专利名称：高碱性纺织工业废水的生物中和的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌分离株-库特氏菌(Kurthia sp..)(MTCC 5181)，保藏在布达佩斯条约认可的IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度。更具体地，本发明涉及制备细菌分离株-库特氏菌(MTCC 5181)的方法，所述菌株用于中和纺织工业的碱性废水(pH-12.00-11.5)，并且保藏在布达佩斯条约认可得国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度。本发明还涉及利用本发明的细菌分离株中和高碱性纺织工业废水的方法。
背景和现有技术严格的法律和权威机构频繁的检查反映了目前社会对环境的日益关注。因此，例如，当排除到接收水道或污水系统中时，最低限度仅允许工业如纺织工业废水的pH偏离中性点。
取决于应用，可获得各种化学品来中和高碱性的纺织工业废水。在多数情形中，使用硫酸(H2SO4)。终端使用者必须考虑使用的浓度，必须仔细分析涉及的所有化学反应，必须阅读制造商的警示和说明，并且必须考虑关于危险液体的公共安全措施。
用化学品处理废水的方法包括使用酸或碱，或加入废水中时能够形成酸或碱的物质。取决于应用，可获得各种化学品用于工业中和，不论是中和酸性溶液或碱性溶液。
用于酸性或碱性中和的最常使用的中和化学品是98％硫酸和50％氢氧化钠。在很多情形中，它们是非常好的选择，然而，在选择化学品时需要进行许多考虑，并且它们可能并非常常是最佳选择。选择用于中和酸或碱的化学品常常与设计中和体系一样重要。下面列出了一些选择化学品考虑的重点·健康和安全性。
·成本和便利性。
·中和化学品的物理性能。
·存储环境。
化学品选择标准的一个说明如下健康和安全性混合化学品可导致极度的危险/有害反应。例如，向具有氰化物的溶液中添加酸导致释放致死的HCN气体。
成本和便利性大多数应用中酸和碱发挥作用。例如，硫酸(H2SO4)是低成本的，并且比硝酸更有效。在评估成本时浓度也是一个重要的考虑因素。例如，可以接近0％-98％的浓度范围来购买H2SO4。浓度越高，通常花费越小。
物理性能必须仔细考虑所选择试剂的物理性能。例如，50％氢氧化钠(NaOH)在低于60的温度下开始结冰。将浓度降低至25％完全消除了这一顾虑。例如，盐酸(HCl)严重除气(out gasses)。该气体非常具有腐蚀性，并且侵蚀所有金属物品。因此，如果使用HCl，必须是适当通风，或在气体可容易消散的室外使用。
存储环境关注存储问题如罐的类型和可利用的次级污染，操作者对处理危险化学品的熟练度，再填满存储容器或从大容积罐中转移程序的危险性。
最常使用的中和化学品如下·酸硫酸，盐酸，硝酸，磷酸和在水中形成碳酸的二氧化碳。
·碱氢氧化钠(苛性钠)，氢氧化钙，碳酸钙(石灰或石灰石)，氢氧化铵。
用酸中和世界上最广泛使用和生产的化学品是硫酸。可获得的浓度范围是0％-98％，在所有和普遍用于中和反应的酸中，硫酸是最经济的。它比使用HCl或HNO3更容易和更安全，并且除了磷酸以外，它比其它所有酸更有效。硫酸的典型使用浓度范围是25％-96％。然而，通常推荐使用30％-50％浓度的硫酸。
盐酸(HCl)，也已知为muriatic acid，是在工业上第二个最常使用的酸，硫酸是主要的选择，原因在于硫酸更有效并且相对廉价。在最大可获得浓度37％时，HCl的有效性约是硫酸的1/3，因此使得它使用起来相对更昂贵。取决于温度和搅拌，10％浓度以上的HCl变为氯化氢蒸气，其与空气中存在的水蒸汽结合。由此形成的气体具有高度的腐蚀性，并且侵蚀所有的金属物品，包括建筑物结构，喷头，铜线，不锈钢等。因此，必须是适当通风，或在气体可容易消散的室外使用。
硝酸(HNO3)，尽管是在很多工业中广泛使用的化学品，它仍然不如盐酸或硫酸普及，原因在于它使用起来比两者更昂贵。硝酸与空气中存在的水蒸汽结合变为有害气体。该气体是高度腐蚀性的，并侵蚀所有金属物品，包括建筑物结构，喷头，铜线，不锈钢等。因此，必须是适当通风，或在气体可容易消散的室外使用。
磷酸(H3PO4)，非常广泛用于农业肥料和洗涤产品的生产，它是相对廉价的酸。然而，它仍然不能与硫酸和盐酸充分竞争，原因在于它是弱酸，并且在正常浓度时在水中不能完全解离。这赋于它在使用时比硫酸或盐酸更安全，并且它较少变体气体。它倾向于缓冲中和反应，这使得它用于较慢的容易控制的反应。由于它的成本(与硫酸相比较)和可用性，磷酸不常用于中和体系中。
二氧化碳(CO2)是在地球大气中发现的第三个最浓的气体，CO2本身不是酸。当溶解于水中时，它形成碳酸(H2CO3)；就是这种碳酸在溶液中产生碱的中和。对于所有的实际应用而言，CO2最吸引人的特征是它不将水的pH降低在7.0以下。另外，CO2不具有腐蚀性；然而，由于它比空气更重，因此，一种危险是引起窒息。由于必须将二氧化碳溶解在溶液中使用，因此难于使用该气体，并且它的应用受到限制。这需要使用碳酸化器，或一些方法，以将该气体溶解在溶液中。还发生显著的出气，这不成问题，除非方法还需要固体沉淀。在灌注水泥的操作中，产生大量的碱性废水。对于这类应用而言是极好的选择，原因在于位点是临时的，气体是无危险的，假设考虑保留和混和，可以平行(in-line)使用，并且该气体是自身缓冲的，因此不考虑剂量，它将不会将pH降低到低于7.5-7.0。
嗜碱菌(alkaliphiles)
取决于生长条件，特别是营养，金属离子和温度，对于生长而言，几种微生物显示出多于一种适宜pH。术语“嗜碱菌”用于表示在pH超过9的条件下最适生长或生长良好的微生物。第一篇涉及嗜碱性微生物的碱性酶的报道公开于1971年(Horikoshi.K.(1971)Production of alkaline enzymesby alkalophilic microorganisms.Part 1.Akaine protease produced by BacillusNo，221.Agric.Biol.Chem.36，.1407-1414)。在过去的二十年中，我们的研究已经集中在嗜碱性微生物的酶学，生理学，生态学，分类学，分子生物学和遗传学。这些微生物的工业应用也已经被广泛研究，一些酶如碱性蛋白酶，碱性淀粉酶和碱性纤维素酶已经用于工业规模(Horikoshi，K.andAkiba，T.(1982)Alkalophilic MicroorganismsA New Microbial World.Springer-Verlag，Heidelberg，Tokyo.，Horikoshi，K.(1991)Microorganisms inAlkaline Environments，Kodansha-VCH，Tokyo，Weinheim，New York，Cambridge，Basel)。
随后，很多微生物学家在各种领域发表了许多关于嗜碱性微生物的文章。在pH10-13的碱性环境中，嗜碱菌的细胞表面可以维持细胞内的pH处于中性。在1995年，通过利用嗜基本二氧化碳C-125突变体开发了新的宿主载体系统，该突变体对碱性敏感，并且已经研究了负责嗜碱性(alkaliphily)的基因(Kudo，T.，Hino，M.，Kitada，M.and Horikoshi，K.(1990)DNA sequences required for the alkalophily of Bacillus sp.strain C-125 arelocated close together on its chromosomal DNA.J.Bacteriol.172，7282-7283.Seto，Y.，Hashimoto，M.，Usami，R.，Hamamoto，T.，Kudo，T.and Horikoshi，K.(1995)Characterization of a mutation responsible for an alkali-sensitivemutant，18224，of alkaliphilic Bacillus sp.Strain C-125.Biosei.Biotechnol.Biochem.59，1364-1366)。
尽管已经将嗜碱菌用于许多工业应用，但没有关于利用它们来中和纺织工业废水的研究报道。美国专利申请号09/160422(1998)公开了在存在糖的条件下利用细菌混和物的生物中和方法。
发明目的本发明的主要目的是提供细菌分离株-库特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度。
本发明的另一个目的是提供制备保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度的细菌分离株库特氏菌(MTCC5181)的方法。
本发明的另一个目的是分离细菌-库特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度，并且能够中和纺织工业的高碱性废水。
发明概述本发明提供了一种来自纺织工业废水的细菌分离株-库特氏菌(MTCC5181)，其保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度。该细菌分离株能够在2小时的时间内将废水的pH从12.00降低到7.00单位。与通过化学手段进行常规中和相比，通过该生物技术方法中和碱性纺织工业废水是高度有效和经济的。
在本发明的一个实施方案中，该细菌分离株能够在10.00-12.00的pH范围内生长。
在本发明的另一个实施方案中，该细菌分离株能够在短时间内(约2小时)将纺织工业废水的pH(12.0-11.5)降低至中性pH(7.5-7.00)。
在本发明的另一个实施方案中，以1∶5-1∶10的比率，将细菌沉淀用于将纺织工业废水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。在本发明的另一个实施方案中，该细菌分离株分离自位于印度昌迪加尔的纺织工业流出物处理工厂管道中在积累的污物，该管道已经长时间通过碱性废水。
在本发明的另一个实施方案中，该细菌分离株-库特氏菌是革兰氏阳性的，能动的，过氧化氢酶阳性的，和能够还原硝酸盐和水解淀粉。本发明还提供制备用于中和纺织工业碱性废水(pH-12.00-11.5)的细菌库特氏菌(MTCC 5181)的细菌分离株，其保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度，该方法包括a)通过以1∶1-1∶2的比率，100-120rpm和35-37℃下，将污物提取物加入在基本碳酸盐培养基中72-96小时，富集被细菌污染的污物；b)通过使用所述基本碳酸盐培养基，在pH1.5-12.00和35-37℃下培养细菌8-10小时；c)在达到大量生长(O.D.1.5-2.0)后，通过离心获自步骤(b)的培养物来分离所述细菌，以获得细菌细胞的沉淀；d)将获自步骤(c)的沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中；e)通过向废水中加入从步骤(d)中获得的细菌沉淀来中和纺织工业的碱性废水(pH12.00-11.5)。
在本发明的一个实施方案中，被污染的污物获自位于印度昌迪加尔纺织工业的流出物处理工厂的管道。
在本发明的另一个实施方案中，通过取5-7g高压灭菌瓶中的新鲜污物进行来自所述位置的污物的富集，所述灭菌瓶中含有100-110ml污物提取物，50μl Candid B(抗真菌)和基本碳酸盐培养基。
在本发明的另一个实施方案中，通过在约4000rpm下离心灭菌的污物混和物约20分钟来制备污物提取物。
在本发明的另一个实施方案中，通过以约1∶3的比率将干燥的污物溶解在蒸馏水中，并在约15psi下高压灭菌约1小时来制备灭菌的污物混和物。
在本发明的另一个实施方案中，基本碳酸盐培养基包含约1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/体积比的葡萄糖，细菌培养用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸钠。
在本发明的另一个实施方案中，将污物提取物和基本碳酸盐培养基的混和物用于捕获所述位置的最大限度的细菌菌群。
在本发明的另一个实施方案中，所述污物提取物和所述基本碳酸盐培养基的比率是1∶1-1∶2。
在本发明的另一个实施方案中，在确定的条件如培养基，温度，pH，碳源下来培养分离的细菌分离株。
在本发明的另一个实施方案中，对于所有的细菌分离株(总共三株)，检查它们在短时间内降低纺织废水pH的中和能力。
在本发明的另一个实施方案中，通过pH计监测pH的降低。
在本发明的另一个实施方案中，选择能够在约2小时的短时间内降低碱性纺织废水pH的细菌。
在本发明的另一个实施方案中，在利用基本碳酸盐培养基，接着在37℃/120rpm下温育8小时的确定的条件下培养选择的细菌，用于中和碱性纺织工业废水。
在本发明的另一个实施方案中，在达到大量(heavy)生长O.D.(1.5)后，在5000-7000rpm，1-4℃下离心生长培养物。
在本发明的另一个实施方案中，将细菌沉淀溶解在磷酸盐缓冲液(pH6.8)中。
在本发明的另一个实施方案中，通过向200ml废水中加入细菌沉淀来进行高碱性纺织工业废水的中和，当通过pH计所检测时，在2-1.5小时中观察到将pH从12.0-11.5降低到7.5-7.00。
在本发明的另一个实施方案中，将细菌库特氏菌用作全细胞。
发明详述本发明提供了细菌分离株-库特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度。该细菌分离株-库特氏菌(MTCC 5181)能够中和纺织工业的高碱性废水。
该细菌分离株能够在pH为10-12.00的培养基中生长。
已经观察到该细菌分离株还能够在短的时间内(约2小时)将纺织工业废水的pH(12.0-11.5)降低到中性pH(7.5-7.00)。以1∶5-1∶10的比率，将该分离株以细菌沉淀的形式用于将纺织工业废水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。
该细菌分离株分离自位于印度昌迪加尔的纺织工业的流出物处理工厂管道中积累的污物，该管道已经长时间通过碱性废水。该细菌分离株是革兰氏阳性的，能动的，过氧化氢酶阳性的，能够还原硝酸盐和水解淀粉。
制备细菌库特氏菌(MTCC 5181)的细菌分离株的方法包括以下步骤a)通过以1∶1-1∶2的比率，100-120rpm和35-37℃下，将污物提取物加入在基本碳酸盐培养基中72-96小时，富集被细菌污染的污物；b)通过使用所述基本碳酸盐培养基，在pH1.5-12.00和35-37℃下培养细菌8-10小时；c)在达到大量生长(O.D.1.5-2.0)后，通过离心获自步骤(b)的培养物来分离所述细菌，以获得细菌细胞的沉淀；d)将获自步骤(c)的沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中；e)通过向废水中加入从步骤(d)中获得的细菌沉淀来中和纺织工业的碱性废水(pH12.00-11.5)。
被污染的污物获自位于印度昌迪加尔纺织工业的流出物处理工厂的管道。通过取5-7g高压灭菌瓶中的新鲜污物进行来自所述位置的污物的富集，所述灭菌瓶中含有100-110ml污物提取物，50μl Candid B(抗真菌)和基本碳酸盐培养基。
通过在约4000rpm下离心灭菌的污物混和物约20分钟来制备污物提取物。通过以约1∶3的比率将干燥的污物溶解在蒸馏水中，并在约15psi下高压灭菌约1小时来制备灭菌的污物混和物。
基本碳酸盐培养基包含约1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/体积比的葡萄糖，细菌培养用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸钠。将污物提取物和基本碳酸盐培养基的混和物用于捕获所述位置的最大限度的细菌菌群。所述污物提取物和所述基本碳酸盐培养基的比率是1∶1-1∶2。
在确定的条件下如培养基，温度，pH，碳源等来培养分离的细菌分离株。对于所有的细菌分离株(总共三株)，检查它们在短时间内降低纺织废水pH的中和能力。通过pH计监测pH的降低。基于它在约2小时的短时间内降低碱性纺织废水pH的能力来选择细菌。
在利用基本碳酸盐培养基，接着在37℃/120rpm下温育8小时的确定的条件下培养选择的细菌，用于中和碱性纺织工业废水。在达到大量生长O.D.(1.5)后在5000-7000rpm，1-4℃下离心生长培养物。将细菌沉淀溶解在磷酸盐缓冲液(pH6.8)中。
通过向200ml废水中加入细菌沉淀来进行高碱性纺织工业废水的中和，如通过pH计所检测，在2-1.5小时中观察到将pH从12.0-11.5降低到7.5-7.00。
如果需要，将细菌库特氏菌用作全细胞。
将本发明关注的细菌菌株保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度。
S.No.培养物 MTCC ID No.
1库特氏菌(MTCC 5181)上述细菌菌株显示在确定的条件下，在1.5-2小时的短时间内能够中和高碱性纺织工业废水的显著能力。本发明的细菌菌株分离自位于印度昌迪加尔的纺织工业流出物处理工厂管道中积累的污物。为了分离潜在的细菌分离株，100-110ml污物提取物；100-110ml基本碳酸盐培养基和50μlCandid B(抗真菌)。基本碳酸盐培养基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。将碳酸钠(10％)单独灭菌，并添加以获得1％浓度和培养基的最初pH值为10.5。将富集瓶在35-37℃、100-120rpm下放置约72-96小时。
为了制备污物提取物，取1kg污物，并在50℃干燥2小时。将400g干燥的污物溶解在960ml一次蒸馏的水中，并在15lbs下高压灭菌1小时。高压灭菌后，将样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液(提取物)，并存储在无菌瓶中，用于制备富集瓶和进一步使用。
将富集的污物样品系列稀释在0.85％盐水中。将10μl来自每个个体稀释物样品平铺到琼脂培养板上，该培养板含有污物提取物和50％基本碳酸盐培养基。基本碳酸盐培养基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。将碳酸钠(10％)单独灭菌，并添加以获得1％浓度和培养基的最初pH值为10.5。将如此获得的平板倒置在37±2℃下温育24-96小时。
在克隆形态学和颜色的基础上，选择总共3株细菌分离株，以检测它们中和碱性废水的能力。挑取单个分离的克隆，并在新鲜的平板上划线，所述平板含有相同的培养基。重复上述步骤，直至获得纯净的克隆。
为了检查三株分离细菌的中和能力，在玻璃瓶的三个位置取200ml高pH(12.0-11.5)的纺织工业废水，独自加入每种细菌生长物。用pH计监测pH的降低。
三株细菌中，发现仅1株分离株能够在高pH(12.0-11.5)下生长，并且在1.5-2小时的短时间内降低废水的pH。将该细菌鉴定为库特氏菌，其主要特征如下细菌-库特氏菌在性质上是需氧的，是革兰氏阳性的，在25-42℃温度范围内显示最佳生长，能够在高pH环境(pH12.00)中生长，能够水解淀粉，是能动的，过氧化氢酶阳性的合还原硝酸盐。在中和实验中，纺织工业废水取自地方纺织工业。将如上述筛选的细菌库特氏菌接种在200-220ml基本碳酸盐培养基中。在振荡(100-120rpm)条件下，于35-37℃下温育培养物8小时。观察到大量细菌生长(光密度(O.D＝1.5))后，在约1-4℃，5000-7,000rpm下离心培养物。按照沉淀的大小，将培养物沉淀溶解在约20ml磷酸盐缓冲液中。将该沉淀添加到含有200ml纺织工业废水(pH12.0-11.5))的烧瓶中。将该烧瓶放置在振荡条件下(100-120rpm)。在1.5-2小时后观察到pH的降低。在1.5-2小时的短时间内，该细菌库特氏菌(MTCC 5181)已经能够将pH从12-11.5降低到7.5-7。通过pH计监测pH。
本发明还提供了一种制备用于中和碱性废水的细菌生长物的方法a)利用污物提取物和基本碳酸盐培养基富集所述位置的污物，以分离具有中和能力的细菌；b)利用污物提取物和基本碳酸盐培养基的混和物从所述位置捕获需要的潜在细菌，所述培养基包含约1％(w/v)葡萄糖，约0.5％细菌培养用蛋白胨，约0.5％酵母提取物，约0.13％K2HPO4·3H2O，和约0.02％MgSO4·7H2O。将碳酸钠(约10％)单独灭菌，并添加以获得1％浓度和最初pH值为10.5；c)在如培养基，温度，pH，碳源等的确定条件下培养分离自具体位置的所述细菌；d)通过将分离的细菌分离株接种在200-220ml碱性纺织工业废水中来检查分离的细菌分离株的中和能力；e)通过pH计监测pH的降低；f)选择可以在短时间内中和碱性废水的细菌分离株；g)在确定的条件下培养所选择的细菌，用于中和碱性纺织工业废水。使用基本碳酸盐培养基来培养培养物。将培养烧瓶在35-37℃、100-120rpm下温育8小时，以便获得大量生长；h)在达到大量生长O.D.(1.5)后，离心得到的培养物；
i)收集细菌沉淀并溶解在磷酸盐缓冲液中；j)通过将细菌沉淀加入到200ml废水中来中和高碱性纺织工业废水。如通过pH计所检查，在1.5-2小时观察到pH从12.0-11.5降低到7.5-7.00。
下述实施例是用于举例说明，因此不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1在开发嗜碱性细菌的努力中，进行战略分离以从位于印度昌迪加尔德纺织工业流出物处理工厂管道中积累的污物捕获潜在的细菌群，该管道已长时间通过碱性废水。从所述管道收集积累的污物以分离细菌。
为了分离潜在的细菌分离株，将5g来自所述位置的污物添加到500ml高压灭菌瓶中，所述高压灭菌瓶包含100ml污物提取物；100ml基本碳酸盐培养基和50μl Candid B(抗真菌)。基本碳酸盐培养基包含1％(w/v)葡萄糖，0.5％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。将碳酸钠(10％)单独灭菌，并添加以获得1％浓度和培养基的最初pH为10.5。将富集瓶在37℃，120rpm下放置96小时。为了制备污物提取物，取1kg污物，并在50℃干燥2小时。
将400g干燥的污物溶解在960ml一次蒸馏的水中，并在15lbs下高压灭菌1小时。高压灭菌后，将样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液(提取物)，并存储在无菌瓶中，用于制备富集瓶和进一步应用。将富集的污物样品系列稀释在0.85％盐水中。100μl来自每个个体稀释物的样品平铺到琼脂培养板上，该培养板含有污物提取物和50％基本碳酸盐培养基。所述基本碳酸盐培养基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。将碳酸钠(10％)单独灭菌，并添加以获得1％浓度和培养基的最初pH为10.5。将如此获得到平板在37±2℃下倒置温育24-96小时。
在菌落形态学和颜色的基础上，选择总共3株细菌分离株以检测它们中和碱性废水的能力。挑取单个分离的克隆，并在新鲜的平板上划线，所述平板含有相同的培养基。重复上述步骤，直至获得纯净的克隆。
实施例2为了开发中和碱性纺织工业废水的潜在细菌，从已长时间通过纺织工业废水的管道中分离总共三株细菌。选择这些细菌分离株，以检查它们中和碱性废水的能力。挑取单个分离的克隆并在新鲜的琼脂平板上划线，所述平板含有相同的培养基。重复上述步骤直至获得纯净的克隆。
为了检查三株分离细菌的中和能力，在500ml玻璃瓶的三个位置取200ml高pH(12.00)的纺织工业废水，独自加入每种细菌生长物。用pH计监测pH的降低(表1)。
表1通过分离的嗜碱性细菌引起的碱性废水的pH减少
实施例3在菌落形态学和颜色的基础上，选择总共3株细菌分离株以检测它们中和碱性废水的能力。挑取单个分离的克隆，并在新鲜的平板上划线，所述平板含有相同的培养基。重复上述步骤，直至获得纯净的克隆。
三株细菌中，发现仅1株分离株(分离株2)-库特氏菌能够在高pH(12.00)下生长，并且在2小时的短时间内降低废水的pH(7.04)。将该细菌鉴定为库特氏菌，其主要特征如下(a)在性质上是需氧的(b)革兰氏阳性的(c)在25-42℃显示适宜生长
(d)能在高pH(pH12.00)环境中生(e)能够水解淀粉(f)是能动的(g)是过氧化氢酶阳性的(h)还原硝酸盐实施例4为了观察所筛选的细菌库特氏菌在合适培养基上的生长，将来自库特氏菌琼脂平板的两个接种环在营养肉汤培养基和基本碳酸盐培养基的平板上划线。基本碳酸盐培养基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。将碳酸钠(10％)单独灭菌，并添加以获得1％浓度和培养基的最初pH为10.5。将如此获得到平板在37±2℃下倒置温育24-96小时。
含有2％琼脂的NB培养基具有约7的最初pH，而BCM培养基具有10.5的最初pH。为了增加培养基的pH，使用Tris-HCL和Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
表2显示库特氏菌在NB和BCM培养基上的生长
+非常差生长++较差生长；+++良好生长；++++非常良好地生长。
观察到高pH的BCM培养基是生长库特氏菌的合适培养基。
实施例5
还用冻干的库特氏菌粉末中和碱性纺织废水。将40ml培养物(O.D.＝1.5)的细菌沉淀冻干，并添加到500ml含有200ml碱性纺织废水的烧瓶中。
将接种的烧瓶在37℃保持2小时。在2小时内观察到pH的降低(表3)。
将实验进行一式两份(组1和组2)表3通过库特氏菌的冻干细菌粉末引起的碱性废水pH降低
益处1.利用库特氏菌中和碱性纺织废水是经济和有效的方法。在常规的酸-中和方法中，利用酸的特性(tone)来进行中和，而在所开发的生物方法中，极大地降低了成分。
2.通过生物手段中和碱性纺织废水是相当安全的方法，原因在于由于强酸对工人的健康以及工业方法有危险作用，导致利用大量的酸中和废水对于工业而言是不安全的。除此之外，利用大量的酸还增加了排出到主要河流中的工业废水的体积。
权利要求
1.细菌分离株-库特氏菌(Kurthia sp.)(MTCC 5181)，其保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度。
2.权利要求1的分离株，其中所述分离株能够在pH为10.00-12.00的培养基上生长。
3.权利要求1的分离株，其中所述细菌分离株能够在约2小时的短时间内将纺织工业废水的pH(12.0-11.5)降低至中性pH(7.5-7.00)。
4.权利要求1的分离株，其中当以1∶5-1∶10的比率使用时，所述细菌分离株能够将纺织工业废水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。
5.权利要求1的分离株，其中所述细菌分离株分离自位于印度昌迪加尔的纺织工业的流出物处理工厂的已通过碱性废水的管道中所积累的污物。
6.权利要求1的分离株，其中所述细菌分离株库特氏菌是革兰氏阳性的，能动的，过氧化氢酶阳性的，和能够还原硝酸盐和水解淀粉。
7.制备细菌库特氏菌(MTCC 5181)的细菌分离株的方法，所述分离株用于中和纺织工业的碱性废水(pH-12.00-11.5)，并保藏在布达佩斯条约认可的国际保藏机构IMTECH，39A区，昌迪加尔，印度，所述方法包括(a)通过将污物提取物加入到基本碳酸盐培养基富集被细菌污染的污物；(b)利用基本碳酸盐培养基培养细菌；(c)分离获自步骤(b)的培养物的细菌，以获得细菌细胞的沉淀；(d)将获自步骤(c)的沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中。
8.权利要求7的方法，其中将步骤(a)在100-120rpm和35-37℃范围的温度下进行72-96小时。
9.权利要求7的方法，其中所述污物提取物对基本碳酸盐培养基的比率是1∶1-1∶2。
10.权利要求7的方法，其中将细菌在1.5-12.00的pH，35-37℃的温度下，在步骤(b)中培养8-10小时。
11.权利要求7的方法，其中在通过测定光密度，直至光密度达到1.5-2.0的范围而确定的大量生长后，通过离心在步骤(c)中分离步骤(b)中获得的培养物。
12.权利要求7的方法，其中污染的污物获自位于印度昌迪加尔的纺织工业流出物处理工厂的管道。
13.权利要求7的方法，其中通过取5-7g高压灭菌瓶中的新鲜污物进行污物的富集，所述高压灭菌瓶中含有100-110ml的污物提取物，50μlCandid B(抗真菌)和基本碳酸盐培养基。
14.权利要求7的方法，其中通过在约4000rpm下离心无菌的污物混和物约20分钟来制备提取物。
15.权利要求14的方法，其中通过以约1∶3的比率在蒸馏水中混合干燥的污物，和在约15psi下高压灭菌该混和物约1小时来制备无菌污物混和物。
16.权利要求7的方法，其中所述基本碳酸盐培养基含有比率约为1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/体积的葡萄糖，细菌培养用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O和碳酸钠。
17.权利要求7的方法，其中在培养基、温度、pH和碳源的确定条件下培养所述分离的细菌分离株。
18.权利要求7的方法，其中在达到通过光密度约为1.5确定的大量生长后，在5000-7000rpm，1-4℃下离心生长的培养物。
19.权利要求7的方法，其中将细菌沉淀溶解在pH约为6.8的磷酸盐缓冲液中。
20.中和纺织工业碱性废水的方法，其包括向其中加入细菌库特氏菌细菌分离株(MTCC 5181)的细胞沉淀，以将碱性废水的pH从pH12.00-11.5降低到范围为7.5-7.00的中性pH。
21.权利要求20的方法，其中所述方法包含(a)通过将污物提取物加入到基本碳酸盐培养基来富集被细菌污染的污物；(b)利用基本碳酸盐培养基培养细菌；(c)从获自步骤(b)的培养物中分离细菌，以获得细菌细胞的沉淀；(d)将获自步骤(c)的沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中；(e)通过向废水中加入获自步骤(d)的细菌沉淀来中和纺织工业的碱性废水(pH-12.00-11.5)。
22.权利要求21的方法，其中将步骤(a)在100-120rpm和35-37℃范围的温度下进行72-96小时。
23.权利要求21的方法，其中污物提取物与基本碳酸盐培养基的比率在1∶1-1∶2的范围内。
24.权利要求21的方法，其中在1.5-12.00的pH和35-37℃的温度下，在步骤(b)中培养细菌8-10小时。
25.权利要求21的方法，其中在通过测量光密度直至光密度达到1.5-2.0而确定大量生长后，通过离心在步骤(c)中分离步骤(b)中获得的培养物。
26.权利要求21的方法，其中被污染的污物获自位于印度昌迪加尔的纺织工业的流出物处理工厂的管道。
27.权利要求21的方法，其中通过取5-7g高压灭菌瓶中的新鲜污物进行污物的富集，所述高压灭菌瓶中含有100-110ml的污物提取物，50μlCandid B(抗真菌)和基本碳酸盐培养基。
28.权利要求21的方法，其中通过在约4000rpm下离心无菌的污物混和物约20分钟来制备污物提取物。
29.权利要求28的方法，其中通过以约1∶3的比率将干燥的污物溶解在蒸馏水中和将混和物在约15psi下高压灭菌约1小时来制备无菌污物混和物。
30.权利要求21的方法，其中所述基本碳酸盐培养基包含比率约为1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/体积的葡萄糖，细菌培养用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸钠。
31.权利要求21的方法，其中在培养基、温度、pH和碳源的确定条件下培养所述分离的细菌分离株。
32.权利要求21的方法，其中在通过约1.5的光密度确定的大量生长后，在5000-7000rpm，1-4℃下离心生长培养物。
33.权利要求21的方法，其中将细菌沉淀溶解在pH约为6.8的磷酸缓冲液中。
34.权利要求21的方法，其中在确定的时间中检查在步骤(d)的结尾获得的所有细菌分离株降低纺织废水的pH的中和能力。
35.权利要求21的方法，其中通过pH计监测pH的降低。
36.权利要求21的方法，其中通过利用细菌培养用碳酸盐培养基，接着在37℃和120rpm下温育8小时，培养所选择的细菌。
37.权利要求21的方法，其中通过将细菌沉淀加入到200ml废水中以在2小时-1.5小时的时间内用pH计测量将pH从12.0-11.5降低到7.5-7.00来实现纺织工业的高碱性废水的中和。
38.权利要求21的方法，其中将细菌库特氏菌用作全细胞。
39.权利要求21的方法，其中相对于废水，以1∶5-1∶10的比率使用细菌沉淀。
40.权利要求21的方法，其中所述细菌分离株库特氏菌是革兰氏阳性的，能动的，过氧化氢酶阳性的，能够还原硝酸盐和水解淀粉。
全文摘要
本发明提供一种新的通过在印度分离的细菌菌株来中和纺织工业废水的方法。该分离的细菌菌株能够在2小时内将废水的pH从12.00降低到7.00单位。与通过化学手段进行的常规中和相比，通过这种生物技术方法进行的碱性纺织工业废水的中和是高度有效和经济的。这种生物技术方法在产生碱性废水的纺织工业中可发现广泛的商业应用。
文档编号C02F103/30GK101090872SQ200480044739
公开日2007年12月19日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者丽塔·库马尔, 阿尼尔·库马尔 申请人:科学与工业研究委员会