抗生素在促进纤维素厌氧发酵产甲烷中的应用和方法与流程

1.本发明是抗生素在促进纤维素厌氧发酵产甲烷中的应用和方法，具体涉及一种抗生素在纤维素为底物、污水污泥为接种物生产甲烷的过程中的应用以及利用抗生素提高甲烷产量的方法，属于生物发酵技术领域。


背景技术：

2.随着能源危机的日益严重，寻求新的清洁和可再生能源已成为解决此类问题的重要途径之一。木质纤维素生物质的厌氧消化因其环境可持续、供应充足且成本低廉，而被认为是一种既能生产生物能源又能减轻环境污染的有效方法，但由于其复杂的三维结构而难以水解，因此，在以木质纤维素生物质发酵生产甲烷气时，甲烷的转化率并不理想。
3.木质纤维素生物质的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，其中，纤维素的甲烷生产潜力高于半纤维素或木质素，因此，寻求促进纤维素产甲烷的方法对于提高木质纤维素生物质的发酵效率至关重要。郝晓地等在“强化污泥中木质纤维素产甲烷实验研究”（《环境工程学报》2015年7月第9卷第7期 3432-3440）中对添加木质纤维素组分的污泥的厌氧发酵过程进行对比实验，实验表明，投加富集培养微生物于厌氧消化过程，可以有效强化纤维素和半纤维素的降解转换，提高甲烷气体产量，但污泥中因异常稳定的木质纤维素化学结构使纤维素和半纤维素等易降解组分难以自由释放而与投加的富集培养微生物进行有效接触，因此，只有通过预处理手段，即对污泥进行酸、碱、热以及超声波预处理后，再实施厌氧消化可有效降解、转化木质纤维素组分，从而获得较高的甲烷产气量。
4.又如公开号为cn115029386a的发明专利公开的一种提高农林剩余物固态厌氧发酵制备甲烷产量和产率的方法，该方法采用过氧化物-碱耦合体系对秸秆、棉杆、杨木、竹等农林剩余物进行预处理，然后再将预处理产物与禽畜粪便混合进行固态厌氧发酵，可增加甲烷产气率，与未处理的木质纤维素原料相比，累计产气量可提高100%。以及公开号为cn115011639a的发明专利公开的一种木质纤维素原料生产沼气的方法，该方法将木质纤维原料调湿、切碎、生物预处理后进行一次厌氧发酵产沼气，然后将发酵后的固体残余物脱水、加入碱液，再经搓揉处理后与畜禽粪污混合后进行二次发酵产沼气，产生的沼液再作为接种物循环利用，该方法中木质纤维原料累积产气量较传统的发酵方式提高70％以上，甲烷体积分数提高5个百分点。
5.由上述内容可知，在使用污泥或禽畜粪便为发酵物对纤维原料进行发酵来生产甲烷的方法中，均需要对纤维原料进行预处理，在实际生产过程中，预处理手段虽然能够提升甲烷气的产量，但由于工序的增加，势必会造成生产成本及工艺控制难度的增加，不利于工业转化。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供抗生素在促进纤维素厌氧发酵产甲烷中的应用和方法，通过在纤维素为底物，废水污泥为接种物的厌氧发酵过程中引入抗生素，即四环素或阿奇霉素，不仅
能避免纤维素预处理产生的高成本、二次污染等问题，简化生产步骤，还能提高甲烷产量，填补了抗生素在促进纤维素厌氧发酵产甲烷的空白。
7.本发明通过以下技术方案实现：一种提高纤维素生产甲烷产量的方法，在纤维素和废水污泥的混合物中添加抗生素，经厌氧发酵即得甲烷，所述混合物中，每100ml废水污泥中，纤维素的含量为0.3～0.4g，每100ml混合物中，抗生素的含量为0.5～1.5mg；所述厌氧发酵是在37℃的温度下，于120 rpm的震荡培养箱中培养20天；所述抗生素为四环素或阿奇霉素。
8.所述纤维素为微晶纤维素和/或纤维素粉。
9.所述废水污泥来自污水处理厂，并在4℃下经离心、洗涤后得到的浓度为1.5%wt的湿污泥。
10.所述离心控制在8000
×
g。
11.所述洗涤采用蒸馏水彻底摇晃洗涤，且洗涤步骤重复三次。
12.在所述混合物中添加抗生素时，先将抗生素溶解在溶剂中，再加入混合物中并调整混合物中抗生素的浓度。
13.所述溶剂为乙醇。
14.抗生素在促进纤维素厌氧发酵产甲烷中的应用，采用上述方法即可实现。
15.本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：（1）本发明首次在纤维素厌氧发酵生产甲烷的过程中引入抗生素，不仅可避免对纤维素进行预处理，可降低工艺生产难度及成本，还能提升纤维素生产甲烷的产量。
16.（2）本发明采用特定的抗生素：四环素或阿奇霉素，在纤维素为底物，废水污泥为接种物的厌氧生产甲烷的过程中，由于微生物活性的改变，能够对厌氧生产过程中的各阶段产生促进作用，尤其在产甲烷阶段具有明显的促进作用。
17.（3）本发明中，添加阿奇霉素的纤维素生产甲烷产量可以提升51.94%，添加四环素的纤维素生产甲烷产量可以提升34.96%。
附图说明
18.图1为反应器中添加抗生素的浓度和时间对照。
19.图2为不同抗生素压力下反应器中的纤维素酶活性。
20.图3为不同抗生素压力下反应器中溶解的总有机碳。
21.图4为不同处理下反应器产生的有机酸。
22.图5为不同抗生素添加下门水平的细菌多样性。
23.图6为不同抗生素添加条件下门水平细菌群落（a）和属水平古菌群落（b）的相对丰度。
具体实施方式
24.下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
25.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技
术人员通常理解的相同含义。
26.抗生素是指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。已报道的在厌氧发酵（ad）中使用的抗生素有土霉素、金霉素、头孢氨苄、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星，等等，它们通常被用于废弃污泥作为底物而进行的发酵过程，例如：andriamanohiarisoamanana 等人研究了土霉素和金霉素对奶牛粪便甲烷产量的抑制作用，并研究了其相应机制。其它一些文献表明抗生素对ad表现没有明显影响。例如，米切尔等人证明磺胺二甲嘧啶和氨苄西林对牛粪的总沼气产量没有影响，它们的浓度分别高达280mg/l和350mg/l。beneragama 等人的研究表明头孢唑啉对奶牛粪便中的甲烷产生没有抑制作用。lu等人对头孢氨苄对废弃活性污泥产甲烷的长期影响进行了研究，证明在157天后，与对照相比，甲烷产量提高了63.8%。zhi and zhang研究了几种抗生素（土霉素、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星）在一定浓度范围（0-500 mg/l）对脱水污泥ad的影响，结果表明100mg/l的抗生素可以提高甲烷产量。
27.由现有报道可知，抗生素虽然被用于研究其对废水污泥进行的厌氧发酵产甲烷的影响，但其结果表明，某些抗生素可能对废水污泥进行的厌氧发酵产生促进作用，某些抗生素也可能产生抑制作用，然而，迄今为止，未见报道有抗生素对接种废水污泥的纤维素厌氧发酵的影响。
28.下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
29.实施例1：采用阿奇霉素的纤维素厌氧发酵产甲烷的方法底物：微晶纤维素（mcc）。
30.接种物：废污水污泥（wss），在4℃下以8000
×
g离心10min，剩余的沉淀物用蒸馏水彻底摇晃洗涤，将洗涤步骤重复3次，然后用蒸馏水将最终污泥浓度调整为1.5%。
31.抗生素：采用阿奇霉素（azm），将azm溶解在浓度大于99%的乙醇溶液中，作为抗生素母液。
32.厌氧发酵：取体积为120ml的发酵瓶，在发酵瓶中加入0.2gmcc和60mlwss，再加入抗生素母液，并使用抗生素母液将发酵瓶中azm的最终浓度调整为15μg/ml。用丁基橡胶塞将发酵瓶密封并充氮气5min以建立厌氧条件，然后将发酵瓶在37℃下，120rpm的震荡培养箱中培养20天，收集发酵瓶中的气体。
33.实施例2：采用四环素的纤维素厌氧发酵产甲烷的方法底物：微晶纤维素（mcc）。
34.接种物：废污水污泥（wss），在4℃下以8000
×
g离心10min，剩余的沉淀物用蒸馏水彻底摇晃洗涤，将洗涤步骤重复3次，然后用蒸馏水将最终污泥浓度调整为1.5%。
35.抗生素：采用四环素（tc），将tc溶解在浓度大于99%的乙醇溶液中，作为抗生素母液。
36.厌氧发酵：取体积为120ml的发酵瓶，在发酵瓶中加入0.2gmcc和60mlwss，再加入抗生素母液，并使用抗生素母液将发酵瓶中tc的最终浓度调整为5μg/ml。用丁基橡胶塞将发酵瓶密封并充氮气5min以建立厌氧条件，然后将发酵瓶在37℃下，120rpm的震荡培养箱
中培养20天，收集发酵瓶中的气体。
37.对比例1：采用头孢氨苄的纤维素厌氧发酵产甲烷的方法底物：微晶纤维素（mcc）。
38.接种物：废污水污泥（wss），在4℃下以8000
×
g离心10min，剩余的沉淀物用蒸馏水彻底摇晃洗涤，将洗涤步骤重复3次，然后用蒸馏水将最终污泥浓度调整为1.5%。
39.抗生素：头孢氨苄（clx），将clx溶解在去离子水中，作为抗生素母液。
40.厌氧发酵：取体积为120ml的发酵瓶，在发酵瓶中加入0.2 gmcc和60mlwss，再加入抗生素母液，并使用抗生素母液将发酵瓶中clx的最终浓度调整为15μg/ml。用丁基橡胶塞将发酵瓶密封并充氮气5min以建立厌氧条件，然后将发酵瓶在 37℃下，120rpm的震荡培养箱中培养20天，收集发酵瓶中的气体。
41.对比例2：空白对照底物：微晶纤维素（mcc）。
42.接种物：废污水污泥（wss），在4℃下以8000
×
g离心10min，剩余的沉淀物用蒸馏水彻底摇晃洗涤，将洗涤步骤重复3次，然后用蒸馏水将最终污泥浓度调整为1.5%。
43.厌氧发酵：取体积为120ml的发酵瓶，在发酵瓶中加入0.2gmcc和60mlwss，再加入与azm和tc同等量的乙醇。用丁基橡胶塞将发酵瓶密封并充氮气5min以建立厌氧条件，然后将发酵瓶在37℃下，120rpm的震荡培养箱中培养20天，收集发酵瓶中的气体。
44.（一）甲烷产量的分析针对上述实施例1、实施例2、对比例1和对比例2收集的气体，采用gompertz模型计算甲烷的产量，如下式（1）所示：b
(t) = b
0 exp {
‑ꢀ
exp [ 1 + μ
m e (λ
–ꢀ
t) / b0]}
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
（1）其中，b
(t)
为时间 t 的累积甲烷产量（ml/g-vs）；b0为最大甲烷产量（ml/g-vs）；μm为最大甲烷产率（ml/(g-vs
•
d)）；λ为产甲烷的滞后时间（d）；t为消化时间（d）；e 为欧拉数2.718。
[0045]
经计算可知，在20天的厌氧发酵期间，与空白对照相比，添加azm和tc的实施例中甲烷产量分别提高了51.94%、34.96%，而添加clx 的实施例中甲烷产量降低了23.95%。具体地，添加azm 在纤维素厌氧发酵的各阶段（水解、产酸/产乙酸、产甲烷）均产生了促进作用，而添加tc主要在产甲烷阶段发挥积极作用。
[0046]
（二）抗生素浓度的分析按实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的方法进行抗生素浓度分析，抗生素浓度分别为：ctrl (clx)组：clx为0μg/ml；clx组：clx依次为15μg/ml；ctrl (tc/azm)组：tc和azm为0μg/ml；tc组：tc依次为5μg/ml；
azm组：azm依次为15μg/ml。
[0047]
如图1所示，ctrl (tc/azm)组的甲烷产量显着高于ctr (clx)组，表明乙醇的使用可以在产乙酸阶段转化为乙酸和 h2，进而在产甲烷阶段进一步产生甲烷。ctrl (clx)组的甲烷产量高于clx组的甲烷产量，表明clx对甲烷产量并没有促进作用。azm组和tc组的甲烷产量高于ctrl (tc/azm)组，表明azm和tc对甲烷产量有促进作用，且azm的促进作用明显高于tc。
[0048]
另外，从图1所示，经过20天的厌氧发酵，添加azm和tc均能促进纤维素厌氧发酵产甲烷，相比对照分别提高了51.94%和34.96%。
[0049]
（三）纤维素酶活性分析按实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中的方法，取0.5ml发酵液离心后的上清液作为样品进行纤维素酶活性分析，参照hua, et al (2014)的方法进行纤维素酶活性分析。
[0050]
结果如图2所示，ctr (clx)为clx对照，不添加任何抗生素，仅添加等量去离子水；clx为添加clx；ctrl (tc/azm)为tc和azm对照，不添加任何抗生素，仅添加等量乙醇；tc为添加tc；azm为添加azm。由图2可知，在整个20天的厌氧发酵过程中，添加tc和azm样品的纤维素酶活性均高于对照组，这与甲烷产率的结果一致，表明添加tc和azm能够在一定程度上增强纤维素酶活性，进一步促进纤维素水解。与对照相比，添加clx的样品具有较低的纤维素酶活性，表明添加 clx 会降低纤维素酶活性。
[0051]
（四）doc浓度分析按实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中的方法，取30ml发酵液离心后的上清液样品进行doc浓度分析，doc浓度分析采用总有机碳分析仪（toc-vcph，日本）进行分析。
[0052]
结果如图3所示，ctr (clx)为clx对照，不添加任何抗生素，仅添加等量去离子水；clx为添加clx；ctrl (tc/azm)为tc和azm对照，不添加任何抗生素，仅添加等量乙醇；tc为添加tc；azm为添加azm。由图3可知，发酵 20 天后由于 mcc 的水解，所有反应器中的 doc 浓度显着增加。特别是azm中累积的doc比对照组高24.55%（p = 0.003《《0.05），这也表明azm对mcc的水解及其甲烷产率有促进作用。第20天tc中所含的doc与对照组相似，表明tc添加对纤维素水解的影响不显著。相反，clx中doc浓度比对照低17.50%，这与clx中产生甲烷的趋势一致。
[0053]
（五）有机酸分析按实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中的方法，取1ml作为样品进行有机酸含量分析，采用气相色谱仪（gc-2030，岛津，日本）进行分析。
[0054]
结果如图4所示，ctr (clx)为clx对照，不添加任何抗生素，仅添加等量去离子水；clx为添加clx；ctrl (tc/azm)为tc和azm对照，不添加任何抗生素，仅添加等量乙醇；tc为添加tc；azm为添加azm。由图4可知，与对照相比，添加tc的有机酸浓度在所有样品中最高，表明 tc 可以在一定程度上促进有机酸的产生，并进一步提高纤维素的甲烷产量。与对照相比，添加azm的有机酸产量较低，但azm 存在下检测到最高的甲烷产量，由此推测azm在产甲烷阶段主要通过促进乙酸产甲烷途径提高甲烷产量。对于clx，有机酸产量普遍低于对照，这与甲烷产量的结果一致。
[0055]
（六）微生物群落分析
按实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中的方法，取15ml发酵液样品进行微生物群落分析，参照zhu et al. (2021)的方法进行分析。
[0056]
结果如图5和图6所示，ctr (clx)为clx对照，不添加任何抗生素，仅添加等量去离子水；clx为添加clx；ctrl (tc/azm)为tc和azm对照，不添加任何抗生素，仅添加等量乙醇；tc为添加tc；azm为添加azm。
[0057]
由图5可知，ctrl(tc/azm)中变形菌门的相对丰度（ra）在所有反应器中最高，这表明添加乙醇可以促进变形菌门的生长，这可能是由于乙醇转化为乙酸所致。tc和azm中变形菌门的ra低于ctrl(tc/azm)，表明tc和azm的添加对变形菌门的生长有负面影响。这可能是在azm中观察到的乙酸含量低于对照的原因之一。重要的是，azm获得了厚壁菌门的最高ra（29.79%），其次是tc（27.00%）。甲烷产量与厚壁菌门的ra呈正相关，这与在azm中观察到的最高甲烷产率一致。在 tc 中也观察到了类似的现象。此外，azm和tc中的拟杆菌的ra均高于ctrl(tc/azm) ，可支持在azm和tc中获得的更高纤维素酶活性和甲烷产量的结果。在azm中检测到纤维杆菌的最高ra（5.38%），这也有助于纤维素的厌氧发酵。同样，与对照相比，tc中放线菌的较高ra可能是其甲烷产量较高的原因之一。在clx中观察到的衣原体门较高的ra可能是其甲烷产量低于对照的原因之一。
[0058]
如图6所示，在azm、tc和clx添加下，古菌的多样性和丰富度都发生了变化。具体来说，发现甲烷杆菌是所有样品中的优势菌属。然而，与对照相比，azm获得了显著降低的甲烷杆菌ra，考虑到azm中观察到的最高甲烷产率，推测添加azm主要通过乙酸产甲烷途径促进纤维素的甲烷生产。此外，在azm中观察到甲烷菌属的ra最高（5.26％），作为乙酸产甲烷菌，这可能是azm中检测到最高甲烷产量的主要原因之一。azm 中甲烷八叠球菌的ra也最高，也是纤维素厌氧发酵的另一个积极因素，因为甲烷八叠球菌的ra与厌氧发酵过程中的甲烷产率呈正相关。与对照相比，在tc中获得的甲烷球菌的更高ra也可能有助于其更高的甲烷产量。与ctrl(clx)相比，clx反应器显示出显著增高的甲烷球菌ra，因此，与ctrl(clx)相比，clx中产生的甲烷更少。
[0059]
图5中，others为其它，spirochaetes 为螺旋体门，chloroflexi 为绿弯菌门，caldiserica为衣原体门，actinobacteria为放线菌门，fibrobacteres为纤维杆菌门，acidobacteria为酸杆菌门，patescibacteria为巴氏杆菌门，bacteroidetes为拟杆菌门，firmicutes为厚壁菌门，proteobacteria 为变形菌门。
[0060]
图6中，others为其他，methanocorpusculum为甲烷粒菌，methanosphaerula为甲烷球菌，methanomethylovorans为甲烷食甲基菌属，methanospirillum为甲烷螺菌属，methanocellaceae为甲烷菌属，methanosarcina为甲烷八叠球菌，methanobrevibacter为甲烷短杆菌属，methanomassiliicoccus为产甲烷球菌属，methanosaeta为鬃毛甲烷菌属，methanobacterium为甲烷杆菌属。
[0061]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。