

65、在本发明进一步的具体实施方式中，所述表面修饰包括以下步骤：

66、a、将多巴胺盐酸盐溶解于tris-hcl缓冲液(ph=8.8)得到90 mg/ml 的多巴胺水溶液；

67、b、将基底浸入上述多巴胺水溶液，60℃加热6h后室温静置过夜，移除剩余溶液，pbs清洗，氮气吹干，得到聚多巴胺接枝的高黏附性基底。

68、在一些具体实施方式中，所述基底的材料包括聚二甲基硅氧烷膜（pdms）、聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（pet）、abs塑料膜、聚四氟乙烯膜、透明质酸水凝胶、海藻酸水凝胶、纤维素水凝胶、壳聚糖水凝胶、胶原蛋白水凝胶、明胶水凝胶、丝素水凝胶、琼脂水凝胶、dna水凝胶、去细胞化组织水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、聚丙烯酸水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚多巴胺（pda）水凝胶或聚丙烯酸酯水凝胶等柔性材料；优选为聚对苯二甲酸乙二醇酯膜或聚多巴胺水凝胶。

69、在一些具体实施方式中，所述的基底的材料包括塑料类、硅类、金属类等一种或多种硬性材料。

70、在一些具体实施方式中，步骤s4中，3d打印的参数设置包括：所述打印图案设置为点阵、线条或2d/3d图案；所述打印针头距离基底的高度为20-100微米；所述单位点喷墨时间为0-10s；所述喷墨气压为0-60 psi，精度为0.1 psi；所述基底接触角为0-100度，优选为50±10度；所述墨滴打印精度为100-1500微米，优选为300-500微米。

71、本发明还提供一种细胞或类器官芯片、特别是一种高粘附性细胞或类器官芯片，其是由上述任一种制备方法制备得到的。

72、本发明还提供上述细胞或类器官芯片在药物筛选、药物毒性和功效测试、器官模型构建或组织工程中的应用。

73、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

74、(1)本发明中通过对所述基底经预处理构造微槽，一方面能够增加基底表面的粗糙度，另一方面能让墨滴与基底形成铆钉作用，从而提高墨滴在基底表面的粘附性。

75、(2)本发明通过对所属基底表面进行化学分子修饰，使墨滴与基底之间形成分子键，通过分子作用力可以显著提高打印物与基底之间的粘附性。

76、(3)相比传统手工点样技术，本发明方法所需细胞量少，粘附性高，自动化程度高，极大减少细胞培养成本、培养时间及人工成本，降低人工误差。

77、(4)本发明的芯片可以是一种具有类器官微阵列的药物筛选芯片，所述芯片可以利用少量样本实现药物筛选。