专利名称：重金属污染土壤菌根植物根袋种植技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境保护领域，是一种重金属污染地进行植被恢复的新型植物种植方法，尤其适用于对植物生长有明显毒害的重金属污染土壤的植物修复。
背景技术：
目前，土壤作为人类赖以生存的生态环境的重要组成部分，受重金属污染日趋严重。全世界平均每年排放Hg约I. 5万吨，Cu340万吨，Pb500万吨，Mn 1500万吨，NilOO万吨。我国土壤重金属污染也相当严重，每年释放到环境中的有毒重金属高达数百万吨，其中 Pb 为 34. 6 万吨，Cd 为 3. 9 万吨(Nriagu 和 Pacyna, 1988)。
当前，我国区域农业环境恶化与农产品重金属污染现象十分严重，特别是在一些经济发达地区。目前，全国遭受不同程度污染的耕地面积已接近2000X 104hm2，约占耕地面积的1/5。据统计，1980年我国工业三废污染耕地面积266. 7X 104hm2，1988年增加到 666. 7X 104hm2，1992年增加至Ij 1000X 104hm2 (张从，2000)。农业部调查表明我国污灌区面积约140X 104h2，遭受重金属污染的土地面积占污染总面积的64.8%，其中轻度污染占46.7%,中度污染占9. 7%，严重污染面积占8. 4%，其中以Hg和Cd的污染面积最大。全国目前约有I. 3 X 10V耕地受到Cd的污染，涉及11个省市的25个地区(陈怀满，1996)。据报道，目前我国污灌区有11处生产的大米中Cd含量严重超标。例如，江西省某县多达44% 的耕地遭到污染，并形成670hm2的“镉米”区(李录久，2004)。我国因重金属污染导致的粮食减产超过1000 X 104t/a，被重金属污染的粮食约1200 X 104t/a，合计经济损失约200亿元/a(韦朝阳，2001)。因此，重金属污染土地的整治和改良，已经成为我国改善生态环境、 保障人民生命健康的首要任务。
土壤重金属污染治理主要采用物理、化学等工程措施，但这些方法工程量大、操作复杂、费用昂贵，有些还不能从根本上解决实际问题，容易造成二次污染。人们在后来的研究中发现，植物修复具有高效、投资低、易操作、不造成二次污染等优点，为从根本上解决土壤重金属污染提供了一条重要的修复和治理途径。上世纪80年代初，Bradley (1981)等在调查英国矿区植物时发现，在金属尤其是重金属含量很高的矿区，菌根植物比非菌根植物生长好。文章在NATURE上发表后，揭开了菌根植物抗重金属研究的新领域，也拉开了利用菌根植物进行重金属污染地修复的序幕。许多科学家，尤其是生态和生理学家，对重金属污染环境下菌根植物的生长和代谢反应进行研究，探讨在过量重金属胁迫环境下，菌根对寄主植物的可能保护作用和机理(Denny，1995 ；Diaz, 1996 ； Hart ley, 1997)，从而为应用菌根植物进行土壤修复提供理论基础。
到目前为止，人们应用很多方法来固定、富集、转移过量重金属铜、镉，而其中应用菌根植物积累固定重金属是一个实用而极具潜力的方法。例如，黄艺(2001)指出外生菌根能增加寄主植物对铜的积累，其地上部分的含量下降，地下部分含量增加；Cu处理外生菌根植物地下部分Cu含量是无菌根植物的2. 6倍。Jentschke (1999)研究发现接种Paxillus involutus的挪威松能耐受高浓度的Cd污染,并指出菌根对CM有较大的吸收和固定作用。因此，利用菌根植物修复铜、镉等重金属污染地具有重要的应用价值。
高浓度重金属污染土壤由于重金属对植物有较高的毒害，因此，植物往往生长缓慢或不能存活，采用大规模覆土的技术往往需要大量的外援覆盖土壤以及较昂贵的工程操作成本。本技术发明是通过一种根袋带土移栽的方法，通过根袋内放置少量非污染土，并在根袋内栽种菌根化植物，将此根袋(含土壤和植物)移栽到污染土壤中，可以提高植物的生物量和生存能力，同时提高植物吸收和固定土壤重金属的效果。尤其适用于对植物有明显毒害的高浓度污染土壤的植物修复。发明内容
本发明提供一种在重金属污染土壤的新型菌根化植物种植方法。
有益效果
本发明采用的菌根化植物种植方法，在根袋中种植接种了紫蜡蘑(Laccaria amethystea(bull. ExGray)Murr)的菌根化松树,将根袋埋置于不同浓度的Cu污染土壤中。 盆栽实验表明，菌根能促进植物的生长，使植物的生物量保持在一个较高的水平且不受根袋外污染土壤铜毒害的影响。虽然植物的根被限制在根袋内，但是，菌根可以穿过根袋从而扩大了植物的营养吸收范围，而且穿过根袋的菌根还能活化并促进Cu向植物根部的转运， Cu在植物根部、茎部以及针叶中的含量都随外界Cu浓度的增加而提高。说明，采用该技术，可以提高植物在高浓度铜污染土壤上的植物生存能力，且提高植物固定土壤重金属的效果，减少污染土壤重金属的迁移扩散。
图I实验装置简图
图2植物生物量
图3总Cu积累量
图4地上部磷含量
图5根系憐含量具体实施方式
I外生菌根的纯培养
外生菌根菌紫腊蘑(Laccariaamethystea (bu. Ex Gray)Murr) (LA)由本实验室保藏。(I)倒平板将MMN培养基配置好，混合均匀，高压蒸汽灭菌后倒平板。MMN培养基配方为麦芽糖 3g，葡萄糖 10g, (NH4)HPO4O. 25g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7Η200· 15g，，CaCl2O. 05g， FeCl3 · 6H200. 02g, NaClO. 025g, VB10. ImMg，琼脂 13g。
(2)切单菌块选取接种了 LA的MMN平板，在菌落边缘切出5mmX5mm的小块，倒扣与新的MMN平板中，封口，25°C培养I个月待用。
2菌根化植物的获取
(I)育苗红松(Pinus koraiensis S.)种子用30%的H2O2消毒30分钟后用去离子水冲洗干净，之后播种于蛭石中，25°C培养8个星期待用。
(2)菌根化在盆钵底部放置一张滤纸并撒Icm厚度的火山灰田园土 = I I混合基质。基质表面放置生长了一个月左右的LA菌落。生长了 8周左右的松树苗剪除部分侧根，将其根部与菌落接触，四周填满混合基质，菌根化三个月之后镜检。
3菌根化植物的检测
体式显微镜检测台上放一干净平板里面盛放15ml去离子水，将菌根化三个月之后的红松苗置于平板中，统计菌根侵染的侧根以及总侧根数目，侵染率为菌根侵染的侧根数/总侧根数。选取侵染率大于90%的菌根化苗进行下面的试验。
4Cu污染土壤的配制
人工添加O, I. 25，2. 5,5. 010. Omg/ml的CuSO4溶液于火山灰中，使土壤中的Cu浓度为0，375，750，1500，3000mg/kg，混合均匀。5种Cu处理的土壤121°C灭菌120min，冷却后分装到五个塑料盆钵中，每盆550g。
5根袋装置
50ml离心管的底部锯掉，在螺纹侧垫上2层40m孔径的尼龙网，因此植物的根部无法穿过尼龙网，而菌根是可以穿过的。每管离心管中移植两株菌根化幼苗(侵染率接近 100%),四周填充40g的无污染的火山灰土壤。5盆不同程度的Cu污染土壤盆钵分别放置 3管尼龙网离心管。
与尼龙网离心管相同，另外5管离心管同样切掉底部，螺纹侧不垫尼龙网，用盖子拧紧。每管离心管移栽2株菌根化幼苗，周围填充40g无污染的火山灰土壤。5盆不同程度的Cu污染土壤盆钵分别放置I管对照组离心管。
6植物的收获及金属测定
在植物移栽后的第120天收获植物，植物用去离子水清洗根部，之后分成地上部以及根系。80°C烘干72小时并称重，磨碎过筛使颗粒小于1mm。
样品中Cu含量的测定方法烘干的植物样品用玛瑙研钵磨碎混匀，称取植物干样 O. 2000g 置于消煮管中，用 HN03-HC104(V V = 87 13)混合液消煮(Zhao 等，1994)， analytikjena-nova400火焰原子吸收分光光度计(AAS)测定Cu含量。分析过程中，以美国国家标准和技术协会认准的标样NIST(SRM2709)作为QA/QC的一部分用于消煮。实验还中设置了适当的空白与重复以检测准确性与精确性。标准土样(NIST SRM2709)的重金属回收率将被控制在90±5%范围。分析所用试剂均采用优级纯，所用水均为去离子水。
图2显示了在Cu污染土壤中，接种外生菌根菌的植株在不同浓度Cu处理下植株地上部以及根系的干重。由图中可以看出，五种浓度的Cu处理下用尼龙网隔断的植株苗， 地上部生物量均高于对照组，分别为对照的I. 97、I. 94、I. 95、2. 24、2. 22倍；菌根化苗的根系的生物量也高于对照组，与对照相比，根系干重分别比对照高38. 4%、17. 9%、43. 4%,47.9%、14. 3%，可见根袋隔断对菌根化幼苗的生长有促进作用。
由图3和表I可知，根袋处理的菌根化苗根系吸收的Cu总量显著高于对照组菌根化苗根系吸收的Cu。这主要是因为菌丝可以透过尼龙网，扩大Cu的吸收范围，在高浓度Cu 污染土壤中更为明显。
表I不同水平铜污染土壤中根袋对菌根化松树苗吸收的总Cu量的影响 (μ g · pot-1)
权利要求
1.一种用于重金属污染土壤的菌根植物根袋种植技术，其特征在于根袋是用25至40 μ m孔径的尼龙网制成，体积I升至5升不等，根袋内装有对植物生长无毒害非污染土壤。根袋内种植菌根化的植物，植物的根系无法穿过尼龙网，而外生菌根真菌菌丝可以通过。将此根袋穴栽移植到重金属污染土壤中。
2.权利要求I所述的根袋装置在辅助植物在重金属污染土壤生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的接种的外生菌根真菌是紫蜡蘑(Laccaria amethystea(bull. Ex Gray)Murr)等可以与树木共生的外生菌根真菌，接种的植物是可以与外生菌根真菌形成共生的松树、栎树、柳树等。
全文摘要
本发明涉及环境保护领域，是一种重金属污染地进行植被恢复的新型植物种植方法，尤其适用于对植物生长有明显毒害的重金属污染土壤的植物修复。高浓度重金属污染土壤由于重金属对植物有较高的毒害，因此，植物往往生长缓慢或不能存活，采用大规模覆土的技术往往需要大量的外援覆盖土壤以及较昂贵的工程操作成本。本技术发明是通过一种根袋带土移栽的方法，通过根袋内放置少量非污染土，并在根袋内栽种菌根化植物，将此根袋(含土壤和植物)移栽到污染土壤中，可以明显提高植物的生物量和生存能力，同时提高植物吸收和固定土壤重金属的效果，尤其适用于对植物有明显毒害的高浓度重金属污染土壤的植被覆盖。
文档编号B09C1/10GK102921714SQ201210429188
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者陈亚华, 许璋阳, 沈振国, 夏妍, 王桂萍 申请人:南京农业大学