用于分离物体的电泳方法和装置的制作方法

专利名称：用于分离物体的电泳方法和装置的制作方法
专利说明用于分离物体的电泳方法和装置 本发明涉及用于在流体中对物体实施电泳分离的方法和装置。所述技术消除条带扩散，并且实现快速、高分辨率的分离。
电泳表示在电场影响下带电物体穿过流体而移动。此现象可用于根据物体电学性质与流体力学性质来分离物体，而且许多利用此现象的技术被广泛应用。待分离的物体，通常是蛋白质或者其它生物分子，通常悬浮在流体比如缓冲溶液或凝胶中。将一小段含有物体的溶液置于含流体或凝胶的分离通道的起始位置，接着沿通道产生恒定电场。在该电场影响下所述物体开始朝通道的对侧运动。在它们穿过流体迁移时，根据它们的形状和大小，它们受到差异性流体动力。由于施加于它们的不同流体动力，根据它们各自的特征，物体以不同的终速度移动，并因此而分离和形成“条带”。由于它们不同的终速度，条带之间的距离随时间增加。
条带基本是一组具有相似电学和流体力学性质的物体。电泳的一个关键缺点是这种事实，当条带以其终速度移动时发生热扩散。这使得条带随时间而变宽，从而降低了分离的分辨率。
在“Cyclic electrophoretic and chromatographic separationmethods”，Eijkel et al，Electrophoresis 2004，25，243-252中对各种已知电泳方法做了综述。
也有许多传统电泳方法的改型用以尝试限制热扩散。
这些方法之一是等电聚焦(IEF)，其在分离通道中设置pH梯度。当物体在恒定电场影响下穿过流体移动时，由于沿通道的pH值改变，物体表观电荷发生改变。根据它的电荷性质，每个物体一直移动到其表观电荷为零的点。这个点叫做“等电点”。在此点物体停止移动，因为它到达了平衡位置。每个具有不同电荷特征的物体停止在沿通道的不同点上，因此物体发生分离。然后，可以对物体的条带进行检测和研究，例如通过成像。
此方法的优点在于消除了热扩散，而缺点是pH梯度的精确性有限制。另一个缺点是增加了分离时间(典型的是数小时)。
另一种电泳改型在US-A-2002/0043462中公开。通过施加由于穿过腔室的缓冲液流动而产生的第一力来分离颗粒，其中液流方向与电场梯度相反。静电场的形状使得颗粒沿腔室分离成条带。这些条带代表平衡位置，在此位置上每个分子受到的净作用力为零。一旦条带形成，可改变所施加的电场以对条带进行操作，例如移动感兴趣条带至退出点(exit point)。但是与其它已知系统的情况一样，此装置依赖于缓冲液穿过腔室的恒定流动，以向每个颗粒施加适当的流体动力，并因此而实现成功分离。这导致了许多问题。
首先，需要泵和监测系统来达到高度准确的穿过通道的液体流动，这导致了可能昂贵且复杂的基础设施。结果，系统通常昂贵且可能不可靠，包含了许多复杂的机械组件。缓冲液流动的准确性对于装置的准确度和分辨率来说是必需的。
其次，与使用流动液体相关的并且在压力驱动流动的高效液相色谱(HPLC)中十分严重的一个常见问题是，液体与通道壁相互作用。结果，液体不以恒定速度穿过通道截面，而是在通道壁附近移动较慢，在通道中央移动较快。这形成了一个抛物线形的速度前沿，其直接影响所分离分子的条带形状。距离恒定速度前沿偏离越多，条带就变得越宽，因此降低了装置的分辨率。可通过增加缓冲液流速来加速分离过程。这是由于分子到达其平衡位置所耗费的时间缩短，因此分离将更快完成。在第一种方法中，增加流速也应使得静止条带(stationaryband)变窄，因为所施加的流体动力和电场力更大。这将会提高分辨率。
但是，随着流速增加，抛物线流形更加严重，倾向于抵消预期的分辨率提高。
传统电泳经常涉及使用凝胶作为分离流体。相对高粘度减少了扩散，于是提高了分辨率。但是，将凝胶与需要缓冲液流动的技术(比如以上两种方法)一起使用，若非不可能，也是困难的，因为凝胶通常不易于流动。
需要的是这样的技术，其有效控制热扩散，并且不需要分离流体穿过装置的恒定流动。此种方法应实现快速分离和高分辨率。
根据本发明，在分离通道所含流体中分离物体的电泳方法包括 沿分离通道施加电场，所述电场具有一定的场分布，从而使至少一些物体相对于流体移动； 改变所施加电场以调节相对于分离通道的电场分布，从而使物体在由于电场的电场力和由于流体的流体动力的联合影响下分离成条带。
另外，根据本发明，用于分离物体的电泳装置包含 分离通道，使用时其含有流体和待分离物体； 沿分离通道施加电场的装置，所述电场具有一定的场分布，从而使分离通道中的物体相对于流体移动； 适用于施加和改变所施加电场以相对于分离通道来调节电场分布的控制器，由此使得分离通道中的物体在由于电场的电场力和由于流体的流体动力的联合影响下分离成条带。
应了解，术语“流体”在此用于描述任何适宜的分离介质。例如，流体可以是液体、凝胶、筛分介质或者对移动中物体可产生摩擦力或流体动力的任何其它材料。
通过从基本上分离过程一开始(与条带形成以后相反)就相对于分离通道来改变所施加的电场，可以不需要流体穿过分离通道流动而将物体分离成条带。所施加的电场建立了一个随时间变化的场分布，其通过使颗粒穿过流体移动而实现电泳分离，因此流体自身可以静止。应注意的是，电场沿至少一部分场分布是非恒定的(相对于通道)。换句话说，施加了(非零的)随时间变化的电场梯度。结果，物体分离成不随时间变宽的移动条带。
这避免了对复杂而昂贵的泵设备的需要，并且消除了与传统系统中所遇到的抛物线形速度前沿相关的问题。另外，所述技术可良好地适用于以凝胶或筛分基质作为分离流体，因为不需要流体流动。具体电场及其变化将根据待分离物体的类型以及用作分离介质的流体来决定。但优选的是，电场变化方式使得场分布相对于分离通道移动。
当其移动时，场分布可以改变其形状和/或强度，但更优选的是，当其相对于分离通道移动时场分布保持不变(即保持其形状和强度不变)。典型地，将条带沿通道分离是方便的，因此以电场分布沿分离通道变化的方式来改变电场是优选的。
根据待分离的物体，维持一定程度的流体穿过通道的流动是有利的。但是，如上所述，如果可以消除流体流动则通常是有利的，因此，优选流体和分离通道相对于对方基本保持静止。
所施加电场的具体形状将根据期望的装置输出来选择。但是，典型地，电场分布的形状使得每个物体所受到的净作用力应致使每个分离条带的宽度随时间基本保持恒定，这种净作用力来自于由电场产生的电场力和由流体产生的流体动力的联合作用。优选地，场分布使得条带获得有限宽度(典型地是沿分离通道)，每个条带中物体的扩散是受约束的或受限制的，使得只要实验条件保持相同，条带宽度不随时间改变。在下文中，其被称为“受限扩散”(bound diffusion)。
一旦物体被分离成条带，电场可以被撤去。然而，有利的是继续施加和改变电场，使得一旦物体已分离成条带，则每个条带以相对于分离通道的非零终速度运动。因为持续移动的条带不随时间扩散，所以这样保持了高分辨率。
在传统电泳分离中，不同条带以不同的终速度移动。换句话说，当它们穿过缓冲液或凝胶移动时，它们互相之间分离的越来越开。假定相对距离的增加比扩散引起的条带变宽更快，随着分离长度更大(即分离通道更长)时电泳的分辨率增加。但是，由于扩散的原因，信号随时间减弱，并且非常大的分离通道是不实际的。因此，实践中，当条带到达通道末端时会发生“条带丢失”。相对而言，在本发明中，优选条带以基本相等的终速度移动。因此分离效率不依赖于分离通道的长度，而取决于所施加的随时间变化的电场的性质、以及分离缓冲液的性质。优选地，每个条带的终速度基本相同，因此维持相互之间的间隔。更优选地，终速度随时间保持恒定。
有利的是，所施加的电场是根据公式 E(x，t)＝E((x-kt)n) 其中x是空间坐标，典型的是沿分离通道，t是时间坐标，n和k都是实数且n不是零。换句话说，E(x，t)可以是x-kt的任何函数，包括线性、指数或n次幂多项式。另外，如果至少一部分电场相对于沿通道的距离(x)是单调的，则这是有利的。这有助于样品分子的分离以及条带扩散的限制。
方便地，所述方法进一步包括以下步骤将待分离物体与流体混合以及将混合物置于分离通道中。作为替代，可将流体置于分离通道中，然后再将样品插入其中，样品包含至少待分离物体。样品还可包含流体，其可以与分离通道中已有流体相同或不相同。这些步骤可在施加电场之前进行或者在设立电场时立即进行。在样品加载的一些方面，可在电场开启时将样品加入通道内。这对于闭环分离尤其有用。例如，在DNA测序中，在单次分离实验中发生四次分离开的注入。在许多应用中，顺序注入可以是有用的，通常这些发生时，电场已预先打开。
优选地，所述方法还包括检测条带的步骤。典型地，对条带成像。成像或者检测可发生在分离完成以后或者在分离过程中。有用的结论实际上可以来自作为时间函数的条带的“增加分布”(risingprofile)。具体地，为了将那些条带与既定注入相关联，例如在DNA测序中，相对于顺序注入的条带增加分布可以是非常有用的。
有利地，所述方法还包括在物体已分离成条带之后改变电场的步骤，以调节条带之间的间隔、条带定位或条带分辨率。例如，这可通过改变电场分布的形状、强度或其沿分离通道的位置来实现。例如，这可用于观察不同范围的条带、沿分离通道移动条带到特定点、或者调节可分辨的条带的数目。具体地，可通过改变其时间依赖性和/或其强度来改变电场。
一些应用包括从样品混合物中除去某些已分离的物体。在这种情形下，所述方法优选还包括在物体已被分离之后从分离通道中提取感兴趣条带的步骤。
有利地，所述方法还包括振荡电场的步骤，使得条带向相反方向移动，因此条带沿分离通道前后移动。这允许每个条带被重复成像或者检测，因此可增加装置对于低浓度组分的敏感度。使条带在围绕闭环分离通道的回路中运动也可实现此目的。
在另一些实施方案中，分离通道是闭合环，在这种情形下，优选所施加电场围绕该环是周期性的。在所有的实施方案中，施加电场的手段可以包括任何已知的电场形状控制装置(field shapingapparatus)，例如沿通道的可变电阻。然而，施加电场的手段优选地包括沿分离通道间隔分布的很多电极。此技术允许准确且复杂地控制电场形状，并且这可通过单独改变施加于每个电极上的电压来方便地控制。电极优选地与分离通道的内部隔开，使得电流不通过电极和流体之间。这样避免了电流穿过分离流体，从而防止过多焦耳热，其可导致系统的无规律行为。方便地，所述电极包含导电油墨，其印在分离通道上或其邻近位置。
有利地是，所述电极中至少一部分与分离通道内部由电阻材料层分隔开。以此方式，通道内所建立的电场更平滑，更少被电极的局部效应所扭曲。电阻材料优选半导体或掺杂半导体，更优选掺杂硅。
分离通道优选是毛细管。其尺度允许在通道截面上准确控制电场，使得即使低浓度的样品也能有良好分辨的条带。在一个优选实施方案中，分离通道是直线形。作为替代，分离通道可以是闭合环的形式。这可以基本上是圆形或者，优选地具有线形区段。
分离通道方便地在基底比如玻璃板中刻出。这提供了在非常小规模执行所述装置的方便方法。该装置优选是微流体学装置。
有利的是，所述装置包含很多分离通道，每个分离通道带有施加电场的工具和控制器。可根据每个通道中待分离的物体单独选择施加于每个分离通道上的电场。但是，优选每个分离通道施加的电场是相同的。方便地由同一控制器控制施加于每个分离通道上的电场。待分离物体优选包含生物分子、蛋白质、聚合物、DNA、RNA或者生物细胞。
将参考以下附图对根据本发明的电泳装置和方法的实例进行描述。


图1表示电泳装置的代表性示意图； 图2a、b和c描述示例性电场分布及其随时间的变化； 图3a和3b是举例说明颗粒所受的力的示意图； 图4表示分离过程中示例性分子的速度随时间的收敛； 图5是举例说明相同颗粒的共迁移(co-migration)的示意图； 图6表示用于分离物体的电泳装置中一部分的第一实施方案； 图7表示用于分离物体的电泳装置中一部分的第二实施方案； 图8表示用于分离物体的电泳装置中一部分的第三实施方案； 图9表示用于分离物体的电泳装置的第四实施方案中分离通道的配置； 图10举例说明无速度校正的弯曲通道中的条带分离； 图11举例说明有速度校正的弯曲通道中的条带分离； 图12是举例说明双电场梯度的示意图； 图13表示第一示例性电极配置； 图14表示第二示例性电极配置； 图15表示第三示例性电极配置； 图16表示第四示例性电极配置； 图17是图16中所示配置实例沿线Q-Q`的截面视图； 图18A示意性表示第五示例性电极配置一部分的俯视图； 图18B表示对第五示例性电极配置计算的电场线； 图18C表示沿图18A所示通道中央的电压分布； 图18D表示沿图18A所示通道中央的电场分布； 图19A示意性表示第六示例性电极配置一部分的俯视图； 图19B表示对第六示例性电极配置计算的电场线； 图19C表示沿图19A所示通道中央的电压分布；和 图19D表示沿图19A所示通道中央的电压分布； 图20表示用于与用来分离物体的电泳装置一起使用的检测器的第一实施方案； 图21表示用于与用来分离物体的电泳装置一起使用的检测器的第二实施方案； 图22示意性表示使用常规技术将样品导入分离通道的步骤； 图23和24表示两种将样品导入分离通道的方法，其在使用如本文所公开的电泳装置中可以利用； 图25至28举例说明示例性DNA链的测序； 图29a、b和c表示在常规毛细管电泳条件下分离的两条DNA条带的示意图； 图30a、b和c表示在使用如本文所公开装置的相似条件下分离的两条DNA条带的示意图；和 图31a、b和c表示在使用如本文所公开装置的相似条件下分离的代表更长分子的两条DNA条带的示意图。
电泳装置1包含分离通道2，用于沿分离通道2施加电场的装置3和用于控制至少所述电场的控制器4，例如分离通道2可在毛细管或微流体芯片中实现。分离通道2包含流体9，例如其可以是所选的缓冲液或者凝胶。待分离物体10被悬浮在分离通道2中的流体9中。装置1可另外带有检测器6，其可分别与控制器4、以及输入和输出端口7和8通信，其也可被控制器4控制。控制器4进而产生输出5。
如下文更详细的描述，分离通道2可采取任何形状，包括线形或曲线形。在一些实施方案中，分离通道可形成闭合环。电场施加装置3可包含，例如场成形电极或沿通道2的可变电阻。待分离物体通常包括至少一些带电体，典型地包含聚合物比如蛋白质、DNA分子或RNA分子或其它类型的生物分子比如生物细胞。具体分离流体9的选择取决于待分离物体10。例如，流体可以是液体或气体，例如缓冲液。作为替代，流体可以是凝胶或者其它筛分介质。后者是可具有孔的材料，所分离的物体在移动时必须穿过所述孔。这导致了施加摩擦力，所述摩擦力是物体形状/大小的函数。摩擦力与流体动力相似但不相同，因为它们服从不同的法则。实际上，可以选择能对迁移中物体(如大分子)产生摩擦力或流体动力的任何流体、凝胶基质或其它筛分材料。有利地是，可以使用凝胶作为分离介质，还由于其粘度增加而减小了所分离物体的不希望的扩散。这一点通常在需要恒定流体流的常规系统中是不可能的。
在操作中，通过电场成形装置3沿分离通道2施加电场E。控制器4包含模块4a，其控制电场施加装置3，使得在分离通道2及其内容物上诱导随时间变化的电场。电场在每个物体10上产生力Fe，其与物体电荷q成比例。这使得物体10相对于流体9移动，其导致对物体的流体动力(摩擦力)FT。例如，图1示意性显示三个这样的物体以及它们每个所受的力。
计算电场随时间的变化，使得推动分离通道2中的物体10开始迁移，并聚集成沿分离通道2迁移而不扩散(变宽)的条带。可通过与另一控制模块4b通信的检测器6对迁移条带进行成像、或者检测。如果需要，可通过退出端口8从分离通道2中提取选定的感兴趣条带，这也受控制器4的模块4c的控制。
根据待分离物体10的类型以及分离流体9的性质来选择电场的具体形状和特征。但是，在所有情形中，电场将具有一定的场分布。换句话说，电场值沿分离通道长度的至少一部分发生变化，即应用随时间变化的电场梯度。典型地，根据下式向通道2施加随时间变化的电场E (1.1)E(x，t)＝E((x-kt)n)，

且n≠0，
其中x是空间坐标(典型地为沿分离通道2的距离)，t代表时间，n和k是常实数
应理解，所述电场可以是线性或非线性，例如指数型或者n次幂多项式型。线性和非线性场的示例分布如图2a、2b和2c所示。优选场分布的至少一部分是单调的，也就是说，它的一阶导数(对于沿通道的距离)不改变符号。这促进样品分子的分离，并且限制条带扩散。优选地，单调部分相对于参数k应取正确符号(correctsign)。更优选地，电场沿场分布的至少一部分应是连续的，即电场没有突然的跃变。另外应注意的是，场分布可沿分离通道在两个方向上(+x或-x)移动。
作为举例，我们将研究当n＝1时最简单的线性场分布的例子(α和c作为常量被引入) (1.2)E(x，t)＝α(x-kt+c)，
这种场形状对于一系列增加的时间t1、t2和t3示意性表示于图2a。应注意场分布沿x轴有效移动。
对于带有电荷q的颗粒或物体10，电场力Fe为 (1.3)Fe(x，t)＝qE(x，t) 在本发明中颗粒10将在流体9中移动，因此将有摩擦力(流体动力)FT，对抗其移动。此作用力在一般性最简化情形下为如下形式 (1.4)FT(x，t)＝fv(x，t)，f＞0且
其中v(x，t)表示颗粒10的速度，f是描述摩擦强度的系数，其取决于颗粒10的形状和大小。当受到这两个力的作用时，每个物体10将试图迁移到它的平衡(最低能量)位置，在此处Fe-FT＝0。这在图3a中表示为x＊，且它以速度k移动。例如，假定两个同样的颗粒在位置x1和x2(图3b)出发。在x1，电场力大于在x＊处的电场力，x＊处电场力进而又大于在x2处的电场力。这导致差别的速度，其中v1＞k＞v2。
因此，在x1出发的物体移动速度大于k，并且追上移动点X＊(其以速度k移动)。物体在追赶x＊时，它相对地向较低值的电场力分布移动，因此它减速直至达到速度k。然后它相对于电场力分布的位置保持不变，因此它从此以恒定的终速度k移动。
图3b表示两个同样的颗粒如何获得排序后(sorted)速度，使得最终以速度k共迁移。
现在目标是计算速度v(x，t)(相对于分离通道)。对于颗粒10的既定初始条件组合，只有一个坐标是独立的，即t。因此，我们需要计算v(t)和x(t)。物体10的加速取决于电场力和摩擦力共同作用的净作用力，其中电场力与摩擦力典型地互相对抗(见图1)。由此给出 其中m是颗粒10的质量。通过代入，上式变为 通过将以上方程对t求导(改变记号)，我们得到 (1．7) mv”(t)＝qα[x’(t)-k]-fv’(t) 其中x’(t)＝v(t)。因此上面的方程变为二阶线性微分方程 (1.8)mv”(t)+fv’(t)-qαv(t)+qαk＝0 其有如下解 其中A和B是取决于初始条件的常数。第一项在t→∞时是潜在离散的。但是如果满足以下条例件 (1.10) (1.9)的左边项在t→∞时变为零。
对于t＝0我们可选择速度为v0 v(0)＝v0 (1.11) ∴k+A+B＝v0 _B＝v0-k-A 我们需要另外的初始条件来确定A。通过对方程(1.9)求导，t＝0时我们得到 根据定义x＝x0和方程(1.6)，在t＝0时得到 通过使(1.12)和(1.13)相等，我们可解出A 代入方程(1.11)我们得到B的最终解 现在我们已根据初始条件{t＝0，x＝x0&v＝v0}计算出参数A和B， 因此现在我们从方程(1.9)已知速度v(t)。
假设条件(1.10)不变，我们可得到 因此颗粒10的速度会聚在等于场参数k的终速度上。另外，从方程(1.16)中我们观察到，速度将会聚到k而与f、α、q和m的值无关。换句话说，所有形状、大小和电荷(倘若如条件(1.10)所需，电荷符号正确匹配到电场)的所有颗粒将会聚到相同的终速度k。
图4显示将运动方程应用于具有任意特征的分子。速度会聚到一个稳定值，其为终速度。
为了区分条带，必须将具有不同形状和电荷特征的颗粒物理性分离开，并形成明显区分的条带。简而言之，所有的物体10(因此以及条带)应达到相同的终速度，其应为恒定的。如果所有的颗粒10达到相同的终速度并且以叠加的形式共迁移，则装置不是有效的。颗粒10的空间位置是 (1.17) dx＝v(t)dt 代入方程(1.9)到上式并积分，我们得到 以及因此 一旦颗粒10到达终速度，指数项是非常小的，方程(1.19)变为 这意味着每个颗粒10将移动一定距离，该距离由它的终速度加上取决于颗粒的电荷、质量和摩擦特征的固定量来决定。因此不同颗粒将以相同速度迁移，但是相互之间的固定距离不相同。
如果起点x0不同，相同颗粒也共迁移。这可通过考虑从两个不同位置x1、x2出发的两个相同颗粒来证明。通过对两个颗粒的方程(1.20)相减，我们得到 (1.21)x1(t，m，q，f，x1)-x2(t，m，q，f，x2)＝0，t→+∞ 因此即使相同颗粒在沿着分离通道的不同起点上出发，它们也将共迁移。图5使用两对相同的颗粒证明了这一点。颗粒(1)和(4)共有相似的电学和流体力学特征，物体(2)和(3)也是。一对中的各个颗粒在沿x轴的不同位置上出发。通过施加适当的随时间变化的电场，颗粒沿着使相同颗粒共迁移的轨迹。不同的物体对以相同速度移动，但相互距离不同。通过控制场参数k和强度α，可调节装置的分辨率(即条带宽和/或沿x轴的间距)。也可对于给定长度的分离通道2调节装置的动态范围(待分辨的电荷、质量和摩擦特征的范围)。
应注意的是，上述情形，包括所施加电场的性质及作用于物体10的流体动力的性质，仅仅是示例性的，并试图非限制性地举例说明本发明的原理。实践中，可选择对待分离颗粒适宜的电场分布的形状。根据这个形状，可规定在给定通道长度中以给定分辨率进行分离的物体的动态范围(关于电荷和摩擦系数)。
例如，如果样品含有的物体中大尺寸的(大的摩擦和电荷)比小尺寸的(小的摩擦和电荷)更稀疏，则选择“下凹型”场分布，比如图2b中所示的那样，将“压缩”较大尺寸的使彼此更接近，而较为紧密分布的小尺寸将较分散。这使得当需要时在较密集区域中实现较高的分辨率，允许用户“放大”条带串中的特定部分。哪些部分被压缩以及哪些被扩展取决于场分布曲率的符号。
但是，所有实施方案共同的是应用随时间而相对于分离通道2调节的电场分布。这使得带电物体10连续受到电场力，使得它们相对于流体9运动。结果，流体连续施加流体动力。这些力的共同作用导致高效的分离，并且，重要的是，使条带不随时间而扩散。
在优选实施方案中，流体9没有穿过通道2流动。这消除之前讨论过的与抛物线形速度前沿有关的问题，并且允许装置达到明显更高的分辨率。也消除了对昂贵的泵网络的需要。但是，设想替代性实施方案中有一些流体流过通道。在电场必须以不可能实现的快速改变以达到有效分离的情况下，这一点可以是有利的。但是，在大多数情况下，预期消除流体流动有更大的益处。
也就是说，可通过电渗流(“EOF”)在通道中建立(有意的或无意的)流体流动。这是所施加电场以及流体和分离通道内表面的电学性质的共同作用所造成的现象。如在传统电泳系统中，通过选择合适的表面化学来停止EOF或将其控制在最优值(其可以是零)。通过对通道壁进行处理来在化学上控制通道壁与流体之间的相互作用。也可改变电场的设置来使得EOF发挥作用。
图6、7和8显示了三种优选的实现方案。可提供许多不同形式的分离通道2，尽管在每种情况下都优选设置成基本上水平的(即通道2应处于一个水平面中)。这避免了重力干扰流体过程。在图6的实施方案中，分离通道2是毛细管，其在使用时容纳有流体9和包含待分离物体10的样品。分离通道2的一部分被一系列环形电极3a到3e环绕，其提供了沿通道2施加电场的装置3。每个电极3a到3e上的电压受控制器4(图1)的控制。应注意的是，图中所显示的电极的数量只是用于举例说明。
图7显示第二个实施方案，其中以在衬底12上刻划通道的方式提供微流体学分离通道2。衬底12可以是例如玻璃、石英或聚二甲基硅氧烷(PDMS)板或半导体芯片。一系列电极3a、3b、3c等沿分离通道2布置，并构成沿分离通道2的至少一部分施加电场的装置3。孔7和8提供输入和输出端口，用以将样品引入分离通道2和/或从通道2提取它的一部分。下文将对此进行更详细描述。
电极3a、3b、3c等受控制器4的控制，使得提供时间依赖性的电场。分离通道内的物体分离开并在分离通道内形成以(优选)恒定速度移动的条带。在上文描述的线形实施方案中，可让电场振荡以使得条带沿通道2前后运动，从而允许对同一条带的多次检测。这可以增加对低浓度组分的灵敏度。
作为线形实施方案的替代，可提供闭合环形式的分离通道2，其一个实例如图8所示。所述环可以是圆形的(即具有如图8中所示的圆形俯视图)，但是如果通道2有直形截面，尤其在检测区域，实际上可能是有利的。在通道2周围间隔提供电极3a、3b、3c......3p，从而构成电场发生装置3。通常，电极如图8所示以对称形式放置。所施加的电压也可是对称的，如图8所示的值V0到V8。
当施加随时间变化的电场时，在左边半圆或右边半圆的物体10(假设它们带有相同符号电荷)发生分离，以顺时针或逆时针方向运动。相反半圆中的分子不发生分离，但是以不规则形式运动，直到进入另一个半圆。这是因为在一个半圆中的分子将受到一种电场梯度，该电场梯度与时间依赖性矢量k非适当性匹配。给定的一组电场参数将只允许一定范围内的电荷和摩擦值在给定分离长度上得到分离。当落在这个范围内的迁移分子完成了一整圈，所有这些分子同步运动，并分离成条带。所得的条带串列持续围绕通道2旋转，可对其重复进行检测。
分离通道2可以是直的或弯曲的或两者的结合。相同的原理应用于任一装置上，此外还有弯曲通道所需的速度修正(见下文)。图9显示一个同时具有直形和弯曲通道的实施方案的网络示例。在此例中，分离发生在圆形通道13、14中。一种分离策略可以是有在多个点流体相连的许多同心圆(或许多平行的线形通道)。外圆13(或第一线形通道)13的场参数设置成给定的初始条件，以实现此通道中的初始分离，该通道可能显示大图(宽的摩擦电荷空间)。然后在此空间的个别窗口紧挨传送通道15通过时，切下它们(见图9)，然后将它们传送到相邻的分离通道13’，其具有不同的电场设置，以使分离集中于所选择的摩擦电荷窗口。以这种形式，可选择许多窗口并将其传送到不同的分离通道，这些分离通道具有对样品中此特定部分分离进行优化的场设置。例如DNA测序可自动地切成各个碱基对范围，并以非常高的碱基对读取速度分开测序。
其它策略可涉及不同的大分子。例如一些环16可标记为储存环，在此分离蛋白质被传送并储存在期望的缓冲环境中。另一些环17可用作混合通道。也可有“反应环”(或通道)，在此所传送的大分子暴露于期望的化学试剂，它们在沿分离通道移动的同时发生反应。化学反应的产物可根据标准分离原理自动与母分子分离，并在反应发生过程中实时显示。
另外，温度和其它环境参数也可以在每个环(通道)中受控，以获得受控的反应。例如，蛋白质折叠可通过在分离蛋白质的通道中逐渐增加温度来监测。在给定温度下，蛋白质将去折叠，在它们沿分离通道移动时，那些蛋白质的电动性质将发生改变，由此而观察到这一事件。
为了以下目的(以及其它)，样品收集和注入孔可置于沿分离通道或环的选定位置用凝胶或缓冲液填充通道，用化学剂冲洗通道，样品注入，样品收集和其它。
在弯曲形分离通道中(例如圆形)，沿通道外周移动的分子必须比沿内周移动的分子速度更快，以使得它们保持同相和形成连贯的条带。如果没有施加这样的速度修正，靠近外周移动的分子变得与内周分子不同相，条带形成扩展的螺旋形(图10)。这可通过在环形通道的任一侧设置电极来阻止。控制电场施加装置3，使得外部电极将产生随时间变化的场，其具有比内部电极所产生kinner稍高的参数kouter。在大多数情况下，如果外部和内部电极在相同的角位置是同相的，即它们在任意一个时刻下都带有相同电压，这就是充分的。在内部和外部电极上不同电压施加的情况下，由于外部和内部电极之间的距离小，细微不同的电场将在两个电极之间插入，对于外周和内周之间的位置产生中间场值，导致如图11所示的连贯条带。
应注意的是，如果电极度放射状扩展(即布置每个电极使得其与分离通道的内周和外周相交，并指向弯曲的中心)，也可实现对k的自动修正。这是因为电极上的电压串列将在给定时间段内完成一整个循环，而无论放射的位置。
应了解，对于在分离通道上建立电场分布(如上文所述)需要非线性电压分布。为了在每个上述实施方案里实现此点，建议通过一系列电极3a、3b、3c等沿分离通道施加随时间变化的电场分布。电极可与分离缓冲液非电接触，但是与其非常接近。这样的一系列电极将在分离通道内部产生静态电场。这种设置的好处在于，首先因为电极之间没有电流，功率源的功率消耗非常低。其次，可放置电极使之与分离通道有一段(很小)距离，使得电极阵列的离散性而造成的对电场的局部效应变的平滑。实际上，电极离分离通道越远，通道中的电场越平滑。
但是，这种设置有一个缺点。对极性电介质比如水性缓冲液施加静电场将被介电系数阻尼，其中对于水溶液，介电系数通常为80左右。为在流体内部有效产生电场，必须考虑场变化速率、介电常数、介质的电导率。典型地，由相同电荷在水中所产生的电场比在空气中(介电系数1)产生的电场小80倍。这意味着在所述装置的一些设置中，需要施加非常高的电压。这需要特殊的HV供应和仔细考虑植入电极处的介电材料，以避免介电击穿和在电极间形成火花。这个问题可通过使用与分离缓冲液电接触的电极来避免。通过在导电的分离缓冲液中产生电流来产生高电场要容易的多。
为改进电场产生，可配置外部(非接触)和内部电极的组合。例如，如图12所示，在大多数情况中，在任意时刻沿通道的电场梯度由常量和变量部分组成。恒定场E0(大多数情况下显然是最大的)可通过在两个位于分离通道相反两端的电极3X和3Y之间施加电压来实现。接着，如图13和14所示可通过沿分离通道的外部电极阵列添加梯度En。在图14中，电极3a、3b、3c等等是外部的，即与流体接近却不接触，而电极3’a、3’b、3’c等等是内部的，即与流体电接触。
在圆形通道的情况下，并不清楚哪儿是分离的“末端”。事实上，两个相对的内部电极必须围绕通道与分离同相旋转。因此，在这种情况下，需要内部电极阵列。应注意在理论上并且在每个时刻只有两个内部电极携带电压。那两个电极可在沿直径相对的位置。图15显示了交替的内部和外部电极的这样一种设置。外部电极产生时间依赖性的静电场梯度，并形成了该装置的特殊分离原理。静电场被添加到内部电极产生的恒定电场之上。
图14显示，沿微流体通道的交替的内部和外部电极的布置。应注意，内部和外部电极都可布置在沿分离通道的任一侧，或者可以密封地围绕它以实现沿通道最平滑可能的电场。
可以单独通过内部电极阵列产生所述电场。但是，与分离缓冲液电接触的电极预期使沿通道的每个电极位置处的电场产生显著变形。分离分子在非常接近电极的地方(接触)通过，“感受”到电场变形。这将降低分辨率。在通过在通道的任一端只使用两个电极而只产生恒定电场的情况下(传统电泳)，不存在同样的问题，这是因为分子在电极之间分离，并且永不会靠近它们。
事实上，因为电场沿通道变化非常敏锐，在一些情况下，内部电极阵列造成的变形对此处所公开系统的分离原理造成显著影响。另外，电极的径向尺寸可起到重要作用。例如，如果我们假定大约100微米长(沿通道)的平电极，两个带有相同电压的相对电极之间的电场将为零。这是因为电压在相对电极之间的空间没有径向(沿通道)变化，因此电场在该区域趋向于降为零。这加剧了内部电极造成的局部变形。
但是，如上文所讨论的，考虑到需要更简单的电路和更低的电压，使用内部电极有显著优势。
降低内部电极导致的局部变形的一种方法是在分离通道中电极和凝胶之间设置电阻性介质。因此，在另一个实施例中，可沿通道布置多个电极点，与带有电阻的材料相连接。在每个点上施加电压阵列，并且所述点之间的电阻插入两点之间的电场，使得电场更平滑。图16显示此种设置的一个实施例，其中使用两个半导体层11来代替通道2的侧壁。电极3”a1、3”a2、3”b1、3”b2等放置在这些电阻层11的外侧，其具有使分离通道2内部所产生电场变平滑的作用。电阻材料11可以是掺杂硅或者在电阻率和介电常数方面具有期望性质的任何其它介质。由于其电阻率可跨多个数量级进行控制，掺杂半导体是具有吸引力的。另外，这样的材料通常趋向于生物相容性(即化学惰性)，并且尤其对于硅，用于建立微观结构的可用技术不昂贵且广泛可用。
图17显示图16中举例说明的结构沿着线Q-Q’的构造的截面。在截面中央显示了包含分离介质9的分离通道2，其任一侧设置有电阻材料层11。内部和外部电极3”a1和3”a2位于电阻层11的外侧，使得电阻材料位于电极3”a1、3”a2和分离通道2之间。
我们使用了有限元算法来计算场形状及其在有和没有电阻层11时的平滑度。在第一个实例中，将铂电极置于没有电阻层11的分离通道2的侧壁。电极之间的距离是1毫米，并且它们的径向(z方向)尺寸是100微米。图18A显示这种方案的俯视图，举例说明了凝胶填充的分离通道2和三对与凝胶9电接触的电极3”a1、3”a2等。图18B显示分离通道2的一个截面内按照有限元算法计算的电场矢量。显而易见，在电极附近从径向上电场有显著偏差。
图18C显示沿通道2中央的电压分布(沿位于通道2截面中央且与x方向平行的线)。电压范围与电极上施加值的范围(0到700V)相一致。线的形状符合方程 (2.1)V＝1/2kx2+cx 其给出了线性场 (2.2)E＝-kx-c 但是，图18D描述了沿通道的相应径向电场分布，显示电场变形在电极附近非常明显。
在第二个实例中，如图19A中的俯视图所示，将1mm厚的电阻层11置于分离通道2的侧面，其实际上形成了通道2的壁。在本实例中材料的电阻率是80Ωm。电极3”a1、3”a2是20μm宽(沿z方向)，并且它们沿电阻材料的外壁以1mm间隔放置。图19B显示对于此设置计算出的电场矢量。可见，电场变形局限在电阻层11内，并且分离通道2内的电场矢量主要沿z方向指向。图19C显示沿位于通道2中央与x方向平行的线的电压分布。此外，电压范围与电极电压相一致，且电压分布遵从二次幂法则。图19D显示电场形状，现在其没有图18所示设置产生的强振荡。
内部电极也可置于靠近传送通道的策略性位置，用以将蛋白质或DNA条带从分离通道转移出来，并将它们传送至分离环的相邻通道。例如，在图15所示的结构中，相同的内部电极阵列可用于以下双重目的，施加恒定场以及将条带从分离环转移到传送通道并进而到达另一个环或收集孔。
电场施加装置3可由沿分离通道2(或电阻层11)固定的导线组成。作为替代，可使用与电子PCB板相似的蚀刻法或使用导电墨制作电极。后一种方法尤其具有吸引力，因为可在复杂的结构中印刷非常细小的电极。也可通过沿通道的变化电阻施加电场。还可以提供可移动的电极阵列或者可受控制以使其相对于分离通道2移动的其它电场生成装置。
在以上所描述的每一个实施方案中，可向电泳装置提供检测器6，用于在分离物体条带一旦形成后对其进行检测。典型地，检测器6产生已分离条带的图象。可以有多种更适合于不同需要例如成本、准确度和不同样品的成像系统。跑无标记(不染色)样品的可能性通常是更有吸引力的选择，因为在某种任何程度上它保持样品不修饰。另外，使用染料是不期望的，因为结合在DNA或蛋白质上的物质也会结合在使用者上。另外，因为去掉了一个准备步骤，所以成本更低。因为同样的原因也降低了准备时间。
现在将描述两种无标记的检测方法。图20和21分别显示了实行UV吸收和激光诱导荧光(LIF)技术的实例。应注意的是，对于成像也可设置涉及荧光检测染色样品的其它结构。通常，不论来自吸收还是荧光，光模式都可通过光电二极管、像素检测器(例如CCD)或者光电倍增管(PMT)来检测。
图20显示UV吸收装置。UV光源20发出光，其穿过汇聚透镜21、聚焦透镜23和成像透镜25。所述光被干涉滤光器22滤过，并聚焦在微流体通道24上。用光电二极管或像素检测器26检测吸收图像，并由PC 27进行数字化。
图21显示激光诱导荧光(LIF)装置。激光30以UV波长30’照在微流体通道34上，并造成分离条带中的大分子以一定波长发出荧光。干涉滤光器32调整到此波长窗口。光电二极管31以相对于激光束的一个角度放置。光学器件33允许光电二极管检测所述荧光的锥形部分。发射出的信号由PC 35进行数字化。
在每种情形下，信号传送至包含负责信号数字化的模拟-数字转换器(ADC)的计算机27或35。控制和分析软件实时对图像进行分析。
在如上文所提及的传统电泳中，条带之间的相对距离随时间而增加，这是因为它们以不同的终速度移动。因此，逻辑上只对分离的最后部分进行成像，在此所述条带达到了它们最大的相对距离。相对而言，所提议方法很早就实现了分离，因此成像可在沿分离通道的任意点进行，或者甚至，可以使用沿分离通道径向布置的像素检测器对沿通道的许多点进行成像。检测器可被读出电子器件(可包括在控制器4中)每秒多次访问，因此给出精确描述条带沿通道运动的帧阵列(an array of frames)。在大多数实施方案中，沿分离通道有很多像素不是必需的，但是在一些场合，获得连续分离的动态图像可能是有利的。在另一些实施方案中，可使用CCD对多通道微流体或毛细管系统的更大区域进行成像。可以此方式安置检测器和成像光学器件，使得对多个同时进行分离的分离通道同时成像。这使得在实时或者在分离完成以后，对于不同通道之间的对比分析变得更简单。使用这种光学器件和检测器方案的另一个优点是可以只涉及一个读出电路，从而帮助降低了多个电路时对成像所诱导的系统噪音。
输入端口7典型地以孔的形式提供，其设置为接收注入的样品。输出端口8典型地包含配备电极的孔，所述电极可被控制器4激活，从而在样品的选定部分经过退出点时，将期望组分从分离通道中拉出并进入输出端口。
还可以设想，可向所述设备提供多于一个分离通道2。在此情况下，将向每个通道提供用于沿通道施加电场的装置3和控制该电场的控制器。方便地，一个控制器可控制多个(或者全部)通道，并且通道之间还可以共享电场施加装置。如前文所述，可向每个通道提供检测器和输入输出端口。
可对每个通道进行控制使之经历相同的电场变化。但是，如果每个通道的内容物不同，对每个通道上所施加的电场单独控制可能是有利的。
现在将描述根据上述任意实施方案的电泳装置的操作。在接下来的描述中，术语“样品”用于描述待分离物体10与一定体积的分离流体9的混合物。典型地，通过将待分离物体与所述流体相混合来制备样品，然后将它们用于填充分离通道2。典型的待分离物体包括大分子、生物分子或者聚合物比如蛋白质、DNA分子或者生物细胞。分离流体可以是缓冲液(其组成例如是N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、牛血清白蛋白和n-辛基葡萄糖苷)或者凝胶比如聚丙烯酰胺。
本装置超过标准电泳和色谱技术的另一优点是这种事实不需要样品注入栓。例如在传统毛细管电泳中，当进行样品注入时，首先将毛细管的一端没入容纳DNA或蛋白质溶液的容器中。然后电极也没入样品容器和废物容器，而形成通过毛细管的闭合回路。所形成的电场将一定量的DNA或蛋白质拉入毛细管。停止施加电压，将样品容器替换成只装有盐溶液的容器。然后再施加电压，在毛细管入口处形成的小样品栓40(图22)开始移动并发生分离。这是样品注入的标准方法。应注意，分离条带41直接受到样品栓初始宽度的影响。另外，热扩散进一步增加这一宽度。
然而，本发明装置不需要这种样品栓。DNA或蛋白质可与筛分凝胶或缓冲液在引入毛细管之前相混合(图23)。作为替代，分离通道2可预先充满流体9，待分离物体10或样品在稍后阶段并且在分离过程开始之前再引入。样品滴43可随机引入沿分离通道的任意位置(图24)。样品滴43经区域44扩散进入流体9。随时间变化的电场将“收集”所有样品分子，并且将它们高分辨率地分选并形成沿所述通道的条带42。这种“随机-不连贯的”注入在传统色谱或电泳过程中是无效的。原因在于如果从不连贯开始其没有一个形成连贯条带的机制。事实上，注入栓的尺寸是一个关键问题，因为它直接影响了分辨率。
例如，目前的商品装置使用了电动注入(如上文所描述，图22)或者压力注入(使用压力以取代使用电压来拉动栓)。使用两种不同方法的原因恰恰在于每种方法在不同构造中带来略好的分辨率。
此处所公开的装置不依赖于任何此种注入栓。这就是为什么与标准技术相比它允许使用替代注入方法的原因。可通过使之与分离缓冲液(或筛分凝胶)预先混合，或者通过将其压力注入进入孔，而将所述样品加到分离通道中。作为替代，可将样品置于孔内或容器内，并使用标准电动注入法将其注入分离通道。这意味着，一个电极没入容纳有样品的孔中，而传送通道的另一端有一个电极。通过在电极之间施加合适的电压，样品受电力吸引而离开孔，通过传送通道，进入分离通道。
一种替代性注入方法将利用所述装置的特殊性质，其不需要连贯的注入栓。通过沿分离通道的任意点处的注射器样仪器，将样品滴简单地置于缓冲液或筛分凝胶的表面上(见图24)。接着，所述滴将不相干地扩散进入靠近注入点的缓冲液区域44。一旦所述滴被置于缓冲液上，当它透过缓冲液扩散时，变化电场将立刻影响所述分子，并且分离过程也被启动。
可手动或者依靠受专门软件控制的机械臂自动地将注射器类型的仪器转移到分离通道的露出部分。
通过电场生成装置3沿分离通道2施加具有合适形状及强度场分布的电场。控制器4改变所述电场，使得产生相对于分离通道来调节电场的时间依赖性，并由此使分子如前文所述分离成条带。然后可通过检测器6对条带成像，或者进行检测，并且所述装置产生相应的输出5。检测或者成像可以发生在条带形成以后或者分离过程中。信号随时间的演化给出了额外的信息，其中一个例子是“反应时间”。例如，如果聚合物样品被加入缓冲环境中，在此发生化学反应并有另外条带形成，然后所述另外条带(反应产物)的“出现时间”可给出关于此反应特征的信息。另外，“蛋白质折叠”是一个时间依赖性事件，因此在它发生时可被有效的监测。
一旦物体10被分离成条带，可通过进一步调节电场对所述条带自身进行操纵。通过调节所述场的时间依赖性和强度，以及电场分布的形状，可根据需要来调节条带的分辨率与间距。所述条带也可重新定位，例如，允许感兴趣的具体条带在一个退出端口被提取。
在一些应用中，对所施加电场以使条带(或分离物体)反复通过检测器的方式进行控制是有用的。传统电泳或色谱方法的另一个缺点是条带只能在它们通过给定检测器前方时成像一次。然而，在本技术中相同条带可以多次成像，从而为吸收成像增加“光程”。吸收成像非常方便，因为条带中的分子不需要用荧光标记染色。所述方法也不昂贵，因为普通UV光源例如D2灯或汞灯是非常节省成本的。但是，吸收成像严重受到灵敏度的困扰。这是因为，为了降低焦耳热，分离通道必须有小截面，以实现较好的散热。但是，小截面意味着短光程，因此每个条带有小的吸收。在本发明装置中，可通过对每个条带反复成像消除光程限制。与之相反，每个循环增加一定量的光程。例如，这可通过振荡所施加电场以使物体前后移动来实现，或者通过使物体围绕闭合环状分离通道多次循环来达到。
在另一个实施方案中，所述装置可进行改造以适应于通过输入端口7连续或半连续地接收样品。所施加的电场受到控制，以使得将物体分离成条带，并且移动一个或多个感兴趣条带到或经过一个或多个输出端口8。每次当条带到达时，输出端口可被激活，使得可以几乎连续地将感兴趣组分从分离通道提取出来。以这种方式，所述装置可具有纯化系统的功能。
如已经描述过的，我们提供了预计可实现对物体进行快速高效且高分辨率的分离的电泳装置和方法。所述技术可有利地与微流体技术相结合或以其作为接口，以实现小型化、超高分辨率、超快速的分离装置。它的生产应是不昂贵的，因为不需要贵重的额外部件。所公开的装置不需要流体流动，因此不需要昂贵的泵网络。因为它可通过改变电场来控制，所以分辨率大大提升，并且因此可任意提高(在过热限制的范围内)。消除了时间依赖性的颗粒扩散，其限制了传统装置的分辨率。分辨率的这种进步也允许装置在相对于已知系统施加较低电流的情况下运转良好，因此降低了焦耳热效应。
现在将描述所述装置的一个应用例。具体地，描述一种实施DNA测序的方法。这里将不描述第一步骤，即从生物中提取DNA，以及可能的PCR扩增和消化，这些如Sanger方法等中所描述。测序过程从四种反应(A、T、G和C)可用的点开始。首先，根据前文所述的加样方法，将A反应放入含筛分凝胶(例如聚丙烯酰胺)的分离通道中。然后，启动时间依赖性电场，发生DNA分子的分离。对分子条带成像，结果如图25所示看起来像一系列峰。接着，注入T反应，T峰如图24所示出现。接着(此时A和T反应已经分离并沿通道移动)依次注入G和C反应(图27和28)。
在通常测序过程中，四个反应需要用不同颜色进行化学染色，以便同时在同一通道中分离所有四个反应。但是，此处所公开的装置通过在前一反应之后延迟一段时间再将另一反应注入同一分离通道并且不使用化学染料(无标记)而克服了这一点。
通过实施这些连续的注入，与DNA条带相应的成像“峰”以时间顺序形成。首先，“A”反应峰出现，并自动地被成像软件记录下来。然后“T”峰逐渐出现。相似地，G和C峰随时间进一步延迟而出现。峰的时间性是哪个峰属于哪个反应的良好指标，因此测序可在单个微流体通道中进行，并且不使用对DNA分子的染色。
通过观察条带的形成可获得另外的信息。例如，如果已经发生第二次注入，由于这第二次注入形成的条带将逐渐在第一次注入的条带之间形成。这种增加分布可以非常有用。作为替代，一旦来自第二次注入的条带完全形成，就进行成像，然后可与之前在此通道中只有一次注入时的分离模式进行比较。但是，此增加分布在对给定条带成像和定量中可以是消除系统误差的非常有用的工具。例如，通过对给定条带的信号强度相对于时间作图，可获得信号真实大小的更可靠测量值。
依次注入不同样品的方法可用作设计复杂样品或多种样品的分离方案的工具。在考虑注入顺序时，可考虑样品组分之间或者组分与缓冲液之间的化学反应。另外，其它参数比如温度、缓冲液pH变化可以是操作方案的一部分。可将条带从一个分离通道中提取出来，并传送到另一个施加不同化学或环境条件的通道。可将另外的分子从外部并依次注入所述新分离通道。
为了评价装置的预期分辨率，我们应用在线性聚丙烯酰胺凝胶的标准毛细管电泳中DNA条带的试验测量迁移率，并应用Lamm方程推导出所提议发明的预期分辨率。这里将不提供详细的分析，但是本技术允许比较预期分辨率与传统技术所达到的分辨率。
我们已研究了文献中标准毛细管凝胶电泳(CGE)的DNA迁移率。条件假定为6％线性聚丙烯酰胺凝胶和时间依赖性的电场。图29a到c显示了一个1000bp和一个1001bp的两个DNA条带的标准CGE试验的预期分辨率。图29a显示检测点(30cm分离长度)的预期条带形状(钟形)。如我们所见的，条带非常接近。图29b显示两个信号的总和，在此情况下，总和刚刚能显示两个不同条带的存在。对于这种长度的DNA和DNA在聚丙烯酰胺凝胶中CGE分离的已知分辨率，这正如预期。
我们可预测此处所公开装置对于相同DNA条带(1000+1001bp)的分辨率。图30a显示两个条带。很清楚，以FWHM单位，它们相比于标准CGE(图29a到c)被进一步分离。图30b显示两个可以清晰分辨的信号的总和，图30c显示大约250V/cm的时间依赖性电场。该值对于这种凝胶是非常现实的。对于标准CGE，为实现最佳分辨率，最佳值是在50V/cm以下。更高的电场造成分辨率的下降，因为多种原因增加了DNA条带的分散。但是，对于所提议的装置，相同的规则不适用，这是因为分散被特殊的分离条件所限制。因此，通过施加更高电场来提高分辨率是非常合理的。
对于两个更长的DNA片段，8000和8001bp，我们使用了相同的数据。图31a显示了预测的分辨率。这两个条带被明确分辨开，这意味着所提议的装置能够提供高达＞8000碱基对DNA的空前的分辨率，这对于工业和科研有重大意义。
对于一个给定的分离通道，可在给定的摩擦-电荷参数范围内对分辨率进行优化。在实践中，这将意味着对于例如在一个通道中的DNA，可以降低电场的参数“α”。这样的作用在于，电场梯度对于x的斜率降低，但是条带的实际宽度却不按比例增加。这进而造成条带在给定的动态范围内相互之间进一步迁移而分离的更开，但是条带变宽并没有抵消距离的增加。这意味着分辨率的有效增加，并且由于α的降低，可容易地在给定动态范围内调整分辨率。对此的原因是因为在Lamm分析中，含f的项线性依赖于x，但是含α的项依赖于x2。然而f与扩散系数D成反比，因此与给定条带的宽度成反比。因为f和α对于x的这种差异依赖性，可有效地调节分辨率。
对于调节分辨率的另一个有用的因素是参数k。通过增加此参数，分辨率将大大增加。但是，这是有一定成本的。发生分离的电场范围随着k的增加而增加，因此对于给定的HV供应(成本)以及芯片材料电介质的电压击穿特征，在分离通道中实际可产生的电场大小是有限制的。
权利要求
1.一种用于在分离通道所含流体中分离物体的电泳方法，所述方法包括
沿分离通道施加电场，所述电场具有一定场分布，并由此使得至少一些物体相对于流体移动；
改变所施加电场，以相对于分离通道来调节所述场分布，从而使得物体在由于电场的电场力和由于流体的流体动力的共同影响下分离成条带。
2.根据权利要求1的用于分离物体的电泳方法，其中电场沿至少一部分场分布相对于分离通道而发生变化。
3.根据权利要求1或2的用于分离物体的电泳方法，其中至少一部分电场分布具有非零梯度。
4.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中电场以场分布相对于分离通道移动的方式发生变化。
5.根据权利要求4的用于分离物体的电泳方法，其中当场分布相对于分离通道移动时，场分布在其它方面保持不变。
6.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中电场以电场分布沿分离通道平移的方式发生变化。
7.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中流体和分离通道相对于对方基本是静止的。
8.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中电场分布的形状使得每个物体所受的净作用力使得每个分离条带的宽度随时间基本保持恒定，所述净作用力是由于电场所施加的电场力和流体所施加的流体动力的共同作用所致。
9.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中所施加电场发生变化，使得一旦物体已分离成条带时，每个条带以相对于分离通道的非零终速度移动。
10.根据权利要求9的用于分离物体的电泳方法，其中每个条带的终速度基本相同。
11.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中所施加电场是如下形式
E(x，t)＝E((x-kt)n)
其中x是空间坐标，典型地是沿分离通道的空间坐标，t是时间坐标，n和k都是实数且n不是零。
12.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中至少一部分电场相对于沿通道的距离是单调的。
13.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其还包括将待分离物体与流体相混合并将混合物置于分离通道中的步骤。
14.根据权利要求1至12中任一项的用于分离物体的电泳方法，其还包括将流体置于分离通道中和将样品插入分离通道的步骤，所述样品至少包含待分离物体。
15.根据权利要求14的用于分离物体的电泳方法，其中样品还包含流体。
16.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其还包括检测条带的步骤。
17.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其还包括在物体已分离成条带之后改变电场以调节条带间距、条带位置或条带分辨率的步骤。
18.根据权利要求17的用于分离物体的电泳方法，其中通过对电场的时间依赖性和/或其强度的变化来改变电场。
19.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其还包括在物体被分离之后从分离通道提取感兴趣条带的步骤。
20.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其还包括振荡所述电场使得条带的移动倒转方向从而使条带沿分离通道往返移动的步骤。
21.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中分离通道是闭合环，并且所施加电场是围绕环周期性的。
22.根据上述任一权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中通过沿分离通道设置的大量电极来施加电场。
23.根据权利要求22的电泳方法，其中所述大量电极中至少一些通过电阻材料层而与分离通道内部隔开。
24.根据权利要求23的电泳方法，其中电阻材料是半导体。
25.根据权利要求24的电泳方法，其中半导体是掺杂半导体。
26.根据权利要求25的电泳方法，其中电阻材料是掺杂硅。
27.根据权利要求22至26中任一项的用于分离物体的电泳方法，其中所述大量电极与分离通道的内部隔开，使得电极与流体之间不传导电流。
28.根据前述任一项权利要求的用于分离物体的电泳方法，其中待分离物体包含生物分子、蛋白质、聚合物、DNA、RNA或生物细胞。
29.用于分离物体的电泳装置，所述装置包含
分离通道，在使用时其含有流体及待分离的物体；
用于沿分离通道施加电场的装置，所述电场具有一定场分布，由此使得分离通道中的物体相对于流体移动；
适于用来施加和改变所施加电场的控制器，以相对于分离通道来调节电场分布，从而使得分离通道中的物体在由于电场的电场力和由于流体的流体动力的共同影响下分离成条带。
30.根据权利要求29的用于分离物体的电泳装置，其中电场沿至少一部分场分布相对于分离通道发生变化。
31.根据权利要求29或30的用于分离物体的电泳装置，其中至少一部分电场分布具有非零梯度。
32.根据权利要求29至31中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中控制器进一步适于相对于分离通道移动电场分布。
33.根据权利要求32的用于分离物体的电泳装置，其中控制器进一步适于在场分布相对于分离通道移动时保持场分布不变。
34.根据权利要求32或33的用于分离物体的电泳装置，其中控制器进一步适于使电场分布沿分离通道平移。
35.根据权利要求29至34中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中，在使用时，分离通道中所含流体相对于分离通道基本上静止。
36.根据权利要求29至35中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中控制器进一步适于施加电场分布，该电场分布的形状使得每个物体所受的净作用力使得每个分离条带的空间扩散基本为零，所述净作用力是由于电场所施加的电场力和流体所施加的流体动力的共同作用。
37.根据权利要求29至36中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中控制器进一步适于改变所施加电场，使得一旦物体已分离成条带，每个条带以相对分离通道的非零终速度移动。
38.根据权利要求37的用于分离物体的电泳装置，其中每个条带的终速度基本相同。
39.根据权利要求29至38中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中所施加电场是如下形式
E(x，t)＝E((x-kt)n)
其中x是空间坐标，典型地是沿分离通道的空间坐标，t是时间坐标，n和k都是实数且n不是零。
40.根据权利要求29至39中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中至少一部分电场相对于沿通道的距离是单调的。
41.根据权利要求29至40中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中施加电场的装置包含沿分离通道设置的大量电极。
42.根据权利要求41的用于分离物体的电泳装置，其中所述大量电极中至少一部分通过电阻材料层与分离通道内部隔开。
43.根据权利要求42的用于分离物体的电泳装置，其中电阻材料是半导体。
44.根据权利要求43的用于分离物体的电泳装置，其中半导体是掺杂半导体。
45.根据权利要求44的用于分离物体的电泳装置，其中电阻材料是掺杂硅。
46.根据权利要求41至45中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中所述电极与分离通道的内部隔开，使得电极与流体之间不传导电流。
47.根据权利要求41至46中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中电极包含印刷在分离通道或电阻材料之上或邻近处的导电墨。
48.根据权利要求29至47中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中分离通道是毛细管。
49.根据权利要求29至48中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中分离通道是直线的。
50.根据权利要求29至49中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中分离通道是闭合环的形式。
51.根据权利要求50的用于分离物体的电泳装置，其中分离通道是圆形的。
52.根据权利要求29至51中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中分离通道被刻在衬底上。
53.根据权利要求29至52中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中所述装置是微流体装置。
54.根据权利要求29至53中任一项的用于分离物体的电泳装置，其进一步包含适于检测分离通道中条带的检测器。
55.根据权利要求54的用于分离物体的电泳装置，其中检测器适于对分离通道中的条带成像。
56.根据权利要求29至55中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中所述分离通道提供有至少一个用于将样品插入分离通道的输入端口，所述样品至少包含待分离物体。
57.根据权利要求29至56中任一项的用于分离物体的电泳装置，其中所述分离通道提供有至少一个用于将物体条带从分离通道提取出来的退出端口。
58.根据权利要求29至57中任一项的用于分离物体的电泳装置，其包含大量分离通道，每个分离通道带有施加电场的装置和控制器。
59.根据权利要求58的用于分离物体的电泳装置，其中施加到每个分离通道上的电场是相同的。
60.根据权利要求58或59的用于分离物体的电泳装置，其中施加到每个分离通道上的电场受相同控制器控制。
61.根据权利要求29至60中任一项的用于分离物体的电泳装置的应用，其中待分离物体包含生物分子、蛋白质、聚合物、DNA、RNA或生物细胞。
全文摘要
本发明提供了一种用于在分离通道所含流体中分离物体的电泳方法。所述方法包括沿分离通道施加电场，所述电场具有场分布特征，并因此使得至少一些物体相对于流体移动；改变所施加电场以便相对于分离通道调节电场分布特征，因此使得物体在由电场引起的电场力和由流体引起的流体动力的联合作用下分离成条带。
文档编号B01L7/00GK101124477SQ200580048557
公开日2008年2月13日 申请日期2005年12月22日 优先权日2004年12月31日
发明者迪米特里奥斯·赛德里斯 申请人:迪米特里奥斯·赛德里斯