专利名称：一种新型锰矿土壤微生物修复剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，特别是，提供了一种新型锰矿土壤微生物修复剂及其制备方法。
背景技术：
重金属含量高、营养贫乏、酸碱度不适宜和持水力弱等因素造成锰尾矿渣堆存地域植被缺乏，水土流失严重，重金属随雨水与扬尘扩散。锰尾矿渣已成为一种锰矿地区重要的污染源。通过筛选和栽培适宜植物，同时采作辅助措施，可在尾矿渣堆存区短时间内使植物定居，从而重建植被。有些植物能吸收固定重金属在其根部，有的植物能通过其根系分泌物及其凋落物的分解物与重金属结合形成难溶化合物，从而阻控重金属移迁扩散。重建的植被可控制土壤侵蚀和水土流失，增加土壤营养，恢复退化生态系统的功能和美化环境。在大面积尾矿渣污染区域重建植被，具有技术可靠、操作简便、成本低、控制污染物有效和对环境友好等多重优势。在尾矿渣堆放区进行植被重建时，选择的植物应具有吸收污染物能力强或根部吸收能力强，生长快，根系发达，耐旱性强和对重金属耐受性强等特征；选择耐土壤贫瘠的植物，通过植物一微生物的联合修复，增加土壤的营养。目前，很多的锰矿的尾矿库的矿渣堆放区上没有植被，我们通过试验研究发现，尾矿渣堆放区中的矿渣的酸碱度是植物在上面生存的重要限制因子，由于矿渣的碱性和有机质的缺乏，导致了植物不能在尾矿区土壤中生长，因此在植物微生物联合修复时，要采用强化调控措施能促进植物在尾矿上生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型锰矿土壤微生物修复剂及其制备方法，该新型锰矿土壤微生物修复剂与植物结合起来，可以使植物美洲商陆在锰尾矿渣上生长良好，从而改良矿山生态环境，控制污染，可广泛用于矿山污染控制的优点。一种新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征是，步骤如下
(1)分离菌株取蓖麻根际土样、水和数粒玻璃珠，加入已灭菌瓶中，置于转速为150 r/ min、温度为27. 5°C的摇床中振荡，取悬浮液做浓度梯度分别为10_2、10_3、10_4、10_5的菌悬液，吸取不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均勻二8°C培养箱中倒置培养；经7 培养后，观察培养基中微生物的生长情况。(2)纯化菌株采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500mg/L的马丁氏固态培养基中，28°C培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株。(3)驯化菌株将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为 11000mg/L、16500 mg/L、22000 mg/L、27500 mg/L、33000 mg/L 的液态培养基中，置于温度为^°C、转速为150 r/min的摇床中培养，筛选出4#菌为高抗锰的菌株。(4)制作斜面菌种将PDA培养基分装于灭菌的试管中，灭菌后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27. 5°C温箱中培养，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用。(5)摇瓶培养二级菌种采用淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和水配制培养基，用10%氢氧化钠调PH值7. 2-7. 4，用三个锥形瓶分装，高压灭菌， 取出降温到40°C不烫手为止，接4#菌种至摇床上振荡培养，直至菌丝形成，获得菌丝。(6)发酵罐培养
采用花生饼粉、蔗糖、硫酸铵、甘薯粉、玉米粉、蛋白胨、碳酸钙配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，然后将培养基放入发酵罐，接入菌丝，连续搅拌，保持温度，通气量体积比为 1 0.5，保证发酵罐各阀门严密；培养菌丝至成熟，菌丝体粗壮，菌液黏稠有泡沫。(7)固体吸附、菌粉烘干
将稻谷皮、甘薯粉、麸皮、肥土、炉灰和黄豆饼粉进行灭菌，然后采用其中的两种或两种以上的原料配制固体吸附剂，放入采用甲醛和硫磺熏蒸灭菌过的培养室，然后接种菌丝，培养4-5天，35-45 °C烘干，得菌粉。所述步骤(1)中的蓖麻根际土样为根周围2mm的土样；所述步骤(4)中的PDA培养基采用马铃薯200份、蔗糖20份，琼脂20份和水1000份配制而成；所述步骤(5)中的培养基采用淀粉2份、葡萄糖1份、花生饼粉2份、蛋白胨0. 4份、硫酸铵0. 25份、硫酸镁0. 025 份、磷酸氢二钾0. 02份和水1000份配制而成；所述步骤(6)中的培养基采用花生饼粉3份、 蔗糖份、硫酸铵0. 25份、甘薯粉2份、玉米粉1份、蛋白胨0. 1份和碳酸钙0. 5份配制而成。作为优选方案一，所述固体吸附剂采用稻谷皮90份、甘薯粉10份配制而成，此时的接种菌丝的重量为固体吸附剂的100%。作为优选方案二，所述固体吸附剂采用麸皮10份、炉灰30份和肥土 60份配制而成，此时接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。作为优选方案三，所述固体吸附剂采用黄豆饼粉10份、肥土 60份、炉灰20份和麸皮10份配制而成，此时接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。所述稻谷皮、甘薯粉、黄豆饼粉、麸皮经121°C蒸汽灭菌Ih ；所述肥土、炉灰在烘炉上160°C灭菌lh。一种按照所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法制备的新型锰矿土壤微生物修复剂。本发明的有益效果本发明新型锰矿土壤微生物修复剂是基于锰尾矿渣的酸碱度、有机质和有效营养元素含量为基础产生的，其含有丰富的有机质，可提高保水性，局部中和锰尾矿渣的碱性，可较长时间为植物美洲商陆生长提供所需要的营养元素，提高一些必需元素的利用效率。可以使美洲商陆短时间内在锰矿污染地区大量生长，在第一次人工栽培后，不需再次播种。美洲商陆根部能大量富集锰等元素，锰元素固定效率高，从而可以有效地修复锰矿污染的土壤。下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明。
具体实施例方式实施例1
新型微生物修复剂的制备方法，步骤如下
(1)取蓖麻根际土样IOg加到含90ml水和数粒玻璃珠的已灭菌250ml三角瓶中，置于摇床中(设定为150 r/min，温度27. 5°C)振荡20min，取悬浮液做浓度梯度各为10_2、10_3、 10_4、10_5，(吸取悬浮液Iml于含9ml水试管(已灭菌)中，此时菌悬液浓度为ΚΓ1，从该浓度菌悬重复上述步骤，得浓度为10_2的菌悬液，依此类推，得浓度分别为10_3、10_4、10_5的菌悬液)；各自吸取0.1 ml不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均勻， 培养箱中倒置培养；经7 培养后，观察平板培养基中微生物的生长情况。(2)采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500 mg/L的马丁氏固态培养基中，28°C培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株。(3 )将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为 11000 mg/L、16500 mg/L,22000 mg/L,27500 mg/L,33000 mg/L 的液态培养基中(28°C， 150 r/min钟摇床培养3天)，结果4#菌株能在27500 mg/L培养基中大量生长，而在33000 mg/L培养基中微量生长，其它菌株均不能在27500 mg/L培养基中生长。由此筛选出4#菌种为高抗锰的菌株。(4)采用PDA培养基(马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g水1000 ml pH自然) 100ml，分装于经烘箱170°C灭菌的试管中，塞上棉塞，上面用两层牛皮纸包扎好，121°C灭菌 20 min0取出后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27. 5°C温箱中培养4天， 菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用。(5)配制培养基(淀粉2g，葡萄糖lg，花生饼粉20g，蛋白胨4g，硫酸铵2. 5g，硫酸镁2. 5g，磷酸氢二钾2g，水1000 ml)用10%氢氧化钠调pH值7. 2-7. 4，用1000 ml锥形瓶分装，每瓶300 ml，经121 °C高压灭菌20 min，取出降温到40°C不烫手为止，接4#菌种至摇床上振荡培养。从孢子萌发到菌丝形成的开始阶段，菌龄大约M-36 h。在这个发育过程中受营养、PH值的影响所左右。(6)采用花生饼粉3g，蔗糖lg，硫酸铵0.25g，甘薯粉2g，玉米粉lg，蛋白胨0. Ig, 碳酸钙0. 5g配制培养基，放入消毒灭菌后的发酵罐，然后将菌丝接入发酵罐内，保持罐温 ^°C，通气量1 0.5(体积比)连续搅拌，经常注意各阀门是否严密，否则使蒸汽水进入罐内造成菌的生长不良。在正常情况下菌体生长良好一般培养48 h即可放罐。放罐后观察， 菌液黏稠，有微量泡沫，呈微红色，有冰片香味，镜检菌丝量多，菌丝体粗壮。(7)采用稻谷皮90g，甘薯粉IOg配制固体吸附剂。配制时，将稻谷皮、甘薯粉在烘炉上经160°C灭菌Ih后取出，放在培养室内(经甲醛和硫磺熏蒸灭菌)，待料降温到40°C 左右接种。菌液与固体吸附剂按1:1比例接种，接种放入通风池内培养后，含菌量可达 130-200 X IO8 个/g。(8)烘干温度在；35-45°C为宜。经过培养4_5天，菌粉装入烘干池20_40 cm，烘干过程翻动数次，烘干时间12-24 h，即得锰矿土壤微生物修复剂。实施例2
在步骤(7)中，采用麸皮10g，炉灰30g，肥土 60g配制固体吸附剂。配制时，麸皮经 121°C蒸汽灭菌1 h，肥土、炉灰在烘炉上经160°C灭菌1 h后取出，放在培养室内(经甲醛和硫磺熏蒸灭菌)，待料降温到40°C左右接种。菌液与固体吸附剂按2:5比例接种。其它同实施例1。实施例3
在步骤(7)中，采用黄豆饼粉10g，肥土 60g，炉灰20g，麸皮IOg配制固体吸附剂，配制时，黄豆饼粉、麸皮经121°C蒸汽灭菌1 h，肥土、炉灰在烘炉上经160°C灭菌1 h后取出，放在培养室内(经甲醛和硫磺熏蒸灭菌)，待料降温到40°C左右接种。菌液与固体吸附剂按2 5 比例接种。其它同实施例1。实施例4
按实施例1或实施例2或实施例3所述制备方法制备好锰矿土壤微生物修复剂，备用。采用菜籽饼15 kg、动物粪便20 kg、稻田土 40 kg、尿素5 kg、KH2PO4 10 kg、 (NH4)2SO4 12 kg、Ca (H2PO4)2 15 kg 和 CaS04 10 kg 配制混合肥料，备用；
(1)锰矿尾渣自然风干，磨碎过0.5 mm孔径筛，得纯锰矿尾渣，备用。将纯锰尾矿渣、 锰矿土壤微生物修复剂和混合肥料按质量比例3 1 1进行混合，得改良锰矿尾渣。选 6个花盆，3个装改良锰矿尾渣，3个装纯锰尾矿渣，装填量为3kg/盆，装好后每盆浇水600 ml，花盆下面放有不漏水的盘子，置于自然环境中，作为对照。(2 月上旬把美洲商陆的种子播入6个花盆内，播种后浇水3次。10天后统计美洲商陆种子的发芽率，发现纯锰矿尾渣发芽率虽然低于改良锰矿尾渣，但二者没有显著差异。(3) 4月统计美洲商陆幼苗的成活率，发现改良锰尾矿渣的平均成活率为90. 0%， 而纯锰尾矿渣植株成活率仅为10%。(4)9月，测定土壤pH值，有机质的含量，见表1，改良锰尾矿渣中的有机质明显高于对照组，PH值下降，更利于植物的生存。改良锰尾矿渣上的美洲商陆长势良好，并能产生大量的种子。表1 土壤中的有机质和pH值
权利要求
1.一种新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征是，步骤如下(1)分离菌株取蓖麻根际土样、水和数粒玻璃珠，加入已灭菌瓶中，置于转速为150 r/min、温度为 27. 5°C的摇床中振荡，取悬浮液做浓度梯度分别为10-2、10-3、10_4、10-5的菌悬液，吸取不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均勻二8°C培养箱中倒置培养；经 72h培养后，观察培养基中微生物的生长情况；(2)纯化菌株采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500mg/L的马丁氏固态培养基中，28°C培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株；(3)驯化菌株将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为 11000mg/L、16500 mg/L,22000 mg/L,27500 mg/L、33000mg/L 的液态培养基中，置于温度为^°C、转速为150 r/min的摇床中培养，筛选出4#菌为高抗锰的菌株；(4)制作斜面菌种将PDA培养基分装于灭菌的试管中，灭菌后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27. 5°C温箱中培养，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用；(5)摇瓶培养二级菌种采用淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和水配制培养基，用 10%氢氧化钠调pH值7. 2-7. 4，用三个锥形瓶分装，高压灭菌，取出降温到40°C不烫手为止， 接4#菌种至摇床上振荡培养，直至菌丝形成，获得菌丝；(6)发酵罐培养采用花生饼粉、蔗糖、硫酸铵、甘薯粉、玉米粉、蛋白胨、碳酸钙配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，然后将培养基放入发酵罐，接入菌丝，连续搅拌，保持温度，通气量体积比为 1 0.5，保证发酵罐各阀门严密；培养菌丝至成熟，菌丝体粗壮，菌液黏稠有泡沫；(7)固体吸附、菌粉烘干将稻谷皮、甘薯粉、麸皮、肥土、炉灰和黄豆饼粉进行灭菌，然后采用其中的两种或两种以上的原料配制固体吸附剂，放入采用甲醛和硫磺熏蒸灭菌过的培养室，然后接种菌丝，培养4-5天，35-45°C烘干，得菌粉，即新型微生物修复剂。
2.根据权利要求1所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中的蓖麻根际土样为根周围2mm的土样；所述步骤(4)中的PDA培养基采用马铃薯 200份、蔗糖20份，琼脂20份和水1000份配制而成；所述步骤(5)中的培养基采用淀粉2 份、葡萄糖1份、花生饼粉2份、蛋白胨0. 4份、硫酸铵0. 25份、硫酸镁0. 025份、磷酸氢二钾0. 02份和水1000份配制而成；所述步骤(6)中的培养基采用花生饼粉3份、蔗糖份、硫酸铵0. 25份、甘薯粉2份、玉米粉1份、蛋白胨0. 1份和碳酸钙0. 5份配制而成。
3.根据权利要求1所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征在于所述步骤三中的固体吸附剂采用稻谷皮90份、甘薯粉10份配制而成。
4.根据权利要求1所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征在于所述步骤三中的固体吸附剂采用麸皮10份、炉灰30份和肥土 60份配制而成。
5.根据权利要求1所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征在于所述步骤三中的固体吸附剂采用黄豆饼粉10份、肥土 60份、炉灰20份和麸皮10份配制而成。
6.根据权利要求3或4或5所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征在于所述稻谷皮、甘薯粉、黄豆饼粉、麸皮经121°C蒸汽灭菌Ih ；所述肥土、炉灰在烘炉上 160°C灭菌 Ih0
7.根据权利要求3所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征在于所述接种菌丝的重量为固体吸附剂的100%。
8.根据权利要求4或5所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征在于 所述接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。
9.一种按照权利要求1至8所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法制备的新型锰矿土壤微生物修复剂。
全文摘要
本发明公布了一种新型锰矿土壤微生物修复剂及其制备方法，从锰矿污染区生长的植物蓖麻的根际(根周围2mm)土壤中筛选获得一株高抗锰的菌株E1，初步鉴定为青霉菌。该菌株在液态培养基中的耐锰度达33000mg/L。筛选出对锰具有高耐受、吸附能力的菌株后，通过生物发酵技术，研制出新型锰矿土壤青霉菌修复剂，可与美洲商陆联合，吸附调控锰矿区重金属污染。本技术可应用于矿山退化生态系统的生态修复及矿区的绿化等方面。
文档编号B09C1/00GK102259110SQ201110121299
公开日2011年11月30日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年5月11日
发明者冯涛, 向言词, 李会东 申请人:湖南科技大学