专利名称：纸浆和纸张废水的颜色减退方法
技术领域：
本发明涉及保藏号为MTCC 5099的细菌菌株，制备所述菌株的接种物的方法，以及使用上述接种物使纸浆厂废水颜色减退的方法，该方法包括步骤用所获得的细胞浆液接种合适等份试样的纸浆和纸张厂废水，将混合物在约37℃约100rpm下培养24-48小时，估定颜色和总木质素水平以确定上述细菌的脱色效率。
背景技术：
和现有技术参考在过去数十年中纸浆和纸张厂废水的脱色问题已经成为重要考虑和调查研究的主题。在主要纸张生产国中，估算纸浆和纸张工业每年排放两万亿加仑废水，且大量废水是深色的(Joyce等，1983)。
实质上废水的褐色主要是有机性质的，且主要归因于各种制浆和漂白操作中形成的木质素降解产物(Srivastava等，1984，Dilek等，2000)。其它给予颜色的物质是木材提取物、鞣质、树脂和合成染料。
从来没有认为颜色是主要问题，规类为非常规污染物。据说在一些地方调控颜色的原因是保护渔业或审美考虑。其次，将有色纸浆废水排放至接受水中，除了对生物群具有直接的毒性作用以外，通过降低日光的穿透还抑制了水生生物的光合成活性。
颜色化合物还螯合金属离子并通过重金属给予了污染。最近，导致颜色的有机化合物还涉及蓝绿藻花的出现(Paerl，1982；Kuenzler等，1982；Witherspoon &Pierce，1982)。因此，在排放至接受水之前，除去纸浆和纸张厂废水中存在的颜色是迫切的。
存在两种常规策略来使纸浆和纸张厂废水脱色1)常规输送管终端的处理2)改变纸浆和纸张的生产方法使得产生较少的颜色以下是常用的脱色技术-二次处理用常规的活性污泥法来处理废水。然而，常规生物处理系统不能脱色(Yosefian等，2000)。
-酶预处理-树脂分离和离子交换-氧化铝-木材吸收-膜处理-辐射-电解处理-活性炭-污水田间处理-臭氧在这点上，没有确定出单个脱色技术为最有效的。因为所有上述技术都是高成本的，对所涉及的工厂具有不利的经济影响。此外，化学处理方法增加了不断提高的化学物在环境中的浓度(Kapdam等，2000)。
原则上，使用以下一种方法或组合可以实现脱色-吸收-过滤-沉淀-化学降解-光降解，和-生物降解Rohella等，2001使用聚合电解质(可购得)用于除去纸浆厂废水颜色。然而，还没有详细研究该处理的成本-收益分析，因此这种技术不可行。然而，由于聚合电解质依赖废水的离子交换，鉴于废水组成中发生的巨大波动，颜色减退能力变化很大。
大多数脱色技术是通过将色料浓缩入泥浆或通过部分降解或完全降解有色分子来进行的(Willmott等，1998)。然而，纸浆厂废水的颜色和化学组成通常受日常处理以及季节性波动控制。因此迄今为止还没有出现简单、通用的输送管终端解决方法。
已经发展了常规的物理-化学脱色法如化学沉淀、快速砂滤、膜处理和吸附(Springer，1985)。吸附和膜处理，尽管是有效的，但是昂贵的(Manjunath和Methrotra，1981)。
电化学方法的应用是处理纤维素纸张生产废水的另一途径(Christoskova和Lazarov，1988)。该方法确保了高处理效率，但是其效率取决于电极的类型，电凝结器的结构和运行处理的条件。
使用明矾、氯化铁和石灰的化学沉淀已经得到了广泛研究(Lathia和Joyce，1978；Dugal等，1976；Joyce等，1979；Srivastava等，1984；Beulker和Jekel，1993；Stephenson & Duff，1996)。尽管停留时间短和资本成本低，仍然报道了一些缺陷，如用于沉淀和用于pH调节的化学物的高成本、由于大剂量产生了大体积的泥浆、与产生的泥浆脱水和放置相关的问题以及高残留离子含量，因此它们的颜色保留在上清液中(Stephenson和Duff，1996；Srivastava等，1984)。
理论上，生物处理给予了脱色的理想处理方法，因为和化学处理相比较产生了较少的泥浆。还使得日运营成本更低。在生物系统中，已经广泛研究了白腐菌降解木质素的能力，木质素是形成纸浆和纸张废水的重要和主要组分(Feijoo等，1995)。一些工作者已经表明白腐菌的团粒，在特定培养条件下，强烈吸收牛皮纸漂白车间废水的颜色和AOX(Jaspers等，1996)。
Raghu Kumar等，1996，表明了海洋真菌也可以用来使漂白车间废水脱色。报道了一株菌株在碱性pH下14天的时间段内脱色74％。其它的数名研究者也报道了通过白腐菌部分脱色(Eaton等，1980；Livernoche等，1983；Pronty，1990；Gokcay和Dilek，1994)。Gokcay和Dilek(1994)已经指出由于真菌需要高葡萄糖浓度，该处理在经济上是不可行的。他们还报道了当存在漂白废水时真菌是无效的。
Dilek等，1999已经报道了使用混合的培养藻类使纸浆废水的脱色。Vidal等已经使用了需氧-厌氧的组合处理。将分泌数种胞外氧化酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的白腐菌用于使漂白牛皮纸纸浆厂废水脱色。通过酶处理后运用需氧-厌氧处理颜色减退高达64％。
迄今为止，几乎没有关于利用纯细菌培养物来使纸浆废水脱水的报道。本发明的新颖性是应用从天然生境中分离的细菌纯培养物以工业上和经济上可行的方式用于纸浆和纸张废水脱色。
发明目的本发明的主要目的是提供需氧处理纸浆厂废水用于颜色减退的方法。
本发明的另一目的是提供用于纸浆和纸张废水颜色减退的细菌菌株。
仍然是本发明的另一目的是开发菌株的接种物用于纸张和纸浆废水颜色减退。
发明概述本发明涉及保藏号为MTCC 5099的细菌菌株，制备所述菌株的接种物的方法，和使用上述接种物使纸浆厂废水脱色的方法，该方法包括步骤用所获得的细胞浆液接种合适等份试样的纸浆和纸张厂废水，将混合物在约37℃约100rpm下培养24-48小时，估定颜色和总木质素水平来测定上述细菌的脱色效率。
发明详述本发明涉及保藏号为MTCC 5099的细菌菌株，制备菌株接种物的方法，和使用上述接种物使纸浆厂废水脱色的方法，该方法包括步骤用如权利要求2所要求的所获得的细胞浆液接种合适等份试样的纸浆和纸张厂废水，用于和含有废水样品但没有任何添加接种物的对照摇瓶一起进行颜色减退研究，将步骤(a)中建立的摇瓶在37℃/100rpm培养48小时，从上述摇瓶中取出50ml等份试样并对它们进行处理，估定颜色和总木质素水平来测定上述细菌的颜色去除效率。
在本发明的另一实施方案中，其中为保藏号MTCC 5099的细菌菌株。
在本发明的另一实施方案中，其中A菌株如权利要求1中所要求的，其中菌株是革兰氏-ve。
本发明的另一实施方案中，其中A菌株如权利要求1中所要求的，其中菌株是短杆状的。
本发明的另一实施方案中，其中制备权利要求1的菌株之接种物的方法，所述方法包括步骤i)从纸浆和纸张厂废水处理车间收集的活性污泥中分离细菌，ii)在含有木质素、鞣质和香草醛各0.1％w/v的营养琼脂培养基上培养所述细菌来获得纯培养物，iii)将所述细菌接种于含有0.01％吐温80的营养肉汤中来获得起始培养物，iv)培养上述培养物来获得所需的生物量，方法是通过用起始培养物接种合适等份试样的营养肉汤，并将上述培养基在37℃/100rpm培养16-18小时，v)在达到1.5-2.0的光学密度后，将所得到的培养物离心来获得团粒，通过溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来洗涤收集的团粒，将团粒再次离心，和vi)收集步骤(e)获得的团粒，溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来获得用于可处理性研究的细胞浆液。
本发明的另一实施方案中，其中用于颜色减退实验中的接种物是将上述细菌接种于含有0.01％吐温80的营养肉汤中来获得起始培养物而获得的。
本发明的另一实施方案中，其中上述起始培养物用于获得所需的接种物，方法是通过用起始培养物接种合适等份试样的营养肉汤，并将上述培养基在37℃/100rpm培养16-18小时。
本发明的另一实施方案中，其中将所得到的培养物在合适的rpm，优选6000rpm下于4℃离心20分钟。
本发明的另一实施方案中，其中通过溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来洗涤所得到的团粒，将团粒再次离心。
本发明的另一实施方案中，其中将所得到的团粒溶解于10ml0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来获得用于颜色减退研究的接种物；本发明的另一实施方案中，其中使用如权利要求2中所要求的上述接种物使纸浆厂废水脱色，其包括i)用如权利要求2中所要求的获得的细胞浆液接种合适等份试样的纸浆和纸张厂废水，与含有废水样品但无任何添加接种物的对照摇瓶一起用于颜色减退研究。
ii)将步骤(i)中建立的摇瓶在37℃/100rpm培养48小时，iii)从上述摇瓶中取出50ml等份试样并处理之用来估定颜色和总木质素水平，iv)分析上述细菌的颜色去除效率，方法是通过在24和48小时的间隔后，将用如权利要求2所要求的细菌处理的废水的颜色水平和对照样品的颜色水平相比较。
v)检测废水中上述培养物的生活力，方法是通过将其在营养琼脂糖培养基上培养并计算CFU/ml。
本发明的另一实施方案中，其中检测上述培养物的生活力，方法是通过将从实验样品取得的稀释物涂布来获得可计数的菌落，并在24和48小时间隔后计算其CFU/ml。
本发明的另一实施方案中，其中如权利要求1至9所要求的方法，其中限定了需氧、生物脱色方法，其利用从纸浆和纸张厂ETP的活性污泥获得的细菌分离物，使给定废水的颜色水平降低至多达55％。
本发明的另一实施方案中，其中菌株显示出24小时内颜色减退55％。
本发明的另一实施方案中，其中菌株显示出48小时内颜色减退60％。
本发明的另一实施方案中，其中与生物量的当量比约为1∶1。
本发明的另一实施方案中，其中颜色减退后菌株是有生活力的。
本发明的另一实施方案中，其中本发明提供了使纸浆和纸张厂废水颜色减退的生物方法。还公开了从特定来源分离的、能够使纸浆和纸张废水颜色减退的细菌菌株。所述细菌分离物能够减退废水颜色。
本发明的另一实施方案中，其中本发明涉及使纸浆和纸张废水颜色减退的生物方法，方法是使用从纸浆和纸张厂特定来源分离的需氧细菌菌株。
本发明的另一实施方案中，其中本发明提供了使用需氧处理方法使纸浆厂废水颜色减退的方法。需氧细菌菌株是从纸浆和纸张厂特定来源分离的并用于纸浆厂废水脱色。
本发明的另一实施方案中，其中根据本发明的细菌分离物是目前保藏于IGIB如CBTCC/及其鉴定在进行中。
本发明的另一实施方案中，其中该细菌分离物有助于纸浆和纸张废水的颜色减退。
本发明的另一实施方案中，其中本发明中所述的细菌是从纸浆和纸张厂废水处理车间的活性污泥中分离出来的。将纸浆和纸张厂废水处理车间中取出的5g均质活性污泥接种于富集培养基中。富集培养基由100ml污泥浸出物，25ml无菌营养肉汤和各为0.1％(w/v)的木质素(Alkali lignin-Aldrich，USA)、香草醛和鞣质(Sigma)。将pH调节至6.8±0.2。
本发明的另一实施方案中，其中将含有300ml污泥的混合物在1200ml三重蒸馏水中煮沸约30分钟来制得污泥浸出物。将浸出物冷却，离心并粗滤。将获得的终滤液在121℃15psi高压灭菌20分钟并用于制备富集培养基。将活性污泥接种的富集培养基在37℃培养24-48小时来获得富集培养物。
本发明的另一实施方案中，其中使用pH7.0的0.05MNaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将加富培养物连续稀释至10-12。制备木质素、香草醛和鞣质的储液。制得含有2％琼脂的营养肉汤并从其储液中加入各0.2％(v/v)的木质素、香草醛和鞣质。然后将连续稀释的接种物涂布并在37℃培养24-48小时。挑选单个分离的菌落并在相同培养基的新鲜平板上划线。重复上述步骤两次，直至获得纯的菌落。
本发明的另一实施方案中，其中利用无菌镍铬合金接种环将上述细菌接种于15-20ml无菌营养肉汤(NB)中，营养肉汤含有(每升)5.0g动物组织的胃酶消化物，5.0g氯化钠，1.5g牛肉浸膏，1.5g酵母浸膏和0.2ml吐温-80。将培养物在振荡培养器中37℃培养约16-18小时。为了轻微振荡，将振荡培养器保持于合适的rpm，优选100rpm。获得充分生长后，将肉汤保持于4℃直至进一步使用。用250μl上述制得的起始培养物接种250ml无菌NB。
本发明的另一实施方案中，其中将摇瓶在37℃/100rpm培养16-18小时直至获得13-2.0的光密度(650nm)。在合适rpm，优选6000rpm离心20分钟来收集细胞。通过溶解于0.05M，pH6.8的最小量的磷酸盐缓冲液中来洗涤所获得的团粒，并使用相同的rpm和时间条件再次离心。在离心过程中，将温度维持于4℃。因此将获得的团粒重悬浮于0.05M，pH6.8的最小体积优选10ml的磷酸盐缓冲液，并涡旋制得均质悬浮液用于纸浆和纸张废水颜色减退。
本发明的另一实施方案中，其中为了建立颜色减退实验，从螺帽圆锥摇瓶中取250ml样品。在检测废水pH，优选约7.0后，将接种物加入废水样品中。还维持了不含有任何添加接种物的对照摇瓶用于比较。将摇瓶在37℃/100rpm培养48小时。
本发明的另一实施方案中，其中为了分析上述细菌的颜色减退效率以及总木质素含量，取出约50ml的样品。在合适rpm，优选8000rpm 4℃离心30分钟来制得用于分析的样品。然后将上清液通过0.45μ滤器(Millipore)。为了测量颜色水平，将样品的pH调节至7.6并在465nm处测量光密度，如NCASI颜色测定方法中所述的。还通过改良的PearlBenson方法进行了总木质素测定。
本发明的另一实施方案中，其中为了测定整个实验过程中培养物的生活力，将样品连续稀释并涂布在营养琼脂培养基上，在37℃倒置培养过夜。计数菌落并计算菌落形成单位/ml(CFU/ml)。
本发明的另一实施方案中，其中本发明进一步提供了制备所述菌株的接种物的方法，并将该接种物用于纸浆和纸张工业废水颜色减退，其包括a)从纸浆和纸张厂废水处理车间的活性污泥中分离细菌；b)在含有木质素、鞣质和香草醛各0.1％w/v的营养琼脂培养基上培养所述细菌来获得纯培养物；c)将所述细菌接种于含有0.01％吐温80的营养肉汤中来获得起始培养物；d)培养上述细菌来获得所需的生物量，方法是通过将起始培养物接种于合适等份试样的营养肉汤中，并将上述培养基在37℃/100rpm培养16-18小时；e)在获得1.5-2.0的光密度后，将所得到的培养物离心来获得团粒，通过溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来洗涤收集的团粒，将团粒再次离心；f)收集从步骤(e)中获得的团粒，溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来获得用于可处理性研究的细胞浆液；g)用步骤(f)中获得的细胞浆液接种合适等份试样的纸浆和纸张厂废水，和含有废水样品但没有任何添加接种物的对照摇瓶一起用于颜色减退研究；h)将步骤(g)中建立的摇瓶在37℃/100rpm培养48小时；i)从上述摇瓶中取出50ml等份试样并对它们进行处理来估定颜色和总木质素含量；i)分析上述细菌的脱色效率，方法是通过在24和48小时间隔后和对照样品的颜色水平相比较；k)检测废水中上述细菌的生活力，方法是在24和48小时后通过菌落计数方法并计算CFU/ml。
本发明的实施方案中，细菌是从纸浆和纸张厂的废水处理车间收集的活性污泥中分离的。
本发明的另一实施方案中，将上述细菌接种于含有0.01％吐温80的营养肉汤中来获得起始培养物。
本发明的另一实施方案中，通过用起始培养物接种营养肉汤来制得细菌培养物。
本发明的另一实施方案中，通过在100rpm轻柔振荡来进行细菌菌株的培养。
本发明的实施方案中，进行培养的细菌菌株在37℃生长16-18小时。
本发明的另一实施方案中，在达到约1.5-2.0的光密度后，将所述细菌在合适rpm，优选6000rpm 4℃离心约20分钟。
本发明的进一步实施方案中，通过溶解于最小量0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液中来洗涤所得到的团粒，使用相同的rpm和时间条件再次离心。在离心过程中，将温度维持于4℃。
本发明的进一步实施方案中，将如此获得的团粒重悬浮于最小体积、优选10ml的0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液中，并涡旋来获得均质的悬浮液。
本发明一实施方案中，上述获得的细胞浆液用于接种废水样品以减退颜色。
本发明进一步提供了降低纸浆和纸张厂废水彩色信号电平的方法。
本发明另一实施方案中，将含有上述接种物的摇瓶在37℃120rpm培养48小时。
本发明进一步的实施方案中，在48小时后观察到颜色和总木质素水平的降低。
本发明另一实施方案中，将培养物生长于含有营养琼脂培养基的平板上，用于测定所述废水中细菌的生活力。
如临时专利中所述的，细菌聚生体能够在5天的时间段内使废水颜色减退。然而，进行了后来的研究来降低保留时间(使处理更快)以及来提高废水颜色减退的程度。观察到通过单一细菌分离物在24小时的时间段内约降低了58％的颜色水平，明显优于较早的聚生体情况中在3至5天时间段内降低51％。因此，在完整专利说明书中，呈现了使用单一细菌分离物所获得的结果；显著优于那些通过细菌聚生体获得的结果。
2.于2003年3月17日前已经将培养物保藏于国际保藏单位IMTECH并分配编号。
3.我们只要求了一个重复给出最佳结果的细菌分离物，如完整说明书中表5和表8所给出的。
本申请的菌株保藏于MTCC，昌迪加尔，印度，保藏号为MTCC5099。在说明书中的一些地方该菌株以细菌菌株细菌B4提及。
以实施例的形式进一步详细描述本申请的本发明。然而，这些实施例只是说明本发明并不是来限制本发明的范围。
实施例I从废水处理车间的进口以及出口流出的废水中分离细菌。检测废水的pH，发现为7.6±0.2。以不同的百分比，即100％、80％、50％、30％、和10％将过滤并高压灭菌的废水用作分离原地生活细菌的介质，使用矿物盐培养基(MSM)。所用MSM的组成如下K2HPO45mMKH2PO45mMMgSO4.7H2O1mMEDTA 0.3mMZnSO4.7H2O0.01mMMnSO4.7H2O0.02mMCuSO4.7H2O0.004mMFeSO4.7H2O0.1mMNaMoO4.2H2O 0.004mM(NH4)2SO4.7H2O 5mMpH 7.0±0.2向100ml等份的营养肉汤(NB)中，加入各1ml进口以及出口的废水，并保持于37℃/24-48小时来富集。
使用2％琼脂作为固化剂来制得废水-MSM平板。将平板放置使固化并倒置直至进一步使用。通过连续稀释富集的接种物直至10-12的稀释度来进行连续稀释涂布。如下进行连续稀释取9ml等份Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH6.8，0.05M)并接种1ml富集的接种物于第一个指管中，涡旋并从该指管中取出1ml并用其稀释至下一个指管中，直至获得10-12的稀释度。然后将这些指管用于涂布废水MSM平板。
将100μl上述稀释液放置于不同的废水-MSM平板上并用无菌玻璃涂布器涂布。所有平板制备两份并在37℃培养24-48小时。根据形态差异将这些平板上出现的菌落标记并选择用于进一步的纯化。
用无菌接种针挑取呈现不同形态外观的菌落并涂布于含有各自生长培养基的平板上。各自两至三代传代培养后，获得纯化的分离物，测试其纯度并在其各自培养基中以斜面和穿刺保存。
取出铂环量的培养物并接种于无菌等份的营养肉汤中，涡旋并保持于37℃/120rpm培养16-18小时。在650nm测定这些种子发酵剂的光密度。
选择35个形态不同的细菌来筛选它们使纸浆厂废水颜色减退的能力。用100μl各自的种子培养物接种100ml无菌NB并记录650nm的最终光密度。通过6000rpm 4℃离心20分钟收集OD650为1.5-2.0的培养物。使用无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8，0.05M)洗涤所获得的团粒两次并重悬浮于小体积的相同缓冲液中。然后将该悬浮液以1∶1的比例用于可处理性试验，即，用100ml培养基获得的团粒来处理100ml废水样品。
在圆锥烧瓶的分批培养物中进行脱色实验，37℃120rpm5天。使用NCASI光密度方法在450nm测量第零天、第三天和第五天的色度。13株细菌在第五天给出了50％和更多的颜色减退(表1)。
实施例II选择了呈现高于50％颜色减退的13株单独细菌并使用随机组合配制9个不同的细菌聚生体。
将组成配制聚生体的单独培养物独立地生长于营养肉汤中，方法是通过将100μl活化生长培养物接种于每个摇瓶中。将培养物在37℃/120rpm培养16-18小时直至获得1.5-2.0的光密度。然后根据聚生体组成将培养物组合在一起。测量组合培养物在650nm处的光密度。在6000rpm 4℃离心20分钟收集所得到的聚生体细胞，并用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH6.8，0.05M)洗涤两次。然后将团粒再溶解于10ml磷酸盐缓冲液中并用于颜色减退实验。
取500ml等份的中和至pH7.0+0.2的废水样品于摇瓶中，并用上述制得的团粒以1∶1比例接种。所有摇瓶在37℃/120rpm培养3天。还维持了对照，其不含有任何添加的从自然菌群分离的接种物。
使用NCASI光谱实验分析样品的颜色水平并计算颜色减退的百分比。只有两个聚生体呈现颜色减退高于50％(表2)。
实施例III检测用于降低颜色水平的最佳接种量，方法是通过接种三个不同比例，即1∶1，1∶0.5和1∶0.75(废水∶培养物)的聚生体。
取100ml废水样品于摇瓶中并接种从100ml、50ml和75ml NB等份制得的配制聚生体。培养温度、时间和振荡的所有条件保持和实施例2中相似，处理三天后测量颜色水平。
1∶1废水∶生物量比例的聚生体呈现最高颜色减退(表3)实施例IV为了提高脱色效率，从纸浆和纸张厂的ETP获得的活性污泥中进行新鲜细菌的分离。将从纸浆和纸张厂的ETP取得的5克均质活性污泥取样在培养基中富集，培养基包括100ml污泥浸出液，25ml无菌营养肉汤和木质素(Alkali lignin-Aldrich，USA)、香草醛和鞣质(Sigma)各0.1％(w/v)。将pH调节至6.8±0.2。
筛选单个细菌使纸张厂废水颜色减退的能力。在100ml等份试样中进行可处理性试验，并筛选单个细菌团粒的脱色效率。观察到分离物No.4为其中的最佳，在48小时内脱色68％。接着为分离物No.35(63％)和19(60％)(表4)。
实施例V然后将分离物4、19和35在两种不同的培养基中单独培养——营养肉汤(NB)(富集培养基)和含有无机成分和作为碳源的葡萄糖(1％)的矿物盐培养基(最小培养基)，来比较生长培养基对培养物的纸浆厂废水颜色减退性能的作用。
还分开培养了上述分离物，用于以聚生体的形式将它们配制一起，并同样测试了培养基对聚生体颜色减退效率的作用。
通过溶解(每升)5.0g动物组织胃酶消化物，5.0g氯化钠，1.5g牛肉浸膏，1.5g酵母浸膏和0.2ml吐温80来制得营养肉汤(NB)。如实施例I中所述的制得矿物盐培养基(MSM)。还将从无菌储液中取出的葡萄糖(1％v/v)加入MSM种作为细菌的碳补充物。
在37℃和120rpm振荡培养的100ml等份分批培养物中进行脱色试验。在0、24和48小时间隔取出用于颜色分析的样品并分析颜色水平。
NB和MSM生长培养物两者呈现几乎相类似的结果(表5)。
实施例VI将呈现了使纸浆厂废水脱色高于60％的分离物4、19和35配制成聚生体，并和其它配制的含有随机组合培养物的聚生体一起筛选它们的颜色减退能力。其中聚生体CC17是最佳的，在48小时内呈现高达55％的颜色减退。
实施例VII将实施例VI中配制的聚生体CC17在不同浓度即0.5、0.75、1.0％w/v的葡萄糖和蔗糖的存在下用于世纪(century)进口废水的颜色减退。
和其它相比较，发现1％葡萄糖为最佳补充剂，在48小时内给予了高达75％的颜色减退。然而，所有其它的相互之间没有显著不同(表7)。
实施例VIII尽管废水中添加葡萄糖看来似乎给予了更好的颜色减退，然而，其可实践的可处理性是可疑的。因此本发明者决定提高废水中生物菌团负荷来观察效果。将细菌no.4、19和35单独生长，如之前所述的直至1.5-2.0而不是1.0的OD 650，来配制聚生体，还将MTCC 5099单独培养至1.5-2.0的光密度，来观察颜色减退效率的任何提高。所有其它实验条件相同。细菌No.4在24小时内呈现高达55％的颜色减退(表8)。
还使用改良的Pearl Benson法计算了上述细菌的总木质素含量。
和具有提高生物菌团负荷的其它单独细菌以及聚生体相比，细菌No.4呈现最佳反应。结果重复三次。
实施例IX通过关于菌落形成单位(CFU/ml)的实验来进行分离物4的生物量和生活力的监控。
发现第零小时时，CFU/ml水平约为109CFU/ml，其保持至24小时，实际上显示了提高至1010CFU/ml，表明甚至直至实验结束，细胞完全是有生活力的。将样品划线于固体营养培养基上，来和废水中培养的原始菌落的形态特征相匹配，发现是相同的。
表-1世纪纸浆和纸张厂进口ETP的颜色减退
*显示高于50％颜色减退的细菌备注所有值是三个实验的平均表-2不同配制聚生体的世纪ETP进口废水的颜色减退％
*在0天呈现高于50％的聚生体。
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2表-3不同配制聚生体的世纪ETP进口废水的颜色减退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2
表-448小时后不同分离物的颜色减退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2表-5单个分离物及其配制的聚生体的纸浆厂废水颜色减退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2
表-6不同配制的聚生体的纸浆厂废水颜色减退％
所有值是三次分析的平均，S.D.±0.2表-7额外的碳源对聚生体CC17效率的影响
所有值是两次分析的平均，S.D.±0.2
表-8提高单个细菌的生物量以及以聚生体形式对纸浆厂废水的颜色和总木质素含量的影响
所有值是三次读数的平均，S.D.±0.5表-9在颜色减退实验过程中就菌落形成单位(CFU/ml)而言废水中MTCC5099的生活力
优势1.分离的细菌能够以可复现的方式使纸浆厂废水颜色减退。
2.分离的细菌甚至在完成实验后保持生活力，表明了在下次实验中的再用性。
3.天然分离的细菌是非致病性的，且可以在简单营养培养基上培养而无任何经济负担。
4.使纸浆厂废水颜色减退的该种类细菌是新的。
权利要求
1.保藏号为MTCC 5099的细菌菌株。
2.如权利要求1的菌株，其中菌株是革兰氏-ve。
3.如权利要求1的菌株，其中菌株是短杆状的。
4.制备权利要求1的菌株接种物的方法，所述方法包括a)从纸浆和纸张厂废水处理车间收集的活性污泥中分离细菌，b)在含有木质素、鞣质和香草醛各0.1％w/v的营养琼脂培养基上培养所述细菌来获得纯培养物，c)将所述细菌接种于含有0.01％吐温80的营养肉汤中来获得起始培养物，d)通过用起始培养物接种合适等份试样的营养肉汤，并将上述培养基在37℃/100rpm培养16-18小时，培养上述培养物来获得所需的生物量，e)在达到1.5-2.0的光学密度后，将所得到的培养物离心来获得团粒，通过溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来洗涤收集的团粒，将团粒再次离心，和f)收集步骤(e)获得的团粒，溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来获得用于可处理性研究的细胞浆液。
5.如权利要求4的方法，其中用于颜色减退实验的接种物是通过将上述细菌接种于含有0.01％吐温80的营养肉汤中来获得起始培养物而获得的。
6.如权利要求4的方法，其中上述起始培养物用于获得所需的接种物，方法是通过用起始培养物接种合适等份试样的营养肉汤并将上述培养基在37℃/100rpm培养16-18小时。
7.如权利要求4的方法，其中将所得到的培养物在合适的rpm，优选6000rpm于4℃离心20分钟。
8.如权利要求4的方法，其中通过溶解于0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来洗涤所得到的团粒，将团粒再次离心。
9.如权利要求4的方法，其中将所得到的团粒溶解于10ml 0.05M，pH6.8的PO4-3缓冲液中来获得用于颜色减退研究的接种物。
10.使用上述如权利要求2的接种物使纸浆厂废水颜色减退的需氧方法，其包括a)用所获得的如权利要求2的细胞浆液接种合适等份试样的纸浆和纸张厂废水，和含有废水样品但不含任何添加接种物的对照摇瓶一起用于颜色减退研究；b)将步骤(a)中建立的摇瓶在37℃/100rpm下培养48小时；c)从上述摇瓶中取出50ml等份试样并对它们进行处理用于估定颜色和总木质素水平；d)分析上述细菌的颜色除去效率，方法是通过在24和48小时间隔后将用如权利要求2中所要求的细菌处理的废水之颜色水平和对照样品的颜色水平相比较，e)检测上述培养物在废水中的活力，方法是通过将其在营养琼脂培养基上培养并计算CFU/ml。
11.如权利要求10的方法，其中通过涂布取自实验的样品之稀释液以获得可计数菌落并在24和48小时间隔后计算其CFU/ml而检测上述培养物的活力。
12.如权利要求10的方法，其中使用从纸浆和纸张厂ETP活性污泥中获得的细菌分离物限定需氧、生物脱色方法，其给予给定废水颜色水平高达55％的减退。
13.如权利要求10的方法，其中菌株在24小时内显示出颜色水平55％的减退。
14.如权利要求10的方法，其中菌株在48小时内显示出颜色水平60％的减退。
15.如权利要求10的方法，其中与生物量的当量比约为1∶1。
16.如权利要求10的方法，其中菌株在颜色减退后有活力。
全文摘要
本发明涉及保藏号为MTCC 5099的细菌菌株、制备所述菌株接种物的方法、使用上述菌株使纸浆和纸张厂废水颜色减退的方法，其包括步骤用获得的细胞浆液接种合适等份试样的纸浆和纸张厂废水、将混合物在约37℃约100rpm下培养24－48小时、估定颜色和总木质素含量来测定上述细菌的除色效率。
文档编号C02F3/34GK1771322SQ200380110281
公开日2006年5月10日 申请日期2003年12月9日 优先权日2003年3月21日
发明者R·库马尔, A·库马尔, D·K·蒂胡 申请人:科学与工业研究会