一种利用血红密孔菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用与流程

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种利用血红密孔菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用。

背景技术：

近年来，随着传统的溴代阻燃剂生烟量大、腐蚀性强和易释放有毒气体等缺点逐渐退出市场，有机磷阻燃剂(organophosphorusflameretardants，opfrs)作为溴代阻燃剂的理想替代品被大量生产和使用。磷酸三苯酯(triphenylphosphate，tphp)是常用的一种有机磷阻燃剂，磷酸三苯酯主要以掺杂、吸附等物理混合方式加入到各类产品中，因而很容易通过挥发、产品磨损、腐蚀和渗漏等方式从产品中脱离释放而进入自然环境，并随大气和水体的迁移造成环境污染。目前，在空气尘埃、水体、河流底泥和沉积物等多种环境介质都能检测到磷酸三苯酯的存在。通过环境暴露和食物链的传递，磷酸三苯酯还能同时在动物甚至人体内有不同程度的积累。残留在生物体内的磷酸三苯酯会对机体产生内分泌干扰性、生殖毒性、神经毒性和免疫毒性等多方面的毒害效应。因此，无论从生态系统的健康，还是从人类的安全角度考虑，开展磷酸三苯酯的降解和去除技术等研究，都是一项非常紧迫的任务。

目前，磷酸三苯酯的去除主要采用物理化学、生物方法予以去除，其中物理化学方法因其较高的运行成本、容易造成二次污染等诸多问题，不能成为污染治理的首选技术。微生物法降解/转有机污染物具有环境友好性和低成本性，因而成为水体有机污染修复的最安全、经济、有效途径。磷酸三苯酯微生物降解在实际应用过程中往往效率不高，且磷酸三苯酯的微生物降解由于缺乏有效降解菌种而受到限制，因此磷酸三苯酯高效降解菌的筛选及应用具有一定的研究意义。从目前专利的申请情况来看，主要有申请号为201610287265.3，名称为一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用，申请公开号为cn106006993a，申请号为201910912474.6，名称为一株可降解磷酸三苯酯的失野口鞘氨醇菌，申请公开号为cn110643534a，这些专利文件所采用的菌种都为细菌，而细菌对污染物的抗性较弱且对环境适应性也较差。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用血红密孔菌降解磷酸三苯酯的方法。

本发明的另一目的在于提供所述利用血红密孔菌降解磷酸三苯酯的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用血红密孔菌降解磷酸三苯酯的方法，包括以下步骤：

(1)将血红密孔菌进行培养，得到血红密孔菌的孢子液；

(2)将血红密孔菌的孢子液接种到液体培养基中培养至对数生长期，然后向液体培养基中加入磷酸三苯酯继续培养，以降解磷酸三苯酯。

步骤(1)所述的血红密孔菌的孢子液优选为通过如下方法获得：

(i)将血红密孔菌接种到pda平板培养基上进行培养，得到血红密孔菌孢子层；

(ii)将血红密孔菌孢子层从平板培养基上刮下，加入无菌生理盐水，纱布过滤，得到血红密孔菌的孢子液。

步骤(i)中所述的pda平板培养基的组成成分为：葡萄糖20g，kh2po43g，mgso4·7h2o1.5g，盐酸硫胺素0.001g，琼脂20g，马铃薯提取液1000ml，ph6.0。

所述的马铃薯提取液通过如下方法制备得到：取去皮马铃薯200g，切成小块，并加入500ml水，煮沸30min，然后将马铃薯块搅碎，过滤去除马铃薯渣块，再将获得的滤液补足至1000ml。

所述的过滤优选为采用双层纱布进行过滤。

步骤(i)中所述的培养的条件为：35℃～37℃静置培养4～5天；优选为：37℃静置培养5天。

步骤(ii)中所述的纱布优选为双层无菌纱布。

步骤(1)中所述的血红密孔菌优选为保藏号为cgmcc5.00815的血红密孔菌(pycnoporussanguineus)。

步骤(1)中所述的血红密孔菌的孢子液为od600为0.8～0.9的血红密孔菌的孢子液；优选为od600为0.85(2.0×10⁶cfu/ml)的血红密孔菌的孢子液。

步骤(2)中所述的血红密孔菌的孢子液接种量为体积百分比3％～5％；优选为体积百分比4％。

步骤(2)中所述的液体培养基的组成成分为：葡萄糖5g，l-天冬酰胺0.2g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.5g，cacl20.1g，mnso4·h2o0.01g，nacl0.005g，盐酸硫胺素0.001g，cuso4·5h2o0.002g，znso4·7h2o0.001g，alk(so4)20.0002g，h3bo30.0002g，namoo4·2h2o0.0002g，超纯水1000ml，ph4～6。

步骤(2)中所述的培养至对数生长期的培养条件为：30℃、160r/min恒温振荡培养3～4天；优选为：30℃、160r/min恒温振荡培养3天。

步骤(2)中所述的磷酸三苯酯的用量为按其在所述反应体系的终浓度为5～10mg/l添加计算。

步骤(2)中所述的继续培养的条件优选为：30℃、160r/min恒温振荡培养5～6天。

所述的利用血红密孔菌降解磷酸三苯酯的方法在降解磷酸三苯酯中的应用。

所述的磷酸三苯酯为水体的含有的磷酸三苯酯。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明提供了一种利用血红密孔菌降解磷酸三苯酯的方法，通过该血红密孔菌对磷酸三苯酯的快速高效降解，能够为其污染治理和生物修复提供技术方法。

2、本发明中的血红密孔菌对环境适应性强，对磷酸三苯酯的降解效果较好，使用此血红密孔菌降解污染物的成本较低。

附图说明

图1是磷酸三苯酯浓度-峰面积标准曲线图。

图2是接种血红密孔菌后磷酸三苯酯的降解情况图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂均可通过市售获得。

本发明中所涉及的血红密孔菌(pycnoporussanguineus)来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，菌种保藏号为cgmcc5.00815。

实施例1血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解分析

(1)将保存于4℃斜面上的血红密孔菌种用划线的方法转接至pda平板培养基上，置于37℃恒温培养箱中静置培养5d(天)，待平板表面长出大量白色粉状的孢子层，用无菌生理盐水冲洗平板，用无菌接种环轻轻将平板表面的孢子刮下，经双层无菌纱布过滤后，得到血红密孔菌的孢子液。利用分光光度计测定孢子液在600nm处的吸光值，用无菌生理盐水将孢子液稀释调节至吸光值为od600＝0.85，此时孢子液的浓度大约为2.0×10⁶cfu/ml；其中：

pda平板培养基的组成成分为：葡萄糖20g，kh2po43g，mgso4·7h2o1.5g，盐酸硫胺素0.001g，琼脂20g，马铃薯提取液1000ml，ph6.0；

其中，马铃薯提取液的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水500ml，煮沸30min，将马铃薯块搅碎，双层纱布滤去马铃薯渣块，将滤液补足至1000ml。

(2)将0.8ml上述血红密孔菌孢子液加入到19.2ml已灭菌的液体培养基中，在30℃、160r/min恒温振荡培养条件下培养3d，血红密孔菌开始进入对数生长期并在体系中形成大小较为均一的菌丝球，向培养体系中加入终浓度为5mg/l磷酸三苯酯，30℃、160rpm，培养5d后，样品经gc-ms测定，分析血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解效果；其中：

液体培养基的组成成分为：葡萄糖5g，l-天冬酰胺0.2g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.5g，cacl20.1g，mnso4·h2o0.01g，nacl0.005g，盐酸硫胺素0.001g，cuso4·5h2o0.002g，znso4·7h2o0.001g，alk(so4)20.0002g，h3bo30.0002g，namoo4·2h2o0.0002g，超纯水1000ml，ph5.0。

(3)磷酸三苯酯的浓度采用gc-ms进行测定，分析条件如下：

①色谱条件：sh-rxi-5silms毛细管柱(30m×0.25mm，0.25um)，载气为高纯氦气，恒流模式，柱流量1ml/min，不分流进样，进样量1ul，进样口温度280c；升温程序初始温度50℃(保持1min)，以15℃min升至200℃(保持1min)，以4℃min升至250℃(保持2min)。

②质谱条件：离子源温度200℃，传输线温度280℃；ei源(70ev)，特定离子检测扫描(srm)，检测离子326m/z，77m/z，215m/z。

(4)配置磷酸三苯酯浓度为0.1、0.5、2.5、1.0、5.0mg/l的标准溶液，绘制磷酸三苯酯浓度-峰面积标准曲线，标准曲线如图1所示。以未接种血红密孔菌的液体培养基为对照组，培养5d后对照组中磷酸三苯酯浓度为4.982mg/l，而通过上述方法培养5d后测定的实验组(接种血红密孔菌)的磷酸三苯酯浓度为1.715mg/l，通过对照组和实验组的比较可以得出，实验组降解率为65.7％，结果如图2所示(每天测定一次，三次重复)。

实施例2

方法同实施例1，区别在于：步骤(2)的降解过程中，液体培养基中磷酸三苯酯浓度为10mg/l，液体培养基ph为6，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为160rpm，培养时间为5d。最终血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解率为62.3％。

实施例3

方法同实施例1，区别在于：步骤(2)的降解过程中，液体培养基中磷酸三苯酯浓度为10mg/l，液体培养基ph为4，培养条件为：温度为30℃，摇床转速为160rpm，培养时间为5d。最终血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解率为60.8％。

实施例4

方法同实施例1，区别在于：步骤(2)中将0.6ml上述血红密孔菌孢子液加入到19.4ml已灭菌的液体营养培养基中。最终血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解率为50.6％。

实施例5

方法同实施例1，区别在于：步骤(2)中将1.0ml上述血红密孔菌孢子液加入到19.0ml已灭菌的液体营养培养基中。最终血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解率为67.4％。

实施例6

方法同实施例1，区别在于：步骤(2)将血红密孔菌孢子液加入到已灭菌的液体营养培养基后，在30℃、160r/min恒温振荡培养条件下培养4d。最终血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解率为58.3％。

实施例7

方法同实施例1，区别在于：步骤(2)的降解过程中，向培养体系中加入终浓度为5mg/l磷酸三苯酯，30℃、160rpm培养6d。最终血红密孔菌对磷酸三苯酯的降解率为68.5％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。