一种提高小球藻对含硒废水处理能力的方法

1.本发明属于环境微生物技术领域，更具体地，涉及一种提高小球藻对含硒废水处理能力的方法。


背景技术：

2.硒是一种人畜必需但安全阈值很低的微量元素，在我国湖北恩施、陕西安康及国外都有发生硒中毒事件。硒的生物毒性与其摄入剂量及化学形态密切相关，其中以硒酸盐(seo
42-)和亚硒酸盐(seo
32-)为代表的水溶性无机硒具有毒性高、迁移性强和污染性广等特点，被列为需要重点控制的环境影响因子。我国gb 8978-1996《污水综合排放标准》严格规定工业排放废水中硒含量不得超过100μg/l，而饮用水标准限量更是设为不超过10μg/l。然而，硒也是一种重要的工业原料，电解铜、玻璃脱色、硫酸制造等行业是生产含硒废水的重要来源，其中金矿开采废水中硒浓度高达33000μg/l，而且随着我国富硒农业蓬勃发展，无机硒肥大量施加极易造成水体硒含量超标，直接威胁生态环境安全和人类健康，研究相关环境修复技术变得尤为迫切。目前，含硒废水的处理主要包括电絮凝法、反渗透法和化学沉淀法，但都存在成本高、处理效率低及二次污染等问题，发展绿色高效的生物处理技术成为当前研究的热点。
3.小球藻是一种营养价值高、环境适应性广且富硒能力较强的单细胞绿藻，能将高毒性无机硒转化为以硒蛋白为主的有机硒和低毒性挥发态硒，利用该藻独特的富硒特性是实现水体中无机硒毒性钝化和迁移的重要生物处理途径。目前，我国学者已充分评价小球藻处理含硒废水的应用潜力，被证实是生物去除和挥发硒速率最高的物种，相比于传统植物修复，更具处理周期短、无时空限制和成本可控等优势。但是，硒对微藻存在生长促进和毒性抑制二重性，而通常废水中硒负荷较高，高硒浓度会严重影响藻细胞的生长活性，甚至产生致死效应，从而限制了其对无机硒的生物转化和有效去除。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决上述问题。
5.本发明的发明人经研究发现，向接入小球藻藻种的含硒废水中同时加入褪黑素可以促进藻细胞生长及对无机硒的吸收代谢，解决小球藻对高硒环境适应性较差的问题，有效发挥藻类高效去除硒污染的技术优势，避免高硒浓度导致的藻细胞的生长活性降低，甚至致死，可为发展小球藻高效处理含硒废水的生物修复技术提供应用指导。
6.为了实现上述目的，本发明提供一种提高小球藻对含硒废水处理能力的方法，该方法包括：向接入小球藻藻种的含硒废水中加入褪黑素，进行培养。
7.本发明的方法尤其适用于高浓度含硒废水。作为优选方案，相对于硒酸盐和/或亚硒酸盐的总浓度≤20mg/l的含硒废水，加入褪黑素后的含硒废水中褪黑素的浓度为3～40μmol/l。
8.作为进一步优选方案，加入褪黑素后的含硒废水中褪黑素的浓度为5～30μmol/l。
作为更进一步优选方案，浓度为10～20μmol/l。
9.作为进一步优选方案，硒酸盐和/或亚硒酸盐的总浓度为5～15mg/l。作为更进一步优选方案，硒酸盐和/或亚硒酸盐的总浓度为8～10mg/l。
10.作为优选方案，向含硒废水中接入小球藻的初始藻种密度满足：od
750
＝0.55～0.65。
11.作为优选方案，培养的条件满足如下条件中的至少一种：
12.条件1：温度为20～30℃；
13.条件2：单侧持续光照，120～160μmol photons/m/s；
14.条件3：通入含有0.5～2％co2的压缩空气鼓气培养。
15.作为优选方案，培养的时间为5～15d，进一步优选为8～12d。
16.根据本发明，在一个具体的实施方式中，实验室培养条件下，可选用mbg-11液体培养基，mbg-11液体培养基的配方可以是：0.5～1.5g/l nano3，0.02～0.06g/l k2hpo4，0.075～0.15g/l mgso4·
7h2o，0.036g/l cacl2·
2h2o，0.006g/l柠檬酸，0.006g/l fecl3·
6h2o，0.001g/l edta，0.02g/l na2co3，2.860g/l h3bo3，1.810g/l mncl2·
4h2o，0.391g/l na2moo4·
2h2o，0.079g/l cuso4·
5h2o，0.220g/l znso4·
7h2o，1l去离子水，121℃、20min高温灭菌处理。
17.优选的，所述的mbg-11液体培养基的配方可以是：1.5g/l nano3，0.04g/l k2hpo4，0.075g/l mgso4·
7h2o，0.036g/l cacl2·
2h2o，0.006g/l柠檬酸，0.006g/l fecl3·
6h2o，0.001g/l edta，0.02g/l na2co3，2.860g/l h3bo3，1.810g/l mncl2·
4h2o，0.391g/l na2moo4·
2h2o，0.079g/l cuso4·
5h2o，0.220g/l znso4·
7h2o，1l去离子水，121℃、20min高温灭菌处理。
18.本发明的机理是：
19.小球藻是一种单细胞绿藻，能够快速吸收无机硒转化成有机硒(硒蛋白、硒氨基酸)和低毒性挥发态硒，是目前报道生物处理中去除和挥发硒速率最高的物种。然而，高硒浓度容易引起藻体氧化损伤，进而影响光合作用和生物膜系统，从而抑制其生长并降低硒的吸收转化和去除效率，限制了小球藻在生物修复高硒废水中的应用实践。本发明通过在小球藻处理含硒废水体系中添加褪黑素，促进了藻细胞对无机硒的吸收代谢，解决了小球藻对高硒环境的适应性较差的问题，为发展藻类生物处理硒污染水体技术提供应用指导。
20.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
21.本发明的方法是在培养过程中通过添加褪黑素来调控小球藻的生长代谢，应用此方法可显著提高小球藻在高硒条件下的抗逆性和对硒的吸收代谢效率。在模拟废水中，该小球藻的生长状态和无机硒的去除率显著高于对照组(未添加褪黑素组)。本发明为解决小球藻对高硒环境的适应性较差开辟了新的调控路径，对发展藻类除硒生物修复技术具有重要的理论和实际意义。
22.本发明的其他特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
23.图1示出了不同植物激素对高硒条件下小球藻生长的影响。
24.图2示出了不同褪黑素浓度对高硒条件下小球藻生理抗性的影响；其中图2a-b分
别表示叶绿素a和叶绿素b含量的变化；图2c-d分别表示小球藻胞内过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化酶酶活的变化。
25.图3示出了褪黑素对小球藻处理模拟高硒废水的净化效果；其中图3a表示褪黑素介导下小球藻在高硒废水中的生长状况；图3b表示小球藻对高硒废水的除硒效率及藻体总硒含量的变化。
具体实施方式
26.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
27.本发明中，小球藻(chlorella sp.fachb-10)购买于中国科学院淡水藻种库，在藻种库网站(http://algae.ihb.ac.cn/dictionary.aspx)也可查到。
28.本发明中，mbg-11液体培养基的配方为：1.5g/l nano3，0.04g/lk2hpo4，0.075g/l mgso4·
7h2o，0.036g/l cacl2·
2h2o，0.006g/l柠檬酸，0.006g/l fecl 3
·
6h2o，0.001g/l edta，0.02g/l na2co3，2.860g/l h3bo3，1.810g/l mncl2·
4h2o，0.391g/l na2moo4·
2h2o，0.079g/l cuso4·
5h 2
o，0.220g/l znso4·
7h2o，1l去离子水，121℃、20min高温灭菌处理。上述的mbg-11液体培养基在文献“morphological and spectrometric analyses of lipids accumulation in a novel oleaginous microalga,eustigmatos cf.polyphem(eustigmatophyceae)[j]bioprocess and biosystems engineering,2013,36:1125-1130.”中公开。
[0029]
本发明中，质量控制方法为以下含量测定方法中的一种或几种：
[0030]
1.生物量测定
[0031]
培养结束时，准确吸取混匀的藻液5ml，置于提前称量好的硝酸纤维素滤膜上(0.45μm，w1)进行抽滤，得到含藻的滤膜在105℃的烘箱中放置10～12h。待滤膜在干燥器中冷却30min后，精确的称量(w2)，其生物质浓度的计算公式为：生物量(g/l)＝(w
2-w1)
×
200。
[0032]
2.叶绿素测定
[0033]
培养结束时，准确吸取混匀的藻液5ml，离心(4000rpm，5min)后去除上清，加入5ml甲醇，在4℃、避光条件下磁力搅拌提取10-16h，直至藻体变成灰白色，然后4000rpm离心5min取上清，再采用紫外分光光度计分别测定其在波长646nm、663nm处的吸光度，并根据以下公式计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量：
[0034]
叶绿素a(mg/l)＝12.21a
663
－2.81a
646
[0035]
叶绿素b(mg/l)＝20.13a
646
－5.03a
663
[0036]
3.抗氧化酶酶活
[0037]
培养结束时，吸取10-20ml混合均匀的藻液，4000rpm离心5min，去除上清，用离子水将藻体沉淀洗涤一遍，悬浮在ph＝6.8磷酸缓冲液中，然后转移到预冷的研钵中，加入20-40ml液氮，充分研磨10-15min，吸取匀浆转移到新的离心管中，4℃、6000rpm离心10min，收集上清，然后按照过氧化氢酶试剂盒(购买于南京建成生物科技公司)和谷胱甘肽过氧化酶试剂盒(购买于南京建成生物科技公司)操作说明测定谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和过
氧化氢酶(cat)的酶活。
[0038]
4.培养基中残余的无机硒
[0039]
取一定体积的培养基上清，经过0.22μm针头过滤器过滤后，准确移取3ml培养基加入到25ml的比色管中，并依次加入1ml 5％edta-2na和3ml 1％邻苯二胺，加去离子水至刻度线，用6mol/l hcl调ph到1.5；室温下置于暗处反应40min后，加入10ml环己烷，振摇3min，静置8min，转入分液漏斗分液。同样步骤得到试剂空白作为参照，采用紫外分光光度计测环己烷层在波长331nm处的吸光度，并根据标准曲线计算出培养基中亚硒酸钠的浓度。
[0040]
亚硒酸钠标准曲线的绘制：分别加入0.5、1、2、4、6、8、10、20μg亚硒酸钠，按照以上方法，以亚硒酸钠浓度为横坐标，od
331
吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
[0041]
5.藻体总硒
[0042]
精确称取0.1～0.2g冻干藻粉，转移至预先洗净烘干的消解罐中，并加入7ml hno3，采用超高压微波消解系统中消化，推荐消解条件为：1)温度爬坡至120℃，耗时5min，温度保持1min；2)温度爬坡至150℃，耗时3min，温度保持5min；3)温度爬坡至200℃，耗时5min，温度保持10min；4)最后冷却至55℃，20min。消解结束后，将消解罐转移至消化炉中赶酸，200℃继续加热至溶液体积变为约1ml时结束。待消解罐冷却至室温后，利用移液枪将消解液体转移至锥形瓶中，继续加入5ml50％hcl，轻轻晃动至盐酸和消化液充分混合，然后放入温度为180℃的电热板上，加热20～30s左右，待冷却至室温后定容(10ml)，利用氢化物原子荧光光谱法(afs，海光仪器)测定。同时做空白组试验，每组2～3个平行。
[0043]
仪器推荐运行条件为：负高压270v；灯电流80ma；原子化温度800℃；炉高8mm；载气流速300ml/min；屏蔽气流速800ml/min；测量方式标准曲线法，读数方式峰面积；延迟时间4s，读数时间20s，加液时间8s，进样体积0.1ml。
[0044]
前期实验：
[0045]
实验例1：不同植物激素对小球藻在含硒培养基中生长的影响
[0046]
步骤1、配置含有亚硒酸钠(na2seo3)的mbg-11培养基：根据mbg-11培养基配方制备液体培养基，进行高压蒸汽灭菌。然后，精确称取一定质量的亚硒酸钠充分地溶解在去离子水中，配成浓度为50mg/l na2seo3工作液，再经过0.22μm针孔过滤器过滤除菌后，加入到已经完成灭菌的mbg-11培养基中，配置成含有特定na2seo3浓度的mbg-11培养基。
[0047]
步骤2、扩种培养：将保存在三角瓶中的小球藻藻种接种于光柱状玻璃生物反应器中(长
×
内径＝60
×
3cm)中扩种培养。培养条件为：mbg-11液体培养基，温度25
±
1℃，持续单侧白炽灯光照(80～90μmol photons/m2/s)，含有1％co2的压缩空气鼓气培养7天。
[0048]
步骤3、
[0049]
步骤3-1：将小球藻在含有na2seo3的mbg-11培养基中培养：将步骤2所得的处于对数生长期的小球藻藻种接入到光柱状玻璃生物反应器中(长度
×
内径＝60
×
3cm)，接种初始密度为od
750
＝0.6，采用含有8mg/lna2seo3的mbg-11培养基培养，培养条件为单侧持续光照(150μmol photons/m2/s)，温度控制在25
±
1℃，通入含有1％co2的压缩空气鼓气培养10天，作为对照组。
[0050]
步骤3-2：与步骤3-1的不同之处在于mbg-11培养基中还添加有褪黑素或胺鲜酯或油菜素内酯，将三种物质分别先溶于95％乙醇，然后配成一定浓度的工作液，将工作液加入到mbg-11培养基中，分别各自设置5μmol/l和20μmol/l两个浓度梯度，作为6个不同的实验
组。
[0051]
测试例1：
[0052]
通过干重法测定褪黑素、胺鲜酯、油菜素内酯浓度在0μmol/l、5μmol/l、20μmol/l下的小球藻生物质积累量(生物量)，见图1。
[0053]
由图1观察到不添加褪黑素、胺鲜酯、油菜素内酯的对照组中小球藻生长受到显著抑制，当加入褪黑素、胺鲜酯或油菜素内酯后，小球藻的生物质浓度都有所增加，特别是在20μmol/l褪黑素的处理下生物质浓度最高可达到2.4g/l以上。由此表明，相比于其他激素，褪黑素对高硒条件下小球藻的生长更具有积极影响。
[0054]
实验例2：不同褪黑素浓度对小球藻光合作用和抗氧化系统的影响
[0055]
步骤1、配置含有亚硒酸钠(na2seo3)的mbg-11培养基：根据mbg-11培养基配方制备液体培养基，进行高压蒸汽灭菌。然后，精确称取一定质量的亚硒酸钠充分地溶解在去离子水中，配成浓度为50mg/l的seo
32-工作液，再经过0.22μm针孔过滤器过滤除菌后，加入到已经完成灭菌的mbg-11培养基中，配置成含有特定na2seo3浓度的mbg-11培养基。
[0056]
步骤2、扩种培养：将保存在三角瓶中的小球藻藻种接种于光柱状玻璃生物反应器中(长
×
内径＝60
×
3cm)中扩种培养。培养条件为：mbg-11液体培养基，温度25
±
1℃，持续单侧白炽灯光照(80～90μmol photons/m2/s)，含有1％co2的压缩空气鼓气培养6.5天。
[0057]
步骤3：将小球藻在含有na2seo3的mbg-11培养基中培养：将步骤2所得的处于对数生长期的小球藻藻种接入到光柱状玻璃生物反应器中(长度
×
内径＝60
×
3cm)，接种初始密度为od
750
＝0.6，采用含有8mg/lna2seo3的mbg-11培养基培养，同时向mbg-11培养基中加入不同体积褪黑素工作液，使得mbg-11培养基中褪黑素终浓度分别为0、5、10、20和40μmol/l。培养条件为单侧持续光照(150μmol photons/m2/s)，温度控制在25
±
1℃，通入含有1％co2的压缩空气鼓气培养10天。
[0058]
测试例2：
[0059]
通过离心(4000rpm，5min)收集藻细胞，分别采用紫外分光光度法和酶活测定试剂盒测定褪黑素浓度在0μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l和40μmol/l下的藻细胞中叶绿素含量和抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶)酶活的变化，见图2。
[0060]
叶绿素含量的测定：准确吸取混匀的藻液5ml，离心(4000rpm，5min)后去除上清，加入5ml甲醇，在4℃、避光条件下磁力搅拌提取10-16h，直至藻体变成灰白色，然后4000rpm离心5min取上清，再采用紫外分光光度计分别测定其在波长646nm、663nm处的吸光度，并根据以下公式计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量：
[0061]
叶绿素a(mg/l)＝12.21a
663
－2.81a
646
[0062]
叶绿素b(mg/l)＝20.13a
646
－5.03a
663
。
[0063]
胞内抗氧化酶的测定：吸取10-20ml混合均匀的藻液，4000rpm离心5min，去除上清，用离子水将藻体沉淀洗涤一遍，悬浮在ph＝6.8磷酸缓冲液中，然后转移到预冷的研钵中，加入20-40ml液氮，充分研磨10-15min，吸取匀浆转移到新的离心管中，4℃、6000rpm离心10min，收集上清，然后按照过氧化氢酶试剂盒(购买于南京建成生物科技公司)和谷胱甘肽过氧化酶试剂盒(购买于南京建成生物科技公司)操作说明测定谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和过氧化氢酶(cat)的酶活。
[0064]
结果如图2a-b所示，在高硒环境下，相比于未添加褪黑素的对照组，褪黑素显著提
高了小球藻中叶绿素a和叶绿素b的含量，由此表明褪黑素在高硒条件下通过保护光合作用而提高生理抗性；此外，褪黑素的加入也显著提高小球藻胞内过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化酶的酶活(图2c-d)，由此说明褪黑素可通过提高抗氧化酶的活性来降低高浓度无机硒对小球藻的氧化损伤。
[0065]
实施例1
[0066]
本实施例提供一种提高小球藻处理硒废水处理能力的方法。
[0067]
步骤1、配置含有亚硒酸钠(na2seo3)的mbg-11培养基：根据mbg-11培养基配方制备液体培养基，进行高压蒸汽灭菌。然后，精确称取一定质量的亚硒酸钠充分地溶解在去离子水中，配成浓度为50mg/l的na2seo3工作液，再经过0.22μm针孔过滤器过滤除菌后，加入到已经完成灭菌的mbg-11培养基中，配置成含有特定na2seo3浓度的mbg-11培养基。
[0068]
步骤2、扩种培养：将保存在三角瓶中的小球藻藻种接种于光柱状玻璃生物反应器中(长
×
内径＝60
×
3cm)中扩种培养。培养条件为：mbg-11液体培养基，温度25
±
1℃，持续单侧白炽灯光照(80～90μmol photons/m2/s)，含有1％co2的压缩空气鼓气培养6-7天。
[0069]
步骤3、配置含有10mg/l na2seo3的mbg-11培养基作为模拟高硒废水，然后接入步骤2所得的处于对数生长期的小球藻藻种，初始接种密度为od
750
＝0.6，然后加入一定体积的褪黑素工作液，使得最终激素终浓度分别为10μmol/l和20μmol/l，以不加激素处理作为对照组，实验设置三个重复；采用光柱状玻璃生物反应器(长度
×
内径＝60
×
3cm)培养，单侧持续光照150μmol photons/m2/s，通过含有1％co2的压缩空气，温度保持在25
±
1℃。培养10天后，利用干重法测定生物质浓度，剩余的藻液通过离心分离上清和藻体，其中上清液经过0.22μm针孔过滤器处理后用于测定废水中na2seo3的残留量，而藻体则充分洗涤后冷冻干燥，利用原子荧光法测定藻体总硒的含量。
[0070]
测试例3：通过实施例1测定褪黑素对小球藻处理模拟高硒废水的净化效果。
[0071]
图3a表示褪黑素介导下小球藻在高硒废水中的生长状况；图3b表示小球藻对高硒废水的除硒效率及藻体总硒含量的变化。
[0072]
如图3a所示，相比于正常培养基，含有10mg/l na2seo3的模拟废水显著抑制了小球藻的生长，但通过加入褪黑素后，小球藻的生长质浓度显著增加，且呈剂量依赖效应；同时，在高硒环境下，褪黑素显著提高了小球藻对废水中无机硒的去除效率，在20μmol/l褪黑素处理下无机去除率到达到97％以上，但是藻体中总硒含量却出现显著下降，这是因为褪黑素改变了小球藻对无机硒的吸收代谢模式，使得胞内硒更多以挥发态硒形式逸出，减轻生理毒性，这也是藻类解毒的一种重要途径。
[0073]
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。