用于加热和冷却的仪器的制作方法

专利名称：用于加热和冷却的仪器的制作方法
技术领域：
本发明的主题是一种用于以受控方式加热和冷却物体的仪器、一
种用于实现热分布型(thermal profile)的方法、 一种用于扩增核酸 的方法、 一种用于加热液体的系统以及一种用于测定核酸的系统。
背景技术：
本发明在保健领域特别有用，其中需要对包含于其中的组分进行 可靠试样分析。化学反应需要加热例如由分子诊断学可知，其中，已 知核酸将通过加热至高于杂交体的解链温度而变性，即从双链的杂交 体变成单链。
一种利用反应循环(包括该变性步骤)的方法是聚合酶链反应 (PCR)。通过提供工具来使得特定序列的核酸量从可忽略的量增加至 可检测的量，该技术使得核酸处理领域产生了革命，特别是核酸分析 领域。PCR在EP0201184和EP0200362中有记载。
在EP0236069中公开了一种仪器，其利用加热和冷却一伸出的金属 块来以受控方式对管中的试样进行热循环。
用于加热物质组合物的方法也已知。例如，在US2002/0061588中 介绍了一种通过将核酸附在纳米颗粒上并向该纳米颗粒施加能量而加 热核酸的方法。利用该热量，调节剂(modulator)表面上的核酸杂交 体进行变性，且其中一个链能够分离至周围液体中。不过，该方法在 加热和扩增方面的效率很低。
目前，加热PCR混合物主要利用具有主动加热和冷却的珀尔帖 (Peltier )元件来进行。与具有主动加热和被动冷却的系统相比，这 些珀尔帖元件需要复杂的电子设备。
在US2 004/0129555中公开了一种利用脉冲激光来加热包含染料的 混合物的方法。
在US6633785中公开了一种利用电阻加热或感应加热来加热微管 (microtube)的方法。
在US6602473中公开了一种由硅制成的微加工反应腔室。该装置有
进口孔和出口孔，并能够用于在插入仪器中时进行PCR反应。该系统不 能进行灵敏且快速的温度控制。
在W098/39487中公开了一种器具，其用于保持具有腔室的装置， 该器具包括加热板或冷却板，当该装置插入所述器具中时，该加热或 冷却板布置在一扁平装置的相对侧壁上。
由现有技术的仪器所提供的温度变化相对较慢。因此，需要更快 速地扩增核酸。

发明内容
本发明的第一主题是一种用于以受控方式加热和冷却物体的仪 器，所述仪器以以下顺序包括 基本扁平的温度传感器元件； 基本扁平的刚性导热基片； 基本扁平的电阻加热器； 基本扁平的隔离层；以及 冷却元件。
本发明的第二主题是一种用于在装置中实现热分布型的方法，它 包括
加热和冷却本发明的仪器中的该装置。
本发明的第三主题是一种用于测定试样中的核酸的系统，该系统 包括本发明的仪器以及包含所述试样的装置。
本发明的第四主题是一种用于扩增核酸的方法，它包括
a) 在本发明的仪器中的一装置中提供包含核酸的液体的混合物；
以及
b) 使所述装置中的所述试样承受热循环。 本发明的第五主题是一种用于加热混合物的系统，它包含 包含一个或多个腔室的装置，该腔室用于装所述混合物；以及 本发明的仪器。


图l示意表示了本发明的仪器的示例组装。
图2表示了在该仪器上设置的温度分布型，以便产生PCR曲线。
图3以曲线形式表示了通过本发明的仪器进行的两次实验的结果。
参考标号
仪器l 装试样的装置2 传感器的保护层3
温度传感器结构/元件4 导热基片5 加热器6
加热器覆盖层7 热隔离层8 冷却元件9 传热表面IO
具体实施例方式
用于扩增核酸的方法为已知。它们将基于初始存在的目标核酸作 为模板来产生大量的核酸，因为酶的活性能够复制所述目标核酸中的 碱基序列。该复制子自身用作复制序列(优选是已经进行首次复制的 碱基序列)的目标。这样，产生具有相同序列的巨量核酸。这就能够 非常灵敏地检测目标核酸。
用于扩增核酸的特别公知方法是聚合酶链反应(PCR)方法，这在 EP0200362中公开。在该方法中，反应混合物经受一种热分布型的反复 循环，该温度适合于使引物退火至该目标核酸，利用所述目标核酸作 为模板来使退火引物延伸，并使该延伸产物与其模板分离。
在第一步骤中，提供包含核酸的液体。该液体可以是包含要扩增 的核酸的任何液体。而且，该液体包含扩增核酸所需的试剂。对于各 扩增方法，这些试剂为公知的，优选是包括用于延伸引物的试剂，该 试剂优选是依赖于模板的DNA-或RNA-聚合酶以及构件，该构件(例如
核苷酸)将附在引物上以便延伸。而且，该混合物将包含用于建立延 伸反应条件的试剂，例如所使用的酶的緩冲剂和辅助因子，例如盐。
在进一步的步骤中，将该温度调节成能够使双链核酸变性，将引 物退火至该单链上，并使该退火引物延伸。该延伸反应将在聚合酶有 活性的温度下进行。优选是使用热稳定和热活性的聚合酶。所形成的 双链通过如上所述的变性而分开。
该过程能够利用本发明的仪器来进行。为此，装有核酸的试样作 为受冷却和加热的物体而装在一装置的腔室内，该装置已插入或要插 入本发明的仪器中。在下文中，更上位的术语"物体"将由优选和示 例性的术语"装置"来代替。
本发明的仪器的第一部件是至少一个基本扁平的温度传感器元 件。在本文中，基本扁平的意思是传感器包含的表面并不在其平均周
围环境上升高超过lmm，更优选是并不在其平均周围环境上升高超过 0. lnun。这样的优点是要加热的所述装置的表面与传感器元件和相邻层 有良好的热接触。它设计成测量在其被布置的位置处的温度。这样的 元件是本领域技术人员所公知的，且优选是电阻元件。特别有利的传 感器的厚度在O. 01 jnm和lOy m之间，优选是在O. 8 nm和l. 2 pm之间。 一种市场上可获得的示例传感器元件为l pm厚，可从厂家获得，例如 Heraeus Sensor Technology ( Kleinostheim，德国)、JUM0 G迈bH & Co. KG (Fulda，德国)或Innovative Sensor Technology 1ST AG (Wattwil,瑞士)。该元件有连接器，用于将传感器元件永久性或可 逆地连接至通向控制单元的电线。该传感器元件能够根据已知方法来 制造。它能够独立制造，然后通过已知方式(例如胶接)固定至其它 部件。优选是，该传感器元件通过将一层材料溅射至伴随层上来制造。 用于施加薄层的该方法也已知。用于该传感器元件的优选材料是镍和 铂。优选是，它由铂或铂与其它贵重金属的混合物来制造。
优选是，该温度传感器元件由覆盖层保护防止机械和化学损坏。 该覆盖层优选是由玻璃制成，优选是厚度在l pm和25 nm之间。它优选 是通过本领域公知的厚膜沉积技术来制造。此外，该层优选是具有低 导电率和高导热率。
该温度传感器元件优选是设计成与试样的温度充分相关。这可以 通过将该元件的形状设计成使它非常类似于装有试样的该装置的形状 来实现。优选是，包括有保护覆盖层的该传感器元件的接触表面与该 装置的接触表面紧密接触。由于该仪器和该装置的该限定布置，试样 中的温度能够由传感器元件中测量的温度非常确定地推算出来。 该温度测量的结果用于控制该仪器中的加热和冷却过程。 本发明的仪器的笫二基本部件是基本扁平、刚性和导热的基片。 该基片优选是由导热系数在2 x 103和5 x 10，/1111之间的材料构成。而 且，所述基片为扁平，因为它的厚度优选是在O. l和10mm之间，更优选 是在O. 25和2mm之间。该基片具有刚性特征，即对于明显的机械扭曲保 持稳定。而且，该导热基片优选是由导电率小于O. 1Q—'m—'的电隔离材 料来制造。此外，优选是该基片的特性具有较低的热时间常数(密度
x热容/导热率)，优选是小于10、/m2。合适的材料从以下组中选择 铝、铜、氧化铝、氮化铝、氮化硅、碳化硅、蓝宝石、铜、银、金、 钼和黄铜。更优选的是具有较低导电率的材料，例如电隔离材料，如 导电率小于i(rfrm—'的材料。因此，特别有利的材料是陶瓷材料，例 如氧化铝、氮化铝、氮化硅、碳化硅和蓝宝石。
该基片也可以根据已知方法来制造。优选是，该基片通过烧结陶 瓷来制造。该基片可以以与该基片形状类似的形式来制备，优选是可 重复使用的形式，或者在烧结处理后可以裂开成合适尺寸的片。
本发明仪器的第三基本部件是加热器。该加热器优选是基本扁 平，更优选是电阻加热器。这样的加热器为本领域公知。优选是，该 加热器是一层具有高电阻的材料，例如从以下组中选择氧化钌、银、 金、铂、铜、钯或者其它金属。该材料最优选是氧化钌。优选是，该 层的厚度优选在IO m m和30 p m之间，更优选是在15 jn m和20 jli m之间。 优选是，该加热器的加热强度在15和40W/cm2之间。
该加热层优选是这样制备，即以特定形状涂覆或丝网印刷由该材 料构成的糊状物，并加热所述组合物至足以使该特定材料烧结的温 度。优选是，该材料由此而粘附在其被烧结时所在的该层上。
优选是，该加热器元件通过覆盖层来防止机械和化学损坏。该覆 盖层优选是由玻璃或玻璃陶资制成，并优选是厚度在l nm和25pm之 间。它优选是通过本领域公知的厚膜沉积来制造。此外，该层优选是 有较低的导电率和较高导热率。
第四基本部件是基本扁平的隔离层，该隔离层将加热器与冷却元
件隔开。所述隔离层的功能是提供从加热器至冷却元件以及反向的合 适传热。 一方面，该传热必须足够高，以便保证通过使得该装置与冷 却元件隔开的这些层而充分冷却该装置，因此充分冷却该试样，但是， 另一方面，该传热必须足够低，以便在从较低温度至较高温度的瞬变 阶段(热量斜坡段)中不会阻碍加热器对试样的快速加热。该隔离层 的厚度可适合于实现较高的加热斜坡段和较低的冷却斜坡段，或者相 反。因此，该热导率应当在O. 5W/(n^K)和2W/(n^K)之间，更优选是在 0. 8W/(n^K)和1. 2W/(n^K)之间。这些值明显取决于加热器的功率密 度、隔离层的厚度以及冷却元件的冷却能力。这些参数的优选值是加 热器功率密度为40W/cm2，隔离层的厚度为200 nm。
该隔离层的材料优选是从以下组中选择环氧化物或玻璃或玻璃 陶瓷。更优选是特定材料的组合物，例如在环氧树脂中的氧化铝微粒。 最优选是在胶或环氧树脂中的氧化铝组合物。优选是，颗粒材料在该 层中均匀分布。
该层又能够以公知方式施加在相邻层上。优选是，该材料作为糊 状物进行涂覆，然后在150和180TC之间烧结1. 5至2小时以便固化。这 样的基于环氧化物的层能承受高达450"C的温度。
在某些方面，该隔离层也可以由多层组成。在一特定实施例中， 该隔离层包括三层，其中，第一和第三层是上述隔离层，中间一层是 由导热材料如金属、陶瓷、晶体或聚合物(例如铝、铜、钢、氧化铝、 氮化铝、碳化硅、氮化硅、蓝宝石、金刚石、聚酰亚胺)构成的中间 层。这样的实施例很有利，因为两个这样的薄隔离层在技术上可以更 容易地施加，并表明通过该简化的制造方法而提高了制造工差。而且， 该中间层优选是由导热材料制成，从而保证温度在这些层中均匀分 布，也表明通过该简化的制造方法而提高了制造工差。
本发明仪器的第五基本部件是冷却元件。该冷却元件的目的是有 效地将热量从其它层(特别是隔离层)中引走。因此，该冷却元件优 选是由金属例如铝形成，其为具有较大表面的块的形式，以便提高进 入周围环境的热能流。该表面能够通过在金属块上提供翅片而增大(被 动冷却)，任选地，由风扇来增加冷却元件周围的对流(主动冷却)。 也可以不使用翅片，而是可以使用液体(例如水)冷却，或者可以利 用埋入(在金属块中)式热管(该热管具有在另一端的翅片)。
在优选实施例中，加热器由在面向隔离层一侧上的覆盖层来保 护。该覆盖层可以由从以下组中选定的材料来制造陶瓷、玻璃陶瓷 和聚合物，优选是由玻璃陶瓷制成。
与本发明的仪器和/或方法一起使用的装置是容器，用于在该方法 条件下保持包含有试样的混合物。因此，该装置应当对提供至该混合 物的热量大小和类型有耐热性、能够抵抗包含于该混合物中的试剂、 并且密封以便使混合物不能从该容器溢出。
在图l中表示了组装好的示例仪器l的基本部件以及一些优选的附 加部件。该装置2装有试样。它布置成紧邻传感器的保护覆盖层3的传 热表面IO。传感器元件4将基片5与该装置隔开。相邻元件是加热器6。
加热器覆盖层7保护该加热器，并与该热隔离层8和冷却元件9相对。 本发明仪器的用途优选是包括有效控制温度，以便保证实现一种
温度分布型，优选是实现反复的温度循环，这对于(例如PCR中的)热
循环是有用的。该温度和热量控制优选包括
——利用传感器元件来测量该装置中的所述试样的温度；
——将所测得的温度与想要在试样中达到的温度进行比较；
一一通过加热器元件向试样施加热量，以便当试样的温度低于所
需温度时升高温度，或者当试样的温度与所需温度相同时保持所述试
样中的温度。
因此，在非常优选的模式中，本发明包括根据液体的温度通过计 算机程序来控制和调节该加热过程。用于控制加热器的单元称为热量 控制器。
由于该扁平传感器元件，温度的测量非常快，且并不需要大量的 电子设备。用于对测量温度和所需温度进行比较所需的算法也相当简 单，本领域已知的简单的PID (比例-积分-微分)控制算法就足够了。
能够利用加热器而以任意已知方式来施加热量，例如通过向电阻 加热器连续施加电流，或者以电流脉冲输入所述热量(例如通过脉冲 宽度调制)，或者使用交流电。获得特定温度增量所需的所述脉冲长 度或电流大小能够在简单实验中这样来确定，即，测定示例试样中的 温度并且以给定的冷却能力来改变电流大小和/或脉冲长度。
优选是，这通过使用包含于该仪器中的控制单元来完成，该控制 单元从传感器接收温度测量值，并命令加热器不加热或者连续或间歇 加热，直到达到所需温度。更具体地说，在液体中的温度能够利用与 装有试样的该装置接触的温度传感器所进行的测量以及对该相互作用 的物理状态的了解来确定。为了控制该液体中随时间变化的所需温度 分布型，该PID控制算法将设置所需的加热/冷却功率，以便考虑到所 需温度以及以最小时间间隔测量的温度而在所需点处及时地获得正确 温度。与装有试样的该装置接触的温度传感器将以已知方式检测温 度，即，对于与该装置接触的传感器来说，其检测温度与整个接触表 面上的设计横向温度强度分布成比例。当在与该装置接触的传感器处 测到比预期更低的温度时，则认为该仪器与该装置之间的机械接触不 充分。当测量温度和预期温度彼此相关时，则认为该机械接触处于工
作状态。在另一实施例中，可以使用第二传感器元件来确定试样中的 温度，并评估该仪器与该装置之间的接触。这时，测量温度的分辨率 是只有一个传感器时的两倍，且明显降低了在试样中获得不适当温度
的危险。
优选是，所述加热通过接触加热来进行。接触加热是热介质与要 加热材料接触的加热，使得能量能够通过在它们之间的接触表面而从 加热介质流向该材料。本发明的加热器优选是电阻加热器。电阻加热 利用小直径电线的电阻在电流流过时由于热量而产生能量损失的效 应。 一种优选设计是具有用于电阻加热的预定电阻的加热线圏。该线 圏可以由电线形成，或者它能够以其它方式设计，例如位于印刷电路 板上或者设计为位于基片(例如陶资或聚酰亚胺)上的任何材料的导 体。 一种选择是该线圏通过薄膜或厚膜技术而在合适基片上形成。该 线圈可以位于该容器的底部、顶部或侧部，或者甚至以这样一种方式 环绕该装置，即，取决于线圈的设计而使得该装置处于该线圈内部。
本发明的另一实施例是一种用于在一装置中实现热分布型的方
法，它包括
——加热和冷却本发明的仪器中的该装置。
热分布型是要在该试样中达到的一系列温度。优选是，所述分布 型的所有温度都高于室温，更优选是在37和981C之间，最优选是在40 和961C之间。该分布型可以是上升分布型，其中，这些温度随时间升 高，或者可以是下降分布型，其中，这些温度随时间降低。最优选的 是一种具有最大和最小温度的分布型，即温度升高和降低。在本发明 的最优选实施例中，所述热分布型包含重复的热循环，这是PCR所需要 的。这些热循环将包括最高温度，其允许双链核酸变性成单链；以 及最低温度，从而允许单链核酸退火成双链。
优选是，本发明的方法还包括通过上述类型的冷却元件类型来冷 却所述装置。优选是，所述冷却通过使所述仪器(更优选是所述冷却 元件)受到流体流来进行，该流体优选是用于翅片结构或埋入式热管 的气体(例如空气)。
本发明的另 一 实施例是一种用于测定试样中的核酸的系统，该系 统包括本发明的仪器以及装有所述试样或设计成接收所述试样的装 置。该系统可以用于本发明的方法中。因此， 一种系统优选是包括用
于进行该测定的试剂和消耗品，且任选地可以通过包括用于处理该装 置和/或试样的机器人而自动操作。该装置能够插入在该系统中，以便 保证向该仪器的各部件适当地施加电流和冷却能力，并最终加热和冷 却装在有效位置中的该装置。
本发明的另一实施例是一种用于扩增核酸的方法，它包括在本
发明仪器的一装置中提供包含所述核酸的液体的混合物；以及使所述
装置中的所述试样承受热循环。
本发明另一实施例是用于加热混合物的系统，该系统包括装置， 该装置包含一个或多个用于装所述混合物的腔室；以及按照本发明的
仪器。 示例l
制造本发明的仪器
在笫一步骤中，将薄膜温度传感器元件涂覆在陶瓷基片上，该薄
膜温度传感器元件由铂制成并可从Heraeus公司购得，该陶瓷基片可从 CeramTec AG公司 (Plochingen，德国)购得。在这里，该陶资基片由 氧化铝制成，厚度为635 nm。该传感器元件由覆盖层来保护，该覆盖 层由玻璃陶瓷制成，厚度为20pm。该步骤在本领域已知的涂覆机器上 进行。在第二制造步骤中，该厚膜加热器在该基片的另一相对侧制成。 为此，氧化钉薄膜(厚度为20nm)涂覆在该基片的该相对侧上。该厚 膜层也由覆盖层来保护，该覆盖层由玻璃陶瓷制成，厚度为20nm。 一 旦该基片至少涂覆有该薄膜层时，它就可以在进一步的步骤中进行处 理，该步骤确定了该隔离层的厚度，并因而确定了热力学行为。通过 本领域已知的丝网印刷方法，凭借环氧树脂胶溶液而在该加热器的保 护层上以确定形状沉积该隔离层，从而形成100iLim的厚度，该环氧树 月旨胶溶液可从Epoxy Technology Inc. (Bi 1 lerica， MA，美国)公司购 得。该冷却块由铜制成，包括带有进口和出口的流通槽道，以便进行 流体冷却，该冷却块与仍然保持粘性的多化合物隔离层(具有胶接特 性)进行接触(热接合)。在处于1801C温度下的热接合步骤中，该冷 却块利用确定厚度的隔离层而粘在加热器层一侧。
示例2
利用本发明的仪器来实现PCR
使用在示例l中所述的热循环器，通过市场上可购得的 UghtCycler ParvoB19工具包(Cat No 3246809, Roche Diagnostics GmbH,德国)来进行多次PCR运行，以便进行实时PCR检测，并遵循制 造商在该工具包中提供的用法说明，并利用LightCycler Parvo B19 Standard作为模板。设置图2中所示的温度分布型来产生PCR曲线。温 度斜率选择为使得PCR效率仍然良好、而热循环器将处理快得多的斜 率，例如201C/s。
图3中以曲线形式表示了两个实验的结果，该曲线形式是在具有所 述热循环器的试验板上测量得到的，利用了所述温度传感器，并且使 用了试验板实时荧光光度计，该荧光光度计能够激励和测量在 UghtCycler ParvoB19工具包(Roche Diagnostics GmbH，德国) 中所记载的荧光物质。
权利要求
1.一种用于以受控方式加热和冷却物体的仪器，所述仪器以以下顺序包括基本扁平的温度传感器元件；基本扁平的刚性导热基片；基本扁平的电阻加热器；基本扁平的隔离层；以及冷却元件。
2. 根据权利要求l所述的仪器，其中，所述传感器元件包括电阻 元件和覆盖层，所述覆盖层保护所述电阻元件不与环境直接接触，且 所述覆盖层的厚度在l p m和25 n m之间。
3. 根据权利要求2所述的仪器，其中，所述覆盖层具有物体接触 表面，该物体接触表面反映所述物体的表面形状，并朝向所述物体的 传感器接触表面。
4. 根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述传感器元 件的厚度在O. 01 pm和10iLim之间，优选是在O. 8 Mm和l. 2 nm之间。
5. 根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述导热基片 的厚度在O. lmm和10mm之间。
6. 根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述导热基片 由电隔离材料制成。
7. 根据前述任意一项权利要求所述的仪器，其中，所述加热器的 厚度在10 n m和3 0 y m之间。
8. 根据前述任意一项权利要求所述的仪器，还包括热量控制器。
9. 一种用于在一装置中实现热分布型的方法，包括 加热如权利要求1至8中任意一项所述的仪器中的该装置。
10. 根据权利要求9所述的方法，还包括冷却所述装置。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述冷却通过使所述仪 器承受流体流来进行。
12. 根据权利要求ll所述的方法，其中，所述流体是液体或气体。
13. 根据权利要求9至12中任意一项所述的方法，其中，所述热分布型包含重复的热循环。
14. 一种用于测定试样中的核酸的系统，包括如权利要求1至8中 任意一项所述的仪器以及包含所述试样的装置。
15. —种用于扩增核酸的方法，包括a) 在如权利要求1至8中任意一项所述的仪器中的一装置中提供包 含核酸的液体的混合物；以及b) 使所述装置中的所述试样经受热循环。
16. —种用于加热混合物的系统，包括 包含一个或多个腔室的装置，该腔室用于装所述混合物；以及 如权利要求1至8中任意一项所述的仪器。
全文摘要
本发明提供了一种仪器和方法，它能够方便地快速扩增核酸。该仪器以以下顺序包括基本扁平的温度传感器元件、基本扁平的刚性导热基片、基本扁平的电阻加热器、基本扁平的隔离层以及冷却元件。
文档编号B01L7/00GK101104841SQ20071013646
公开日2008年1月16日 申请日期2007年7月16日 优先权日2006年7月14日
发明者E·萨罗菲姆, G·萨瓦蒂克 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司