细胞破壁废水的处理方法及其在嗜盐菌发酵中的应用与流程

本发明涉及废水处理，尤其涉及一种细胞破壁废水的处理方法及其在嗜盐菌发酵中的应用。

背景技术：

1、聚羟基脂肪酸酯(pha)是一类完全由微生物合成的高分子聚酯的统称，相对于传统的石油基塑料产品，pha具有高度的生物可降解性和生物相容性，是一种新型的生物友好型材料，有助于解决日益加剧的塑料污染问题，对于“绿水青山”的建设具有重要意义。目前，pha主要通过对不同的工程菌改造后发酵生产获得，如发明专利cn202210353439.7通过对罗氏真养菌进行工程化改造以实现pha的生产。又如发明专利cn201010578858.8中提出了一株盐单胞菌(嗜盐菌的一种)，应用于pha的生产。即便嗜盐菌作为具有巨大潜力的下一代工业微生物，在高盐浓度所提供的外部条件下，具有开放式发酵、抗杂菌的优势，而且以盐单胞菌为代表的嗜盐菌进行pha的大规模生产时，还可以避免无菌发酵巨大的能耗，有效地降低成本。但pha的生产成本仍然相对高昂，阻碍了其商业化发展，具体体现在：在pha的提取工艺中，为了提高pha产品的纯度，通常先使用洗涤液，如水、生理盐水以及各种缓冲液(如pbs缓冲液)，对所述菌体沉淀进行1～5次的洗涤；然而，该洗涤后，仍然有大量的发酵代谢产物存在于菌体，为了进一步从菌体中提取得到pha，需要对细胞进行破壁处理，比如采用有机溶剂萃取法、物理机械破碎法、表面活性剂法或者酶法等对细胞进行破壁处理。并通过洗涤液等对破壁后的菌体再次进行清洗。因而，pha的提取工艺需要消耗大量的水资源，而且，pha的提取工艺所产生的废水处理和排放也会大大增加企业的生产成本。

2、为了解决上述问题，专利cn111362445b中提出了一种聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法，该方法通过将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第一固液分离，然后向所得发酵清液中加入吸附剂进行吸附处理，并进一步地将处理后的发酵清液进行板框过滤，最后将所述含盐发酵废液循环至聚羟基脂肪酸酯的发酵阶段使用，实现了将嗜盐菌进行pha发酵时产生的高盐废水进行重复发酵利用的目的，而且该方法还能够保障pha得率。但是，该方法仅适用于对聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行固液分离后的发酵清液，也就是说，该方法提供了pha提取工艺中针对菌体进行洗涤所产生的废水如何处理的思路，而如何解决对细胞破壁处理及其后洗涤所面临的水资源消耗大而处理难的问题仍然十分严峻。

3、鉴于此，提出本发明。

技术实现思路

1、在专利cn111362445b中提到：如果直接将产生的高盐废水进行重复发酵利用，因发酵废液中含有不溶性菌体碎片、变性蛋白、细胞毒素、色素等难以被利用的物质，会造成发酵体系粘度升高、溶氧和传质变差，从而影响发酵菌种的发酵效率。同时随着发酵废液的循环利用，这些物质不断积累会给后续的分离造成一定的困难，从而造成pha得率和纯度降低。而本发明在对细胞破壁处理及其后洗涤所产生的废水进行资源化利用的过程中，同样遇到了上述问题，特别是，相较于专利cn111362445b中的发酵清液而言，本发明中所述对细胞破壁处理及其后洗涤所产生的废水成分更加复杂，其不仅包括上述不溶性菌体碎片、变性蛋白、细胞毒素、色素等，还具有高盐、高碱性、高粘度的特点，采用一般的水处理方法，包括专利cn111362445b中的方法，即便能够较大程度上去除杂质以及有害物质，但处理后的清液均无法直接用于聚羟基脂肪酸酯的发酵阶段，且难以保证发酵菌种的发酵效率和后续pha得率。

2、因此，本发明提供一种细胞破壁废水的处理方法及其在嗜盐菌发酵中的应用，通过采用特定的纳滤膜对细胞破壁废水进行膜过滤，实现了对在细胞破壁处理及其后洗涤阶段所产生的废水的直接回用，而且该回用过程中有效保证了pha的产率，而且还进一步提升了嗜盐菌的菌株生长速率，缩短了生产周期。

3、具体地，一种细胞破壁废水的处理方法，所述细胞破壁废水是由嗜盐菌发酵液进行细胞破壁后得到，包括：将所述细胞破壁废水进行粗滤以去除其中的固体悬浮物和不溶性杂质后，再采用截留平均分子量为700da以内的纳滤膜进行膜过滤，即得含盐清液。

4、本发明中所选特定结构的纳滤膜对于破壁废水中不利于pha生产发酵的物质有良好的截留作用，特别是，纳滤膜对水中双价离子和多价离子的去除率在95％以上，可有效地去除钙、镁、碳酸根和硫酸根等多价离子，避免细胞破壁废水中残留微量元素对后续发酵的影响，也避免后续微量元素补充造成的微量元素的超标失衡；而且能保留有利于嗜盐菌生长的成分，如部分无机盐以及营养成分等，使该膜过滤后的含盐清液能够直接回用于嗜盐菌发酵培养基，该方法大大简化了工艺流程，而且节约了无机盐、配料以及水资源的使用，还减少了废水的处理压力和成本，显著降低了嗜盐菌用于生产pha的生产成本，本发明还意外地发现，该方法得到的含盐清液相较于由水和无机盐配置的含盐水更利于提高嗜盐菌的初期生长速率，大大缩短了生产周期，且pha产率高，优选为，采用截留平均分子量为200～700da的纳滤膜进行膜过滤。

5、优选地，根据本发明提供的所述细胞破壁废水的处理方法，所述含盐清液中含盐量≥20g/l，优选为20～30g/l。

6、为了提高含盐清液的利用价值，本发明将纳滤膜进行膜过滤得到的该含盐清液直接回用于所述嗜盐菌发酵过程中时发现，不同浓度下的含盐清液对嗜盐菌发酵体系的影响显著，若有利于嗜盐菌生长的成分太低或者太高，均会造成发酵体系各项指标不稳定，增加监控难度和操作复杂度，尤其是其中含盐量的影响尤为突出，往往需要补加盐类物质(如氯化钠)等才能用于pha的正常生产，因而，本发明通过大量数据对比得出，可以以所述含盐清液中含盐量作为关键指标对其进行监控，当所述含盐清液中含盐量高于20g/l时，该含盐清液直接回用于嗜盐菌发酵体系中，且该含盐清液中的营养物质浓度还起到促进嗜盐菌初期生长的作用，进一步优选含盐清液中含盐量为20～30g/l。

7、优选地，根据本发明提供的所述细胞破壁废水的处理方法，包括：所述含盐清液经反渗透膜处理至其含盐量高于20g/l。

8、通过对比发现，相较于其他浓缩方式，如热浓缩、膜蒸发浓缩、真空浓缩等，本发明以反渗透膜的方式不仅可以对含盐清液进行高效浓缩，且浓缩后的含盐清液中除了无机盐，所保留的大量的营养成分更适合回用于所述嗜盐菌的发酵过程，特别是有助于提高嗜盐菌的生长速度。本发明中的反渗透膜可通过商购获得。

9、优选地，根据本发明提供的所述细胞破壁废水的处理方法，当所述膜过滤时的压力为0.1～1mpa时，例如，可以为0.1mpa、0.2mpa、0.3mpa、0.4mpa、0.5mpa、0.6mpa、0.7mpa或者0.8mpa，能够在确保所得含盐清液能够直接回用于嗜盐菌发酵的同时，显著提高膜过滤的效果，进一步优选为0.3～0.6mpa。

10、优选地，根据本发明提供的所述细胞破壁废水的处理方法，所述粗滤为絮凝沉降粗滤，其中，絮凝剂为阴离子聚丙酰胺。

11、本发明还发现，由于阴离子聚丙烯酰胺分子链中含有一定量极性基能吸附水中悬浮的固体粒子，使粒子间架桥形成大的絮凝物。因此其能够显著加速所述细胞破壁废水中粒子的沉降，非常明显地加快所述细胞破壁废水的澄清，有效促进膜过滤效率以及保证所得含盐清液回用时所述嗜盐菌的生长等效果，当所述阴离子聚丙酰胺使用量为0.01～10ppm即可充分发挥作用，优选所述阴离子聚丙酰胺使用量为2～6ppm。

12、本发明还提供如上所述细胞破壁废水的处理方法得到的含盐清液。

13、本发明还提供如上所述嗜盐菌的发酵工艺，包括：将如上所述含盐清液部分或者全部作为所述嗜盐菌发酵培养基的溶剂，用于促进所述嗜盐菌的生长。

14、优选地，根据本发明提供的所述嗜盐菌的发酵工艺，所述嗜盐菌包括嗜盐细菌和/或所述嗜盐古菌，优选地，所述嗜盐菌为嗜盐细菌，进一步优选为盐单胞菌属(halomonas)的细菌及它们衍生菌株或其组合，更优选为单胞菌属下的任意种，例如halomonasbluephagenesis、halomonascampaniensis、halomonasaydingkolgenesis、halomonas aerodenitrificans、halomonas halocynthiae中的任意种。

15、进一步优选为halomonasbluephagenesis td01，保藏登记号为cgmccno.4353，从清华大学获得。

16、本发明的上述含盐清液部分或者全部用于促进嗜盐藻类的的生长。

17、优选地，根据本发明提供的所述嗜盐菌的发酵工艺，所述细胞破壁废水是由所述嗜盐菌发酵液经酶法破壁后得到。

18、相较于其他获得细胞破壁废水的方法，如有机溶剂萃取法、物理机械破碎法、表面活性剂法等，本发明在试验中发现，采用酶法破壁更优，其中，酶法破壁得到的细胞破壁废水经上述处理得到的含盐清液更利于促进所述嗜盐菌的发酵。

19、优选地，根据本发明提供的所述嗜盐菌的发酵工艺，所述发酵培养基是将各物料加入含有20～100％(质量百分数)所述含盐清液的溶剂中得到，优选为所述发酵培养基是将各物料直接加入所述含盐清液(即100％含盐清液作为发酵培养基的配制溶剂)中得到。

20、所述发酵培养基中盐的质量浓度不低于0.2％，优选为0.2～10％。优选地，按质量百分数计，所述发酵培养基中主要包括：0.1～20％葡萄糖、0～5％酵母粉、0.1～5％尿素、0～10％蛋白胨、0.2～10％氯化钠、0.1～10％其他无机盐、1.2～15％微量元素组分i和0.1～1.2％微量元素组分ii；

21、其中，所述其他无机盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵和氯化铵中的一种以上；所述微量元素组分i是将柠檬酸铁铵和氯化钙加入所述含盐清液中得到，且所述微量元素组分i中柠檬酸铁铵的质量百分数为0.2～4.5％，氯化钙的质量百分数为0.3～2％；所述微量元素组分ii包括七水合硫酸锌、四水合氯化锰、硼酸、硫酸锰、六水合氯化钴、五水合硫酸铜、六水合氯化镍和二水合钼酸钠中的一种以上。

22、进一步优选地，所述发酵工艺包括：

23、将用于生产的细菌接种到斜面瓶中进行斜面培养，得到斜面菌种；

24、将所述斜面菌种进行摇瓶培养至od600为2.5～5.0，得到一级种子；其中，一级种子的发酵时间为12～24h；

25、将所述一级种子继续进行摇瓶培养至od600为2.5～5.0，得到二级种子；其中，二级种子的发酵时间为8～24h；

26、将所述二级种子接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，得嗜盐菌发酵液；其中，二级种子的接种量为2～10％，发酵培养时间为8～48h；所述发酵培养是在通气和搅拌的条件下进行；在所述发酵培养期间，所述搅拌的初始转速为200～300rpm，发酵培养6～10h后，转速稳定在600～800rpm；所述通气的通气量为3～5l/min；所述发酵培养的温度为20～45℃；所述发酵培养基的初始ph值为4.5～10；所述发酵培养基的初始溶氧为10～100％。

27、本发明的细胞破壁废水的处理方法及其在嗜盐菌发酵中的应用，是通过采用特定的纳滤膜对细胞破壁废水进行膜过滤，可去除细胞破壁废水中大部分对菌体有害的有机杂质，使得细胞破壁废水处理后成为对菌体无毒害作用的含盐清液，全部或者部分代替溶剂直接回用于嗜盐菌的发酵培养基配制中，既可以降低辅料成本、减少水资源的损耗，也可以减少废水的处理压力，减少三废排放，因此，本发明提供的方法是一种低成本、高效可行的处理方法。此外，本发明的细胞破壁废水的处理方法所得的含盐清液代替纯净水源用于发酵，其中残留的营养物质进行嗜盐菌的生长和pha的生产，经验证可有效保证pha的产率，而且还进一步提升了嗜盐菌的菌株生长速率，缩短了生产周期。