本发明涉及生物技术和微生态制剂领域。尤其涉及一种处理养殖水体氨氮的复合缓释微胶囊制剂的制备方法。
背景技术：
水产养殖过程中，大量剩余饵料和养殖动物排泄物在水体中积累，使水体环境恶化，包括氨氮和亚硝酸盐含量增加，溶解氧降低等，导致养殖动物病害频发，经济效益降低。因此养殖水环境控制是水产养殖的重中之重。微生态制剂是利用有益微生物加工而成的活菌制剂，在水产养殖中具有调控水质、拮抗病原菌、提高免疫力的作用。常用的益生菌主要有光合细菌、硝化细菌、乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等。
微胶囊技术是利用具有能够成膜的天然的或人工合成的高分子材料做为壁材，包覆芯材即功能性成分形成微胶囊，可以达到缓控释的作用。微胶囊的其他作用还有减少有效成分受外界环境影响，掩蔽芯材的不良气味，改善芯材的稳定性、流动性等性质，减少芯材在环境中的蒸发速率。利用微胶囊技术制备可处理水体氨氮的缓释复合微生态制剂，可以有效保护活菌，将其与恶劣环境隔绝，从而加快水体氨氮的去除效率。同时，增加制剂的持效期、稳定性，减少用量，以解决目前水产养殖用微生态制剂投料浓度受限、菌种受高氨氮养殖污水影响和制剂稳定性差、作用效果弱的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是针对水产养殖过程中水体氨氮增加，影响水生动物生存的问题，而提供一种处理养殖水体氨氮的复合缓释微胶囊制剂的制备方法。本法得到的微胶囊制剂能够解决活菌在恶劣水体环境中存活力不强，作用时间短，作用效果弱的问题。
本发明的技术方案为：一种处理养殖水体氨氮的复合缓释微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以菌数比1:1:1～1:2:3混合后接入活化培养基中，控制培养液体积装液量15～25％，活化培养温度为32～36℃，ph为7.0～7.5，转速为160～200r/min；活化培养24～48h后，获得种子液；
(2)发酵培养：以5～8％的体积接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度为32～37℃，ph为7.0～7.5，转速为160～200r/min；发酵培养24～48h后，离心收集芽孢，干燥；
(3)复合缓释微胶囊制备：①将乳清蛋白溶液在70～90℃下加热20～30min使其变性，冷却至室温；②将培养得到的芽孢加入变性乳清蛋白溶液中，使芽孢在变性乳清蛋白溶液中的质量分数为2％～5％，加入大豆油，随后按乳清蛋白溶液体积量添加cacl2和葡萄糖酸内酯分别为0.05～0.2g/l和2.0～5.0g/l的量，在30～50℃下加热4～6小时并以600～800r/min搅拌；离心过滤得到微胶囊；③将得到微胶囊与海藻酸钠溶液搅拌混合均匀后，过滤收集浸润后的微胶囊，将其重悬于含0.05～0.2mol/lcacl2的大豆油中后搅拌，过滤收集微胶囊，并用去离子水清洗以除去油相。
优选步骤(1)中活化培养基成分为(g/l)：葡萄糖5.0～10.0、蛋白胨5.0～10.0、牛肉膏2.0～5.0、nacl5.0～10.0。
优选步骤(2)中发酵培养基成分为(g/l)：葡萄糖5.0～10.0、蛋白胨5.0～10.0、牛肉膏5.0～8.0、nacl3.0～5.0、mgso4·7h2o1.0～2.0、k2hpo4·3h2o1.0～3.0、(nh4)2so43.0～5.0、维生素vh1.0～2.0；6000～8000r/min离心15～20min获芽孢，70～100℃鼓风机干燥。
优选步骤(3)的步骤②中大豆油的体积加入量为含芽孢的变性乳清蛋白溶液体积的1～5倍；离心转速为6000～8000r/min，离心时间为5～10min。
优选步骤(3)的步骤③中微胶囊质量与海藻酸钠溶液体积比为1:5～1:15g/ml；搅拌混合均匀的转速为180～200r/min，搅拌时间20～30min；悬于大豆油中后搅拌速度为400～500r/min，搅拌时间为20～30min。
优选步骤(3)的步骤①中乳清蛋白质量浓度为5％～10％；步骤(3)的步骤③中海藻酸钠溶液质量浓度为0.5％～2％。
上述的一种蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名bacilluscereus。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是cgmccno.4348，参据的微生物株njyh63305，保藏日期是2010年11月15日。一种枯草芽孢杆菌，菌种的拉丁学名bacillussubtilis。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是cgmccno.8734，参据的微生物株njwgyhyh20130799，保藏日期是2014年01月17日。一种地衣芽孢杆菌，菌种的拉丁学名bacilluslicheniformis.。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是cgmccno.6155，参据的微生物株njwgyh833051，保藏日期是2012年05月25日。以上三个菌种的保藏和存活证明分别在本课题组的以下三个专利中已经提供(1、专利号：zl201310006174.4一种纯化蜡样芽孢杆菌发酵液中抑菌蛋白的方法，2、专利号：zl201210464008.4一种地衣芽孢杆菌及多阶段发酵的方法，3、cn201710768507.5一种枯草芽孢杆菌冻干粉的制备方法)。
芽孢杆菌具有下述性质：
1、形态与培养特征：
(1)蜡状芽孢杆菌：革兰氏阳性大杆菌，长3－5μm，宽1.0－1.2μm，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。在肉汤培养基中浑浊生长并产生荚膜；在普通琼脂平板上形成直径达0.4－1.2cm的圆形凸起菌落，灰白色、不透明、边缘不整齐，表面粗糙，似毛玻璃，迎光呈白蜡样。
(2)枯草芽孢杆菌：为革兰氏阳性细菌，单个细胞一般0.7～0.8×2～3μm，无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大小0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
(3)地衣芽孢杆菌：革兰氏阳性菌，单个细胞一般0.6～0.8μm×1.5～3.0μm，有鞭毛，能运动，产芽孢，孢子轻微膨大或不膨大，无伴孢晶体。细胞形态为杆状、单生。芽孢为椭球状或柱状，孢子只是轻微膨大或不膨大，中生或偏中生。
2、生理生化特性:
菌株的主要生理生化特征见表1：
表1：蜡状芽孢杆菌的生理生化特征
表2枯草芽孢杆菌的生理生化特征
表3地衣芽孢杆菌的生理生化特征
注：+：阳性或生长；－：阴性或不生长
本发明公开了一种用于水产养殖的复合缓释微胶囊制剂的工艺方法，具有以下优点：
(1)采用复合芽孢杆菌作为主要功能菌种，其能够产生芽孢，芽孢具有抗性强的作用，在高温、紫外线、干燥等恶劣环境下均能生存，因此在微胶囊的制备过程中不会失活，在适合的环境条件下，芽孢能够重新萌发发挥作用。
(2)由于海藻酸钠胶体的多孔特性，当其作为壁材制备微胶囊时，不能在受到污染的水环境中完全保护其中的菌体，因此本专利采用乳清蛋白与海藻酸钠联用，形成结构致密的凝胶，以充分保护菌体。乳清蛋白营养价值高，含有免疫球蛋白、血清白蛋白、乳铁蛋白等多种活性成分，同时具有成胶性和成膜性，与海藻酸钠联用作为微胶囊的壁材能够使结构更为致密，同时其有较多碱性氨基酸残基，能够中和渗透进微胶囊内部的氢离子，使微胶囊内部环境ph保持稳定，为菌株提供良好的生长环境。
(3)本专利产品应用于南美白对虾养殖中，其水体控制ph为7.5～8.0之间，与对照组相比水体氨氮降解率达到78％，溶解氧含量高于3.0mg/l，南美白对虾存活率达到98％以上，达到了净化养殖水体和提高对虾免疫力、降低发病率的作用。
保藏信息
上述的蜡状芽孢杆菌，其分类命名为蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是bacilluscereus，参据的微生物：njyh63305，该菌株是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所)，其简称为cgmcc，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是cgmccno.4348。
上述枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.8734是由本实验室选育并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理保藏中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所)，其简称为cgmcc，登记入册的编号是cgmccno.8734，保藏日期是：2014年01月17日。
上述地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformiscgmccno.6155是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为cgmcc，登记入册的编号是cgmccno.6155，保藏日期是：2012年5月25日。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以菌数比1:1:1混合后接入活化培养基中，控制培养液体积装液量15％，活化培养温度为32℃，ph为7.0，转速为160r/min；活化培养24h后，获得种子液；其中活化培养基成分为(g/l)：葡萄糖5.0、蛋白胨5.0、牛肉膏2.0、nacl5.0。
(2)发酵培养：以5％的体积接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度为32℃，ph为7.0，转速为160r/min；发酵培养24h后，离心收集芽孢，干燥；其中发酵培养基成分为(g/l)：葡萄糖5.0、蛋白胨5.0、牛肉膏5.0、nacl3.0、mgso4·7h2o1.0、k2hpo4·3h2o1.0、(nh4)2so43.0、维生素vh1.0；6000r/min离心15min获芽孢，70℃鼓风机干燥。
(3)复合缓释微胶囊制备：①将质量浓度为5％乳清蛋白溶液在70℃下加热20min使其变性，冷却至室温。②将培养得到的芽孢加入变性乳清蛋白溶液中，使芽孢在变性乳清蛋白溶液中的质量分数为2％，加入上述含芽孢的变性乳清蛋白溶液1倍体积的大豆油，随后以0.05g/l和2.0g/l的量添加cacl2和葡萄糖酸内酯(按乳清蛋白溶液体积计算添加量)，在30℃下加热4小时并以600r/min搅拌。随后6000r/min离心5min，过滤得到微胶囊。③将得到的微胶囊与质量浓度为0.5％海藻酸钠溶液混合均匀，(微胶囊质量(g)：海藻酸钠溶液体积(ml)＝1:5)，180r/min搅拌20min后，过滤收集浸润后的微胶囊，将其重悬于含0.05mol/lcacl2溶液的大豆油中，400r/min搅拌20min，过滤收集微胶囊，并用去离子水清洗以除去油相。
(4)应用效果：南美白对虾养殖中，其水体控制ph为7.8±0.2，水体氨氮降解率为76.7％，溶解氧含量高于3.0mg/l，南美白对虾存活率达到98％。使用周期50天。
实施例2：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以菌数比1:1:2混合后接入活化培养基中，控制培养液体积装液量20％，活化培养温度为34℃，ph为7.2，转速为180r/min；活化培养30h后，获得种子液；其中活化培养基成分为(g/l)：葡萄糖8.0、蛋白胨8.0、牛肉膏4.0、nacl7.0。
(2)发酵培养：以6％的体积接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度为35℃，ph为7.3，转速为180r/min；发酵培养30h后，离心收集芽孢，干燥；其中发酵培养基成分为(g/l)：葡萄糖8.0、蛋白胨9.0、牛肉膏7.0、nacl4.0、mgso4·7h2o1.0、k2hpo4·3h2o2.0、(nh4)2so44.0、维生素vh1.5；7000r/min离心15min获芽孢，80℃鼓风机干燥。
(3)复合缓释微胶囊制备：①将质量浓度为8％乳清蛋白溶液在80℃下加热25min使其变性，冷却至室温。②将培养得到的芽孢加入变性乳清蛋白溶液中，使芽孢在变性乳清蛋白溶液中的质量分数为3％，加入上述含芽孢的变性乳清蛋白溶液3倍体积的大豆油，随后以0.1g/l和4.0g/l的量添加cacl2和葡萄糖酸内酯(按乳清蛋白溶液体积计算添加量)，在40℃下加热5小时并以700r/min搅拌。随后7000r/min离心10min，过滤得到微胶囊。③将得到微胶囊与的质量浓度为1％海藻酸钠溶液混合均匀，(微胶囊质量(g)：海藻酸钠溶液体积(ml)＝1:10)，200r/min搅拌25min后，过滤收集浸润后的微胶囊，将其重悬于含0.1mol/lcacl2溶液的大豆油中，500r/min搅拌25min，过滤收集微胶囊，并用去离子水清洗以除去油相。
(4)应用效果：南美白对虾养殖中，其水体控制ph为7.8±0.3，水体氨氮降解率为75.8％，溶解氧含量高于3.1mg/l，南美白对虾存活率达到98％。使用周期52天。
实施例3：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以菌数比1:2:3混合后接入活化培养基中，控制培养液体积装液量25％，活化培养温度为36℃，ph为7.5，转速为200r/min；活化培养48h后，获得种子液；其中活化培养基成分为(g/l)：葡萄糖10.0、蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、nacl10.0。
(2)发酵培养：以8％的体积接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度为37℃，ph为7.5，转速为200r/min；发酵培养48h后，离心收集芽孢，干燥；其中发酵培养基成分为(g/l)：葡萄糖10.0、蛋白胨10.0、牛肉膏8.0、nacl5.0、mgso4·7h2o2.0、k2hpo4·3h2o3.0、(nh4)2so45.0、维生素vh2.0；8000r/min离心20min获芽孢，100℃鼓风机干燥。
(3)复合缓释微胶囊制备：①将质量浓度为10％乳清蛋白溶液在90℃下加热30min使其变性，冷却至室温。②将培养得到的芽孢加入变性乳清蛋白溶液中，使芽孢在变性乳清蛋白溶液中的质量分数为5％，加入上述含芽孢的变性乳清蛋白溶液5倍体积的大豆油，随后以0.2g/l和5.0g/l的量添加cacl2和葡萄糖酸内酯(按乳清蛋白溶液体积计算添加量)，在50℃下加热6小时并以800r/min搅拌。随后8000r/min离心10min，过滤得到微胶囊。③将得到微胶囊与质量浓度为2％海藻酸钠溶液混合均匀，(微胶囊质量(g)：海藻酸钠溶液体积(ml)＝1:15)，200r/min搅拌30min后，过滤收集浸润后的微胶囊，将其重悬于含0.2mol/lcacl2溶液的大豆油中，500r/min搅拌30min，过滤收集微胶囊，并用去离子水清洗以除去油相。
(4)应用效果：南美白对虾养殖中，其水体控制ph为7.7±0.2，水体氨氮降解率为77.2％，溶解氧含量高于3.0mg/l，南美白对虾存活率达到99％。使用周期55天。