一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂及其制备方法与应用

1.本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.随着我国经济社会的不断发展，民众对于生态环境质量改善的需求也越来越强烈。在“水十条”关于在全国范围内开展城市黑臭水体治理工作要求的推动下，目前城市黑臭水体已经得到了有效的治理。但我国农村黑臭水体分布量多面广，污染源多而杂，对生态环境影响更为深远却尚未得到有效整治。
3.由于地理位置、经济水平、人民生产生活方式及市政措施完善程度不同，城市产生的黑臭水体与农村产生的黑臭水体也有很大的区别，具体包括：
4.(1)污染源不同。城市黑臭水体以初期雨水、溢流污水、工业废水为主，而农村黑臭水体以生产肥料和生活垃圾随意丢弃、内源污染、农作物秸秆腐烂、小规模畜禽养殖废水造成的污染为主。
5.(2)水质不同。由于污染源不同，市政措施完善程度不同，城市黑臭水体与农村黑臭水体的水质特点也不同。随着环保行业的不断发展，城市市政措施逐步完善，城市黑臭水体的污染源主要为初期雨水和内源污染。其中初期雨水包含雨水中溶解的空气中的大量酸性气体、汽车尾气、工厂废气等污染物气体。内源污染包括水中沉积的重金属元素(来自未处理的工业废水)等。而农村面积广、垃圾分散，收集难度大、成本高，导致垃圾收集的不彻底，造成生产肥料和生活垃圾随意丢弃。同时，农村生活污水收集处理率低导致生活污水和畜禽养殖污水直接进入水体。生产肥料和生活垃圾中包含大量的病原微生物，在堆放腐败过程中也会产生高浓度的弱酸性渗滤液；畜禽养殖废水主要是由畜禽养殖场产生的尿液、全部粪便或残余粪便及饲料残渣、冲洗水及工人生活、生产过程中产生的废水，其化学需氧量cod、氨氮nh
3-n、总氮tn、总磷tp含量高。农村黑臭水体的内源污染也与城市黑臭水体不同，农村黑臭水体的内源污染一部分来源于水体内生长的水生植物的干枯、腐败分解，另一部分来源于水体中有机物和氮、磷化合物借由沉淀或吸附作用积累在沉积物中，在外力扰动的情况下底泥再悬浮，向水体释放污染物和ch4、h2s等气体物质。
6.(3)河流流态不同。与城市黑臭水体相比，农村黑臭水体大多数都是封闭式的，小面积的，水系不流动或者流动缓慢不畅，水动力学条件不足，无法将氧气带入水中，自净能力差。
7.(4)生态系统不同。城市黑臭水体的生态系统包括水岸乔木、水岸草木、水岸灌木、挺水植物、浮水植物和沉水植物等等，是一个庞大而复杂的绿化系统。而农村黑臭水体大多数都是封闭式的，小面积的水体，严重缺乏绿植和水生植物，因此生态系统特别脆弱，表现为自净能力差，对外来菌种的抵抗能力差。
8.(5)需求技术不同。与城市黑臭水体相比，农村黑臭水体缺乏治理资金、缺乏专业
技术人员，缺乏专业管理人员，因此，农村黑臭水体的治理需要工艺流简单、操作简便、建设周期短、投资少的处理技术。
9.由于城市黑臭水体与农村黑臭水体有诸多不同之处，因此，城市黑臭水体常用处理技术应用在农村黑臭水体治理时也存在很多问题，具体包括：
10.(1)物理法
11.物理法主要包括截污纳管、底泥清淤、人工曝气、调水冲污等。
12.截污纳管可以有效截留溢流污水及生活污水对城市黑臭水体的影响，在沿岸布置上截留干管，将沿岸的污水截留送至城市污水处理厂进行处理，可以有效地降低黑臭水体的污染。但是农村与城市不同，相比城市，农村分散性强，缺乏水处理设施，截污纳管的费用十分高昂，因此截污纳管在农村并不适用。
13.底泥清淤是城市黑臭水体中常用的处理措施，简单有效，该措施在农村黑臭水体实施过程中存在以下问题，首先，清淤会带走大量土著微生物，改变河流的生物群落结构，破坏水生态平衡，而农村生态系统又相对薄弱。其次，某些农村地处偏远，或者位于山区，清理出来的底泥安全处置也是一大难题。
14.人工曝气对曝气装置要求高，耗电量大，需要引水引电，长期运行还需要专门人员进行维修养护，其在农村实现广泛应用会受到经济条件的限制。
15.调水冲污是指通过水利设施引入清洁水源对黑臭河道进行稀释，加快水体交换，提升水体的流动性，其见效快，但需要高额的工程费用，特别是，农村黑臭水体部分为封闭水体，因此更不适用于这种方法。
16.(2)化学法
17.药剂法是指直接向水体中投加药剂(混凝剂、氧化剂、沉淀剂等)去除污染物的方法，对于农村黑臭水体，生态系统脆弱，投加化学药剂不仅成本较高，有些化学药剂还会毒害水体中部分生物，降低水生生物多样性，破坏原本的生态系统。
18.(3)生物生态法
19.是通过构建生态系统和生物多样性，修复河道物理、生物及生态系统，强化河道自净能力。通过投加微生物菌剂修复黑臭水体是生物法的一种，许多应用研究表明微生物技术治理黑臭水体有成效。但在农村黑臭水体的治理中也存在一定的问题，实验室研究或实际研究中大多使用外来功能性菌种，农村黑臭水体生态系统播过，外来菌种的安全性存疑，并且黑臭水体环境特殊，外来菌种适应性差会削弱自身的净化作用，因此菌种的选用尤为重要。
20.综上所述，农村黑臭水体与城市黑臭水体存在较大的差别，导致城市黑臭水体的处理技术并不适用于农村黑臭水体的治理。


技术实现要素：

21.本发明提供一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂及其制备方法与应用，土著微生物能够避免农村黑臭水体安全性问题，且本身对黑臭水体的适应性强，更适合用于黑臭水体的修复；能够快速制备固体微生物菌剂，减少菌剂的流失，实现菌剂的重复使用，工艺流程短、操作方法简单、投资低、见效快。
22.本发明的技术方案如下：
23.一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂，包括固定化微生物体和生物促生剂，所述固定化微生物体包括微生物和改性生物炭(固定化载体)，所述微生物包括东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，所述改性生物炭为由5.5mol/l hno3改性的废弃核桃壳；所述生物促生剂包括碳源、营养蛋白、氨基酸和生物酶。
24.进一步地，所述的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂，所述东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液体积比为2：1：2；所述东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数独立为(1～1.5)
×
105cfu/ml。
25.进一步地，所述的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂，所述改性生物炭和微生物的比例为1：200，即1g改性生物炭吸附200ml菌悬液。
26.进一步地，所述的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂，所述生物促生剂和固定化微生物体质量比为2：1。
27.上述用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
28.步骤1.菌株的筛选
29.a.富集：采集农村黑臭水体的黑臭底泥低温密封保存，取1g底泥于10ml无菌水中，充分震荡得到底泥悬浮液；吸取5ml底泥悬浮液于牛肉膏蛋白胨培养基中进行富集培养24h；吸取5ml富集培养液于牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h(重复培养3次)；培养条件为30℃，120r/min；
30.b.初筛：吸取最后一次富集培养液，依次稀释为1：10、1：102、1：103、1：104、1：105稀释液，分别吸取1：103、1：104、1：105稀释液0.2ml涂布于分离平板，30℃恒温培养1～2d，挑取生长速度快、形态不同的菌落接种到分离培养基进行划线纯化，得到10株初筛菌株；
31.c.复筛：将初筛得到的单菌株接种到lb培养基中活化24h，活化条件为30℃，120r/min；取10ml各菌株活化培养液接入100ml黑臭水样中培养24h，测定水样中cod和nh
4+-n浓度，选择3株高cod和nh
4+-n降解率的菌株作为目标菌；
32.步骤2.菌株的16s rdna测序鉴定
33.采用细菌dna提取试剂盒提取细菌基因组dna，利用27f/1492r引物对筛选获得的菌株dna进行pcr扩增；在ncbi数据中的blast比对系统中输入测序得到的序列信息，查找数据库中相似性较高的序列，应用mega7.0软件进行聚类分析并构建系统发育树；通过菌株的系统发育树，鉴定3株菌分别为东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；
34.步骤3.复合菌液的制备
35.测定东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生长曲线，选择对数增长期增长到80％左右的时间点作为最佳培养时间，将此时间点的菌液作为种子液，此时微生物繁殖速度快，代谢能力强；按照最佳培养时间在lb培养基中培养菌株，吸取活化培养液10ml，5000r/min离心10min，弃去上清液，加入10ml灭菌0.86％nacl摇匀，再次离心10min弃去上清液，最后用10ml灭菌0.86％nacl洗下沉淀制成各菌株种子液；东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的种子液按照体积比2：1：2复配为复合菌液，备后续使用；
36.步骤4.改性生物炭的制备
37.取废弃核桃壳清洗烘干，使用破碎机破碎至1～2mm，置于马弗炉中，700℃下裂解2h后利用去离子水反复清洗，75℃烘干，过60目筛(0.4mm)得到生物炭；将生物炭放入5.5mol/l hno3溶液中，浸泡12h得到改性生物炭；获得的改性生物炭用去离子水淋洗，放置
105℃烘箱中干燥24h，备用；
38.步骤5.固定化微生物体的制备
39.称取1g改性生物炭，高压灭菌冷却后加入200ml复合菌液中，置于恒温振荡培养箱中振荡培养24h(30℃、150r/min)；取出后静置，无菌水淋洗过滤，得到固定化微生物体；
40.步骤6.固体微生物制剂的制备
41.称取2g生物促生剂与步骤5制备的1g固定化微生物体混合，即固定化微生物体与生物促生剂的质量比为2：1，获得固体微生物制剂。
42.上述制备方法制备的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂的应用，采用间歇曝气，曝气量0.5-1l/min，每天曝气4-6h；所述固体微生物制剂的投放量为2.5-4.5g/l。
43.本发明的有益效果为：
44.(1)本发明提供的固体微生物制剂包括微生物，所述微生物包括东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，三者均来源于实际黑臭底泥，不会产生生态风险，具有较强的环境适应能力。芽孢杆菌能有效地将有机物转化为二氧化碳，可参与氨化、硝化、反硝化及固氮过程，在氮循环中发挥着重要作用。其中枯草芽孢杆菌对有机物及氨氮的降解效果最好。
45.(2)本发明筛选得到的菌株培养条件简单，菌液制备方法简单易行，可作为黑臭水体有机污染物去除的菌种资源。
46.(3)本发明利用农业废弃物制备生物炭代替活性炭作为微生物固定的载体，在提高微生物降解性能的同时既能降低成本，也实现了废物的循环再利用。
47.(4)本发明提供的固体微生物制剂治理黑臭水体15d后，即可显著降低水体中氮磷及cod含量，治理黑臭水体25d后，氮磷及cod含量进一步降低，cod在30mg/l以下，nh
4+-n浓度在1.5mg/l以下，达到地表水ⅳ类标准。同时底泥中与有机物降解、脱氮及硫氧化相关菌属的相对丰度均有所提高，底泥微生物群落结构向着有助于污染物降解的方向演替。
附图说明
48.图1是基于16s rdna序列各菌株的系统进化树；其中，(a)为1号菌株，(b)为5号菌株，(c)为8号菌株；
49.图2是各菌株的生长曲线；其中，(a)为1号菌株，(b)为5号菌株，(c)为8号菌株；
50.图3是改性前后生物炭的扫描电镜(sem)图；其中，(a)为改性前，(b)为改性后；
51.图4是固定化微生物体的扫描电镜(sem)图；其中，(a)为改性前，(b)为改性后；
52.图5是门水平下优势物种相对丰度。
具体实施方式
53.一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂，包括固定化微生物体和生物促生剂，所述固定化微生物体包括微生物和改性生物炭(固定化载体)，所述微生物包括东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，所述改性生物炭为由5.5mol/l hno3改性的废弃核桃壳；所述生物促生剂包括碳源、营养蛋白、氨基酸和生物酶；所述东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液体积比为2：1：2；所述东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数独立为(1～1.5)
×
105cfu/ml。所述东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯
草芽孢杆菌来源于黑臭底泥，为土著微生物，投放到黑臭水体中不会产生生态安全性问题，并且土著微生物具有一定耐受性；其中所述枯草芽孢杆菌对有机物和氨氮的降解效果最佳，cod、nh
4+-n的降解率在50％以上。所述改性生物炭和微生物的比例为1：200，即1g改性生物炭吸附200ml菌悬液。所述生物促生剂和固定化微生物体质量比为2：1。所述生物促生剂购自上海碧莱清生物科技有限公司，能够促进微生物生长繁殖，提高微生物对污染物的降解效能。
54.上述用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
55.步骤1.菌株的筛选
56.a.富集：采集农村黑臭水体的黑臭底泥低温密封保存，取1g底泥于10ml无菌水中，充分震荡得到底泥悬浮液；吸取5ml底泥悬浮液于牛肉膏蛋白胨培养基中进行富集培养24h；吸取5ml富集培养液于牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h(重复培养3次)；培养条件为30℃，120r/min；
57.b.初筛：吸取最后一次富集培养液，依次稀释为1：10、1：102、1：103、1：104、1：105稀释液，分别吸取1：103、1：104、1：105稀释液0.2ml涂布于分离平板，30℃恒温培养1～2d，挑取生长速度快、形态不同的菌落接种到分离培养基进行划线纯化，得到10株初筛菌株；
58.c.复筛：将初筛得到的单菌株接种到lb培养基中活化24h，活化条件为30℃，120r/min；取10ml各菌株活化培养液接入100ml黑臭水样中培养24h，测定水样中cod和nh
4+-n浓度，选择3株高cod和nh
4+-n降解率的菌株作为目标菌；
59.得到10株菌，对黑臭水样中cod和氨氮的降解率如表1所示；
60.表1.初筛菌株对黑臭水样cod及nh
4+-n降解率
61.菌株编号cod降解率/％nh
4+-n降解率/％166.9525.88250.71-23.32346.74-30.30443.9724.56546.2556.10630.6715.18734.5825.83852.1566.65
62.选择3株对cod及氨氮同时具有降解效果的菌株作为目标菌，即1号菌株、5号菌株和8号菌株。
63.步骤2.菌株的16s rdna测序鉴定
64.采用细菌dna提取试剂盒提取细菌基因组dna，利用27f/1492r引物对筛选获得的菌株dna进行pcr扩增；在ncbi数据中的blast比对系统中输入测序得到的序列信息，查找数据库中相似性较高的序列，应用mega7.0软件进行聚类分析并构建系统发育树；1号菌株、5号菌株和8号菌株的系统进化树如图1所示，鉴定1号菌株、5号菌株和8号菌株分别为东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
65.步骤3.复合菌液的制备
66.挑取纯化菌株接种到100ml lb培养基中活化24h，活化条件30℃，120r/min。取3～
5ml活化24h的菌液分别装入14支灭菌小试管中进行培养，每隔2～3h取出标有相应时间的试管，立即4℃冷藏，最后一同测定od600，绘制生长曲线如图2所示，东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的最佳培养时间分别为12h、16h和15h。按照最佳培养时间在lb培养基中培养菌株，吸取活化培养液10ml，5000r/min离心10min，弃去上清液，加入10ml灭菌0.86％nacl摇匀，再次离心10min弃去上清液，最后用10ml灭菌0.86％nacl洗下沉淀制成各菌株种子液；东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的种子液按照体积比2：1：2复配为复合菌液，备后续使用；
67.东洋芽孢杆菌种子液的有效活菌数为1.3
×
105cfu/ml。
68.阿氏芽孢杆菌种子液的有效活菌数为1.0
×
105cfu/ml。
69.枯草芽孢杆菌种子液的有效活菌数为1.5
×
105cfu/ml。
70.将东洋芽孢杆菌种子液、阿氏芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液分别按照投加量0.1％、0.5％、1％、3％、5％(v/v)投加到黑臭水样中，置于30℃，120r/min培养箱中，降解2d后，各菌株对cod及nh
4+-n的降解率如表2所示。
71.表2.菌株不同投加量对黑臭水样cod及nh
4+-n的降解率
[0072][0073]
东洋芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液投加量均在1％时对cod及nh
4+-n的降解效果较好，阿氏芽孢杆菌种子液投加量在0.5％时对cod及nh
4+-n的降解效果较好。
[0074]
步骤4.改性生物炭的制备
[0075]
取废弃核桃壳清洗烘干，使用破碎机破碎至1～2mm，置于马弗炉中，700℃下裂解2h后利用去离子水反复清洗，75℃烘干，过60目筛(0.4mm)得到生物炭；将生物炭放入5.5mol/l hno3溶液中，浸泡12h得到改性生物炭；获得的改性生物炭用去离子水淋洗，放置105℃烘箱中干燥24h，备用；改性前后生物炭表面形貌如图3所示。改性后的生物炭与改性前相比表面较为平整，有明显的孔洞，可提高生物炭的吸附性能，有利于微生物固定。
[0076]
步骤5.固定化微生物体的制备
[0077]
称取1g改性生物炭，高压灭菌冷却后加入200ml复合菌液中，置于恒温振荡培养箱中振荡培养24h(30℃、150r/min)；取出后静置，无菌水淋洗过滤，得到固定化微生物体；固定化微生物体的表面形貌如图4所示，微生物在改性生物炭载体表面生长良好，呈聚集状，或呈分散状分布于改性生物碳表面。
[0078]
步骤6.固体微生物制剂的制备
[0079]
称取2g生物促生剂与步骤5制备的1g固定化微生物体混合，即固定化微生物体与
生物促生剂的质量比为2：1，获得固体微生物制剂。
[0080]
上述制备方法制备的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂的应用，在两个2l烧杯中盛装600ml黑臭底泥和1400ml黑臭水样，分别作为空白组(a0_1)和修复组(a0_2)，且两组均进行间歇曝气处理，曝气量1l/min，每天曝气4h。将实例4制备的固体微生物制剂投加到a0_2的黑臭水体中修复25天；投加量为4.5g/l(即1l黑臭水体中投加4.5g固体微生物制剂)。
[0081]
上覆水各污染物浓度如表3所示，可见投加固体微生物制剂15d后(修复组)，cod值降为52.90mg/l、nh
4+-n浓度降为1.11mg/l、tn浓度降为3.48mg/l、tp浓度降为1.1mg/l；并且处理25d后，cod值、nh
4+-n、tn和tp浓度进一步下降，cod和nh
4+-n均达到地表水ⅳ类标准。相比于空白组(仅进行间歇曝气处理)，修复组对污染物的降解效果更明显。
[0082]
表3.固体微生物制剂投入黑臭水体前后各污染物浓度
[0083][0084]
取各组别处理前后适量底泥进行高通量测序，分析底泥微生物群落结构的变化。各组别在门水平下优势物种相对丰度结果如图5所示。proteobacteria以好氧和兼性菌为主，是污水厂活性污泥中的主要组成种群，在硝酸盐、硫氧化及有机物降解等方面具有重要作用。经处理后，proteobacteria成为a0_1和a0_2的优势菌门(44.00％和40.57％)。在a0_1和a0_2中的相对丰度均有不同程度的增加，bacteroidetes、chloroflexi和gemmatimonadetes能够促进生物脱氮除磷过程。寇占国等人研究发现bacteroidetes在轻度黑臭水体底泥中的相对丰度更高，并且与溶解氧呈正相关。丁轶睿等人研究表明bacteroidetes与水体富营养化呈负相关。a0_2中bacteroidetes相对丰度增加较多(55.1％)，说明固体微生物制剂的投加有助于减轻水体黑臭程度。总体来看，门水平上能够参与硝化、反硝化过程及有机物降解的菌门相对丰度显著提高，底泥中微生物群落结构向有助于减轻黑臭方向演替。
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]