用于在法医dna分析和医学诊断中分选物体的方法和设备的制作方法

专利名称：用于在法医dna分析和医学诊断中分选物体的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于在法医DNA分析和医学诊断中分选物体的方法和设备。更具体地，本发明涉及分选用于单细胞聚合酶链式反应(PCR)方法的精子，其用于法医的DNA 分析，例如STR分析，来鉴定性侵犯案件中的人/侵犯者。进一步的，本发明涉及芯片上 PCR(on-chip PCR)在法医DNA分析中的用途。最后，本发明的分选细胞和单细胞PCR在法 医之外具有可用性，例如，在癌症诊断领域，其中基于STR的细胞鉴定越来越流行以辨别癌 细胞和健康细胞。
背景技术：
在现代法律实施中，通常通过聚合酶链式反应(PCR)利用涉及扩增高度多态性的 短串联重复序列(STR)的人类鉴别系统来将常规的法医DNA样本与被指控的犯罪嫌疑人匹 配。PCR是强大的工具，其容许将痕量的DNA片段复制/扩增到可以以有意义的方式来分 析的数量。这种技术已经适应于DNA测序、DNA指纹图谱等等，并且具有检测样品中的特定 DNA片段的能力。因而，利用人类基因组中STR标记物的高度辨别能力和快速分析速度实现了法医 DNA分析，现在已经成为法医DNA分析中最流行的所选方法。作为说明，STR是DNA的短的延伸，其在二到六个核苷酸的模式被重复并且重复 的序列相互邻近时出现。STR序列在重复单元的长度、重复的数量、以及它们符合递增的 重复模式的严苛度方面不同。STR标记物在整个基因组中是散布的，以每10，000个核苷 酸一次的频率出现。根据2001年国际人类基因组测序联盟(Human Genome Sequencing Consortium)的数据，STR或微卫星(microsatellites)占据了总人类基因组的大约3%。 当前，利用公知的PCR方法，在法医分析中13种STR被分析用于人类鉴别。虽然STR分析是常用的，它具有几项缺陷，其中最显著的是在通过PCR方法的STR 分析之前来自存疑DNA样品的污染，以及进行PCR分析所花费的时间。例如，来自性侵犯证据、要进行STR分析的DNA应当理想地来自侵犯者的精子。然 而，精子样品常常被(1)阴道内衬的上皮细胞，以及偶尔地被(2)来自口腔的上皮细胞(口 腔细胞)和(3)来自皮肤的细胞，以及尿液样品中的细胞污染。同样，在性侵犯犯罪现场样 品中，人们还可能预计看到红血球、嗜中性细胞、泡沫细胞(非标准的上皮细胞)等等。因而，明显的是，如果在进行PCR之前可以从任何或所有的污染细胞中分离出精 子细胞，将实现更好和更精确的STR分析。通常使用的方法如微分萃取(differential extraction)不能完全地分离男性 (侵犯者)精子和女性(受害者)上皮细胞DNA。例如，利用无还原剂溶液的起始裂解，来 裂解上皮细胞(性侵犯法医样品中最常见的污染物)并留下完整精子细胞用于DNA部分的有效分离。然而，差异裂解(differentiallysis)常常引起精子细胞的过早裂解。因而，不 期望的DNA常常在PCR期间被共同扩增。这导致混杂的分布图和不完全的STR分析，使得 超过50%的基于STR分析的人类鉴别失败。此外，在解决法医案件中的另一个局限性来自用于分析的细胞的有限的可获得 性。这可能由于存在有限的证据样品、通常随着时间的过去DNA和细胞样品的降解、和/或 在性侵犯犯罪样品中存在非常少数的精子细胞，从而不能根据标准PCR解决案件。因而，期望一种方法来防止或减轻上述问题，并提供快速、有效和可靠的、在法医样品中以单细胞精确度来分选细胞的方法。

发明内容
本发明一般地涉及分选物体，主要在单个细胞水平上，用于法医DNA分析和医学 诊断之中。更具体地，本发明涉及分选和鉴定法医样品中的物体的方法，包括提供全息光 学捕获设备用于法医样品中物体的分选，所述样品含有要被分离的物体(需要的和不需要 的)；提供含有仓室用于所述物体的分离的样品芯片(基于微流的或其他的)；光学地捕获 所述法医样品中的所述物体，并利用光学捕获将它们分选成需要的和不需要的物体；利用 HOT或微流或两者将至少一种需要的物体从所述样品中移出；以及对所述需要的物体进行 基于PCR的STR分析来确定它们的身份。在根据本发明的一个实施方式中，所述需要的物体是细胞，特别是精子，所述不需 要的物体是污染物，例如上皮细胞、非精子物体，等等。在根据本发明的一个实施方式中，在光学捕获步骤之前，所述方法进一步包括在 微流仓室中的流体中提供法医样品；以及使所述样品流动通过所述微流仓室。所述需要的 物体可以被分选到单独的仓室中，在其中可以进行基于单细胞PCR的STR分析。在根据本发明的一个实施方式中，所述微流仓室包括含有法医样品的输入仓室， 所述样品被导流到至少一个输出仓室中，在其中可以进行基于单细胞PCR的STR分析。在根据本发明的一个实施方式中，鉴定法医样品中的物体并分离它们的方法包括 提供具有输入仓室和至少一个输出仓室的微流仓室；在所述输入仓室中提供法医样品，所 述样品含有要被分离的物体；利用所述微流仓室中的微流将所述物体分离成需要的和不需 要的物体；从所述样品中将至少一种需要的物体移动到至少一个输出仓室中；以及对所述 需要的物体进行基于PCR的STR分析来确定所述需要的物体的身份。每一个上述的主要实施方式的进行步骤可以在单个芯片上进行，和/或基于单细 胞PCR的STR分析在输出仓室中进行。在根据本发明的一个实施方式中，用于分选物体的设备包括含有支持物的全息光 学捕获设备，在所述支持物上放置样品，所述光学捕获设备从所述样品中不需要的物体中 光学地捕获和分选需要的物体；以及用于对所述需要的物体进行基于PCR的STR分析的设备。在根据本发明的一个实施方式中，所述需要的物体是细胞，特别地，是精子，和/ 或进行基于单细胞PCR的STR分析，和/或在单个芯片上进行。在根据本发明的一个实施方式中，所述设备进一步包括用于在光学捕获所述需要 的物体之前使所述样品流动的微流控芯片。
在根据本发明的一个实施方式中，用于分选物体的设备包括含有输入仓室和至少 一个输出仓室的微流控芯片，所述输入仓室含有样品；其中所述微流控芯片使所述样品流 动，从而所述需要的物体从所述样品中不需要的物体中被分选出来，以及所述需要的物体 被分选到至少一个输出仓室中；以及用于对所述需要的物体进行基于PCR的STR分析的设
备。在根据本发明的其他实施方式中，所述设备进一步包括全息光学捕获设备，用于 从输入仓室、从所述样品中不需要的物体中将所述需要的物体分选到至少一个输出仓室 中。在根据本发明的另一个实施方式中，所述需要的物体是细胞，特别是精子，所述不 需要的物体是污染物，单个芯片被用于分选所述物体和进行基于PCR的STR分析，和/或所 述基于PCR的STR分析是基于单细胞PCR的STR分析。对于本发明，基于单细胞PCR的STR分析将分辨其中涉及多个侵犯者的性侵犯案 件，并且将提供解决一些案件的机会，在所述案件中仅可获得有限材料(即，有限数量的流 出的精子)，从而巨量的(基于多细胞PCR的)法医分析是不可行和不可靠的。进一步的， 基于单细胞PCR的STR分析将解决污染的问题(即，其中受害者的上皮细胞与侵犯者的精 子混合的情况，这导致受害者的DNA与侵犯者的DNA —起被共同扩增)。因而，单细胞PCR 将通过排除共同扩增来解决人类鉴定的STR分析失败的根本原因。使用少数细胞来工作的能力(即，进行单细胞PCR)在鉴定法医案件中的侵犯者方 面是重要的，否则这样的案件得不到解决，它还提高了在获得有限样品的情况下(即，无精 子男性)排除被控告人的牵连的概率。进一步的，单细胞PCR改善了处理样品的速度，因为分选单细胞、或少数的单细胞 (对于统计学目的)，比处理数百个细胞(如通常所需要的)花费更少的时间。在PCR之前使用HOT用于单细胞分选，使得本发明使用一次性的芯片，这提供了样 品操作的完全无菌的环境。这将避免在单一平台或多平台上的污染问题(即，来自操作样 品的使用者/技术员)。因而，如果需要，人们可以在无菌的环境中保存证据数据用于将来 的重新分析。进一步的，通过使用微流控芯片，在当前的分选和鉴定过程中被操作的样品体积 将大大地减少。本发明还将是操作上便宜的，因为样品的更小的体积意味着总体需要更少 的试剂。本发明是足够灵活的以提供细胞分选的不同选择(即，使用单独的HOT，或使用单 独的微流，或组合两者)、细胞裂解和DNA提取的不同方式(在芯片上或在单独的试管中) 以及PCR的不同方式(使用平板式热循环仪的芯片上，或利用常规的PCR机器的微离心管 中)。进一步，使用本发明，基于HOT和微流的细胞分选是温和的过程，并且不引起过早 的细胞裂解。本发明不需要样品处理之前的样品染色(不同于具有单细胞提取能力的LCM(激 光捕获微解剖))，从而削减了染料和其他样品处理步骤的成本。然而，如果需要，所提出的 发明与荧光染色的样品是相容的。由于本发明的实施方式包括基于可视化的技术(即，显微镜可视化，或甚至在完 全自动化机器的情况下的机器视觉)，本发明提供了用于法医样品处理的更好的文件编制，例如，记录所有的中间步骤，以及记录在给定情况下分析的细胞的数量，或记载被分析的细 胞的形态。本发明能够完全自动化，而常规的技术，例如微分萃取则不能。进一步的，所述设 备可以被小型化和制成便携的，进行分选和PCR的样品芯片可以制成一次性的。虽然在此描述的用于法医DNA分析的本发明主要涉及性侵犯案件并专注于精子 分离，但是基于单细胞PCR的STR分析的一般性方法可以扩展到其他类型的法医样品，在其 中用于人类鉴定的显著数量的某些细胞类型的分离可能成为挑战。由于微分萃取完全取决 于化学过程而没有显微可视化，可以显现和提取感兴趣细胞用于STR分析的技术，例如本 发明的技术，将在法医领域具有很大益处。本发明将基于单细胞或少数细胞的法医DNA分析的范围 从性侵犯犯罪案件扩展 到战争受害者或士兵的人类鉴定(例如，在军事法医的领域)。它还可以用于亲子鉴定，其 中，来自嫌疑者的充足的样品的采集常常是难题。进一步的，本发明可以用于癌症诊断的领域，其中基于PCR的STR分析常常用于从 样本样品中的正常细胞中辨别癌细胞，通过计算样本样品中看上去健康的细胞和癌症细胞 的百分比，在单细胞水平上的STR分析将提供关于疾病的严重度和发展的额外的信息。因而，列出了根据本发明的某些特征，以使后续的详细说明被更好地理解，以及使 得当前对技术的贡献被更好地理解。当然，存在着根据本发明的其他特征，它们将在下文被 描述并且将构成附随的权利要求的主题。在这点上，在详细地解释根据本发明的至少一个实施方式之前，要理解的是本发 明在它的应用中不被限制于在下文的说明中阐述的、或在附图中例举的结构的细节和元件 的布置。根据本发明的方法和设备能是其他实施方式，并且能够以多种方式实践和进行。并 且，要理解的是在此采用的用语和术语以及下文包括的摘要，是为了说明的目的而不应认 为是限制性的。因而，本领域技术人员将理解，本公开内容所基于的构思可以容易地用作用于进 行本发明的不同目的的其他结构、方法和系统的设计的基础。因而，重要的是，权利要求 被认为包括了这些等价的构建体，前提是它们不背离根据本发明的方法和设备的精神和范围。


图1是根据本发明的一个实施方式的全息光学捕获设备的示意图。图2是根据本发明的一个实施方式的物体分选设备的示意图，包括微流控芯片、 全息光学捕获设备和进行基于PCR的STR分析的设备。图3是根据本发明的另一个实施方式的物体分选设备的示意图，包括微流控芯片 和单细胞PCR/STR设备。图4是根据本发明的另一个实施方式的物体分选设备的示意图，包括微流控芯 片、全息光学捕获设备和PCR/STR设备。图5是根据本发明的另一个实施方式的物体分选设备的示意图，包括微流控芯片 和PCR/STR设备。图6是根据本发明的另一个实施方式的物体分选设备的示意图，包括微流控芯片和芯片上PCR/STR设备。
具体实施例方式本发明涉及用于在法医DNA分析中分选物体的方法和设备。特别是，本发明使用 了新的方法，即，基于单细胞PCR的STR分析，和(或没有)全息光学捕获(HOT)、和/或微 流仓室，来从污染物中分离精子，并在法医DNA分析中进行侵犯者的鉴定。用于分选物体的 目的的芯片也可以用于进行细胞裂解、DNA提取和PCR(芯片上PCR)的下游步骤。进一步的，微流控芯片被用于在进行基于单细胞的PCR分析之前使所述样品流动并从不需要的污染物中分选出感兴趣的物体(细胞)。不同于使用单独的HOT用于分选，在 存在着大数量和多样性的污染物的样品的情况下，所述操作在利用HOT之前使用基于微流 的分选。与使用单独的HOT用于分选相比，这种HOT和微流的组合用于分选还可以改善通 过量(削减PCR之前的分选时间)和纯度。用于物体鉴别和分选的芯片可以与用于STR分 析的单细胞PCR的芯片是同一个。法医学的单细胞PCR具有几个优点，包括避免不需要的细胞的污染的能力、处理 有限的证据样品的能力、检测多个侵犯者的能力、改进的速度和自动化，以及降低成本的可 能性。用于法医分析的芯片上PCR还具有多种优点，例如，便携性、小型化和维持无菌的环 境用于操作。本发明提出了芯片上PCR用于法医分析的新的用途，从而创造了一次性芯片的新 的种类，其将最小化中间处理。所提出的发明包括基于可视化的方法，并提供了记载分析样 品时所有中间处理步骤的能力。虽然按照法医学详细描述了本发明，但是在法医之外的领域，例如，癌症诊断的领 域具有很大价值，在其中根据STR来鉴定稀有的细胞(S卩，癌细胞)和从正常细胞中辨别出 它们。在根据本发明的第一个实施方式中，全息光学捕获(HOT)被用于鉴定和捕获精子 细胞，并从性侵犯犯罪样品中的其他污染细胞中分选出它们。HOT设备100 (例如，参见Grier等的美国专利No. 6，055，106，通过引用合并在此) 包括用作光源的激光器101，来光学地捕获和操作支持物103上的样品102中的物体(参见 图1)。特别地，激光器101发射平行激光束104，激光平行光束通过衍射光学元件(DOE) 105， 例如空间光调制器(SLM) 105来成形，并经过例如望远镜透镜107、108和二色镜109转移到 物镜106的背部小孔。光束104通过DOE 105分解成多个小波束，并在显微设备(物镜106 是其一部分)的支持物103上形成多个可独立活动的光阱110。支持物103和样品102被 发自光源112的波束111照亮。点B'与图1中的B是配对的。然而注意到的是，如果希 望，望远镜透镜107、108可以从设备100中排除，并用单个转移透镜(transfer lens)替换。成像光学器件113，例如CXD照相机，等等，被用于观察样品102中光学捕获的物 体。设备100可以连接到计算机(未显示)，其可以控制光学捕获，并可以记录操作期间的 数据。在这个实施方式中，全息光学捕获设备被用于分选法医样品102中的物体。精子 和其他细胞的样品102获自犯罪现场，例如通过吸移、重力，或通过其他有源或者无源的机 构，洗脱样品102中的细胞并将其置于微流控芯片200(参见图2)上。微流控芯片200被置于显微镜平台103上用于目视检查，人工地或利用计算机控制自动化地进行。因而，H0T100被用于通过目视(显微镜或监测器)检查从其他污染细胞中分离法 医样品102中的精子细胞，例如，通过将光学捕获的精子从微流控芯片200的一个区域移动 到同一芯片200上的各个仓室201-203中。然后，进行基于PCR的STR分析204来鉴别其DNA标记物与精子(样本样品)的 STR分析匹配的人(一般匹配CODIS数据库中保存的STR标记物)。基于PCR的STR分析 本身是本领域公知的，已经被广泛地商品化。特别地，芯片200置于平板式热循环仪上，其中提取的DNA利用STR引物通过PCR 来扩增，所述STR引物对于法医案件是商业上可获得的。做为选择，当不涉及法医案件时， 可以使用定制的合适的引物。热循环的次数增加到在PCR循环结束时从各个细胞中留下足 够的DNA。DNA提取可以通过离心(细胞裂解之后)或通过附着到磁性珠子来进行，在其中通 过改变PH值(改变DNA上的电荷，即，通过影响DNA与珠子的结合)或通过改变洗脱缓冲 液的盐浓度将DNA从珠子(磁性的或其他)上洗脱下来。一旦完成了 PCR，扩增的DNA在凝胶(一般地)上跑动用于对经历了 PCR的扩增 DNA的STR分析，其中每个PCR反应相应于来自单个精子的扩增DNA。商业上可获得的仪器 可以用于这个目的。通常，需要显著数量的细胞来得到可靠的STR读出信号。然而，使用基于HOT的精 子分离的温和方法和改善的敏感性，可以进行从污染的非精子细胞中更可靠的分离，就基 于PCR的STR分析所需的精子细胞的数目而言，人们可以将样品采集从约200个(在常规 方法中所需的)降低到几个细胞，或甚至单个细胞PCR的水平，大大地提高了它的效力(参 见仓室201-203)。因而，利用标准的PCR方法，可以对仓室201-203中的每个单独的精子进行单细胞 PCR ( 一次裂解一个精子，提取DNA)。在另一个实施方式中，在从单细胞中提取之后，DNA可以转移到Eppendorf试管中 用于在STR分析之前进行PCR反应。可以在一个仪器上在任何给定的时间进行多个PCR反 应。然而，为了避免从分选芯片到试管的转移期间的DNA损失，PCR可以如上所述利用平板 式热循环仪在芯片上进行。除了在试管中或平板上的标准PCR/STR分析之外，在一个实施方式中，所述分析 还可以在单个芯片206上进行(芯片上PCR)(参见图3)。如图3中所示，在这个实施方式 中，样品102中的精子可以被原位裂解200，或每个孔或仓室201-203中的精子可以被裂 解并穿过滤器207来从DNA中分离细胞碎片，仅容许DNA进入下一个仓室208，在其中进行 PCR (大量)(即，对来自几个精子的DNA进行)。仓室208连接到具有STR读出能力的芯片 上PCR设备206。然后对每个分析的个体精子产生最终的STR报告，对来自单个精子的STR读出产 生统计数据。例如，如果是用于法医用途，则将产生的数据与用于人类鉴别的CODIS数据库 匹配。基于单个精子(单细胞)PCR的STR读出的优点是(1)它解决了多种细胞的情况下的污染难题，这是当前在基于PCR的STR分析中的主要难题，由于不需要的DNA的共同扩增而产生。(2)它提高了根据STR读出的统计显著性(标准法规所公认的)来检测多个侵犯 者的可能性(如果在性侵犯案件涉及多个侵犯者)；(3)它提供了分析由于样品精子细胞的有限可获得性导致获得200个精子细胞 成为挑战的那些犯罪案件的能力，因而，例如，增强了在性侵犯案件中排除被指控的人的概 率；禾口(4)由于分离一个或少数细胞比分离基于标准PCR的分析中使用的许多细胞要更 快，它加快了总处理时间。因而，人们可以设想革新基于STR的法医学的性质和范围，提供对之前充足的样 品采集成为难题的更多案件的解决方案。对一个或少数细胞的分析也将减少样品采集时 间。在等位基因遗失是一难题以及STR分布图(根据标准的巨量PCR分析)不能与 CODIS数据库匹配(显性等位基因屏蔽了另一个)的罕见情况下，存在着更大的可能性来利 用相关的统计计算将从单细胞PCR获得的STR标志(STR signature)与数据库匹配，来得 到所需的概率。通过对各个精子细胞进行STR分析，以及一个接一个地对来自给定样品的多个精 子细胞重复分析，人们现在可以可靠地解决涉及多个侵犯者的性侵犯案件，例如在轮奸犯 罪中。因而，在分辨来自细胞混合物集合的个体的STR分布图时不需要解缠绕。进一步的，基于单细胞PCR的法医学将提供对来自给定样本的多个单细胞进行重 复测量的可能性，在解决犯罪案件时可以获得统计学上更可靠的数据。通过降低试剂的成本，本发明在微流控芯片上操作也是更加便宜的。进一步的，一 次性物品的使用以及HOT设备的小型化的余地将提高它的可携带性。因而，可以看出的是，基于HOT的精子分选与现有技术相比是更可靠的，不会损害 扩增子DNA。进一步的，由于利用光线来从法医样品102中捕获和分选感兴趣的实体的HOT 100不会损害从细胞样品102获得的DNA，这种方法将加快数据采集(即，与捕获200个细 胞相比，它将花费较少的时间来捕获一个或几个细胞)，产生改善的速度(通过降低用于基 于单细胞PCR的法医学的样品大小)和改善的纯度(差异光学分选比依靠化学提取的差异 裂解更好)，并提供了自动化的余地(现有的用于法医DNA分析的技术目前基本上都不允许 自动化)。利用HOT 100分选的精子细胞的改善的纯度和质量控制将促成改善的PCR和STR 分析204，从而帮助解决过多的未解决案件，其中由于来自污染细胞的不需要的扩增子(常 常来自受害者)与来自精子的期望的扩增子(来自侵犯者)一起扩增而构成了上皮细胞或 其他细胞的污染问题。注意，PCR和STR分析也可以对污染物或不需要的物体(即，上皮细 胞)进行，以交叉核对存档的犯罪指控的有效性。可选择的精子分选技术，例如化学分离方法如微分萃取或机械分离例如真空过滤或trak-蚀刻过滤(其是机械驱动的)，在精子分选中不能提供如H0T100所实现的可视(基 于显微镜的)检查，是不那么有效的。这些方法常常引起精子的过早裂解，对于要用于STR 读出的待分析的DNA是有害的。此外，用于在STR分析之前的细胞操作的上述现有方法都不具有进行单细胞分析的能力，这是本发明的优点。光学捕获(HOT) 100提供了显现和捕获精子细胞的独特的能 力，而不是依靠化学分离方法，在该方法中基于可视化的分选是不可能的。因而，本发明使用了单个或几个细胞的PCR用于法医学，其将帮助解决通过标准PCR方法一般不能解决的性侵犯案件。进一步的，本发明将解决犯罪者是例如少精子男性的 案件。这些男性在它们的精液射出物中具有非常少的精子数，这使得基于标准PCR的STR 方法失败，在所述方法中要扩增的DNA来源来自差异裂解。因而，使用HOT 100和单细胞 PCR204可以提供法医分析中要求的鉴定。在根据本发明的第二实施方式中，具有仓室的微流控芯片300可以与或不与HOT 100 一起使用，来在基于PCR的STR分析301之前进行精子分选(参见图4)。特别地，所提出的精子分选的方法可以在光学透明的微流控芯片300上进行，从 而容许对非常小体积的样品进行操作。利用具有仓室的微流控芯片300的样品分离是本领 域公知的，已经被广泛地商品化。在此通过调整思想和在微流控芯片的不同的层(深度上 或ζ方向上)中引入通道，提供了单细胞分离。例如，具有输入仓室304和多个输出仓室305 (通过通道306连接，但是其可以在 精子分选之后相互隔离)的定制的微流控芯片300(参见图4)，可以用于从样品302的其他 污染物(非精子)中、以及从精子中相互地分离单个精子细胞。微流仓室300将包括流体 注射器以及通过仓室304的流体缓冲液(未显示)。在一个实例中，输入仓室304的尺寸根据确切的样品302需求来选择，但是对于精 子分选，估计可以是500 μ m长度，100 μ m宽度，以及基于使用的样品体积的深度，但可能是 1-5 μ 1 (或更少，例如在纳升的范围内，因为芯片上PCR可以在纳升的体积下成功地进行)。 输出仓室305可以小于输入仓室304，具有合适的大小，仓室305经由通道306或多通道306 连接到输入仓室304，一个或多个仓室304连接到输入仓室304，形成无菌的一次性芯片。在可获得有限的起始材料的情况下，使用微流控芯片300，同时进行或者不进行 HOT 100，在降低试剂成本和在进行基于PCR的STR分析之前维持理想的精子数量密度方面 是重要的。例如，在这个实施方式中，棉拭从犯罪现场获得，通过有源机构或吸移，洗脱样品 细胞(精子和污染物)302并将其置于微流控芯片300上。微流控芯片300被置于显微镜 平台303上用于目视检查(人工的或使用计算机控制自动化的)(参见图4)。然后使用微流仓室从上皮细胞中分离精子，在另一个实施方式中使用HOT 100，用 于随后将置入输入仓室304的样品302分选到各个仓室中(如果希望)。特别地，由于精 子倾向于粘在仓室或孔304边缘，如果存在着源自输入仓室/孔304的多连接通道306的 超过一个输出仓室/孔305，可能易于提高通过量(即，在给定时间中可以分选多少精子细 胞)，以及避免来自污染性非精子细胞的干扰。这种安排将改善精子分选中的可靠性和效 力。在利用微流流动或通过使用HOT 100进行分选之后，仓室305可以使用常规的方 法例如活瓣/塞子来与输入仓室304密封隔离。做为选择，分选的物体的回流可以通过减 小(调节)通道的尺寸(一般是宽度)来防止，而不是保持它们在整个给定的微流控芯片 上是均一的。然后在微流控芯片300上进行在芯片的各个仓室304中的精子裂解，然后可以人工地或使用机器人提取溶胞产物，从而提取DNA。来自每种精子的DNA然后放置在同一芯 片300的独立的仓室305中，或在可选择的实施方式中，放置在第二芯片上，如第一实施方 式中所描述的。如上文在第一实施方式中描述的，具有提取的DNA的芯片300然后置于PCR(热循 环仪)机器306上用于利用STR引物来扩增。然后对PCR扩增的DNA进行STR分析(即， 凝胶流动来鉴定相对于标准STR标记物的条带)。
因而，也可以在这个实施方式中进行基于单细胞PCR的STR分析。最后，如上文声明的，对单独的精子分析产生最终的STR报告，产生统计学数据用 于相对于标准数据库的合适的匹配(例如，用于人类鉴别的C0DIS)。因而，如上所述，HOT 100与基于PCR的STR分析一起使用，来容许单细胞分析和 标准的巨量(多细胞)分析。进一步的，如上所述，HOT 100容许在三维空间中移动、旋转 和操作单个的细胞。人们可以使用可见的或红外的照明用于光学捕获，来鉴定和移动精子 细胞从而将它们从样品中污染上皮细胞中分离。可见的或红外的激发光的使用消除了细胞 损伤的最大顾虑，其在使用UV光线时可能遭遇到。分选的精子细胞可以各自导入单独的仓 室(即，在给定的仓室中的一个或几个同种类型的细胞)，可以原位地或以其他方式进行所 需的基于PCR的STR分析。因而，人们可以选择对单个或多个精子细胞进行随后的PCR和STR分析，提供与标 准的巨量分析相比单细胞分析的所有优点。如上所述，基于PCR的STR分析也可以在芯片上进行，从而自始至终仅使用单个芯 片。在根据本发明的第三实施方式中，第二实施方式的微流控芯片400被改进，从而 控制来自输入仓室401的流体的流动速度(参见图5)、通道402的尺寸(例如，长度、宽度、 深度)和芯片400本身的材料，以一定的方式对流动进行调节使得来自样品402的两个细 胞不占据通道403内的同一个位置，或者更严格地，不靠近接点404，因而，单个细胞可以通 过通道405被分选到仓室406-409等等中。一个仓室(即，406)理想地容纳一个细胞。此外，可以引入滤器410来仅容许精子细胞进入通道403。细胞可以在仓室406-409中裂解，相应的仓室411-414将含有来自各个细胞的提 取的DNA。在一个实施方式中，可以对仓室411-414中的DNA进行PCR415(如上所述)，或 可以经由吸移或通过有源(泵送)机构，或使用机器人臂进行DNA转移来将DNA转移到另 一个芯片中。在可选择的实施方式中，含有从棉拭洗脱的样品402(细胞混合物)的输入仓室 401可以构建成层叠形式，其中可以容许精子细胞沉降在仓室401的底部，并且可以构建为 来自该层，来经由通道403中提取单个细胞。多个层含有单独的通道组，并且不容许细胞混 杂。可以在微流控芯片400中引入活瓣来防止分选的物质发生回流。在根据本发明的第四个实施方式中，来自样品500(参见图6)的洗脱细胞被洗脱 到微流控芯片502上的进入仓室501中，在其中沉积样品500。来自样品500的污染物(即，上皮细胞)沉积在进入仓室/储池501的底部，精子 细胞通过流体流动穿过通道503聚集在排出仓室储池504中。在第二阶段中，根据早先描 述的方法，各个采集储池504-507采集经由通道508分选的精子。
在第三阶段中，单个精子的裂解在仓室509-512中发生，根据早先描述的方法，通 过单细胞PCR(芯片上PCR)提取DNA。在另一个实施方式中，PCR和STR分析的过程可以是自动化的，可以实现高速度， 其将消除在STR分析中使用的当前方法中常常遇到另一个瓶颈。当前的微分萃取几乎完全 是人工操作的。其他的技术如利用不同孔径大小的筛滤(trak-蚀刻过滤)的机械分选也 无助于往往会阻塞滤器的自动化。然而，精子从上皮细胞中基于HOT的分选可以容易地自 动化。自动化将降低操作成本和时间，从而在给定的时间内解决更多的性侵犯案件。在根据本发明的又一个实施方式中，所提出的方法与自动化和多重化 (multiplexing)是相容的，即，进行多个法医样品分析，从而提高分析能力。在根据本发明的又一个实施方式中，与机器人的结合可以同时洗脱、分离和测试 多个犯罪样品，从而提高分析能力，所述结合包括额外的优点，因为它是平台独立性的，即， 可以在载玻片(盖玻片)上或在试管中或在Eppendorf试管中或甚至以96孔形式进行(假 定现在存在可以以96孔或更多孔形式进行PCR的机器，利用这样的分离，原位PCR是可能 的)。机器人操作避免了可能来自细胞样品的操作者处理的其他污染源。如上所述，这种方法还与法医样品的原位PCR是相容的。因而，原位PCR的所有优 点是成立的，例如(i)降低污染的概率，因为原位PCR将包括更少的步骤并且避免从一个容器向另 一个容器的样品转移；以及(ii)通过限制可能与更多步骤和样品的转移相关的供应成本，减少这种法医分析 的成本。因而，由于来自单细胞的DNA含量有限，与现有的基于多细胞(巨量)PCR的方法 相比，在STR分析之前的PCR循环的次数将增加。为了解决使用来自单个精子的基因组DNA作为模板扩增子等量扩增13种STR片 段的问题，人们可以进行实时PCR作为对照用于额外的质量控制而不损害时间或效率。并 且，如对多个细胞所进行的，可以按相同的方式对单个细胞进行多重PCR。因而，基于单细胞PCR的法医学提供了分析犯罪样品的额外的优点而不损害现有 的基于巨量(多细胞)PCR的法医学所提供的优点。最后，如上所述，单细胞PCR可以被自动化，也可以在芯片上(芯片上PCR)进行， 增加了小型化和可携带性的机会。小型化和可携带性的机会打开了基于单细胞PCR的法医DNA分析超越性侵犯犯罪 案件进入战争受害者或战争士兵的人类鉴别的领域(例如，在军队法医的领域)，以及甚至 亲子鉴定，其中从嫌疑人采集足够的样品常常是困难的。 单个精子STR读出的优点是，它提高了根据STR读出的统计显著性(标准法规所 公认的)来检测多个侵犯者的可能性(如果在性侵犯案件中涉及多个侵犯者)。在可获得 有限的样品(可获得< 200个精子)用于分析的情况下，它还提高了排除性侵犯案件中的 被控告人的概率。在等位基因遗失是一难题以及STR分布图(根据标准的巨量PCR分析) 不能与CODIS数据库匹配(显性等位基因屏蔽了另一个)的罕见情况中，存在着更大的可 能性来利用相关的统计计算将从单细胞PCR获得的STR标志与数据库匹配，来得到所需的 概率。因而，本发明在解决法医DNA分析中现有的许多难题方面是有益的。
要强调的是，上文描述的本发明的实施方式仅仅是为了清楚理解本发明的原则来 阐述的可能的实施实例。变化和改变可以对本发明的上述实施方式来进行，而不背离本发明的精神和原理。所有这样的改变和变化意图在此被包括在本发明的范围内，由以下的权 利要求保护。
权利要求
一种在样品中分选物体和鉴定所述物体的方法，包括提供全息光学捕获设备；提供样品，所述样品含有要分离的物体；光学地捕获所述样品中的所述物体；利用所述光学捕获将所述物体分选成为需要的物体和不需要的物体；从所述样品中移出至少一种需要的物体；以及对所述需要的物体进行基于PCR的STR分析来确定所述需要的物体的身份。
2.根据权利要求1的方法，其中在所述光学捕获步骤之前，所述方法进一步包括 在微流控芯片的液流中提供所述样品；以及使所述样品流动通过所述微流控芯片。
3.根据权利要求2的方法，其中每个所述需要的物体被分选到单个仓室中。
4.根据权利要求2的方法，其中所述分选步骤和所述进行步骤在单个微流控芯片上进行。
5.根据权利要求1的方法，其中所述需要的物体是细胞，所述不需要的物体是污染物。
6.根据权利要求1的方法，其中所述需要的物体是癌细胞，所述不需要的物体是健康 细胞，或反之。
7.根据权利要求3的方法，其中所述进行步骤是基于单细胞PCR的STR分析。
8.根据权利要求5的方法，其中所述微流仓室包括含有所述样品的输入仓室，所述样 品从所述输入仓室流动进入至少一个输出仓室。
9.根据权利要求8的方法，进一步包括 在所述输入仓室的出口处提供滤器。
10.根据权利要求9的方法，进一步包括 在所述微流仓室中提供活瓣来防止回流。
11.根据权利要求1的方法，其中所述分选和PCR进行步骤是自动化和多重化的。
12.—种在样品中分选物体和鉴定所述物体的方法，包括 提供具有输入仓室和至少一个输出仓室的微流控芯片； 在所述输入仓室中提供样品，所述样品含有要分选的物体；利用所述输入仓室中的液流分选所述物体，从而所述物体被分选成为需要的物体和不 需要的物体；将所述需要的物体移动到至少一个所述输出仓室中；以及对每个所述需要的物体进行基于PCR的STR分析来确定所述需要的物体的身份。
13.根据权利要求12的方法，其中所述分选步骤和所述进行步骤在单个微流控芯片上 进行。
14.根据权利要求12的方法，其中所述需要的物体是细胞，所述不需要的物体是污染物。
15.根据权利要求12的方法，其中所述进行步骤是基于单细胞PCR的STR分析。
16.根据权利要求12的方法，其中所述需要的物体是正常细胞，所述不需要的物体是 癌细胞，或反之。
17.根据权利要求12的方法，进一步包括在所述输入仓室的出口处提供滤器。
18.根据权利要求17的方法，进一步包括 在所述微流仓室中提供活瓣来防止回流。
19.根据权利要求12的方法，其中所述分选和PCR进行步骤是自动化和多重化的。
20.一种用于分选物体的设备，包括全息光学捕获设备含有其上放置样品的支持物，所述光学捕获设备从所述样品中不需 要的物体中光学地捕获和分选需要的物体；以及用于对所述需要的物体进行基于PCR的STR分析的设备。
21.根据权利要求20的设备，其中所述需要的物体是细胞，所述不需要的物体是污染物。
22.根据权利要求20的设备，其中所述需要的物体是正常细胞，所述不需要的物体是 癌细胞，或反之。
23.根据权利要求20的设备，其中所述PCR设备进行基于单细胞PCR的STR分析。
24.根据权利要求20的设备，进一步包括微流控芯片，用于在对所述需要的物体进行光学捕获之前使所述样品流动。
25.根据权利要求20的设备，其中用于进行所述基于PCR的STR分析的所述支持物和 所述设备是单个芯片。
26.根据权利要求20的设备，进一步包括放置在所述微流仓室中的多个活瓣，来防止回流。
27.根据权利要求20的设备，进一步包括 放置在所述进入仓室的出口处的滤器。
28.根据权利要求20的设备，其中所述分选和PCR进行步骤是自动化和多重化的。
29.一种用于分选物体的设备，包括含有输入仓室和至少一个输出仓室的微流控芯片，所述输入仓室含有样品； 其中所述微流控芯片使所述样品流动，从而需要的物体从不需要的物体中被分选出 来，从所述输入仓室进入到所述至少一个输出仓室中；以及 用于对所述需要的物体进行基于PCR的STR分析的设备。
30.根据权利要求29的设备，进一步包括全息光学捕获设备，用于从所述不需要的物体中将所述需要的物体从所述输入仓室分 选到所述至少一个输出仓室中。
31.根据权利要求29的设备，其中所述微流控芯片和用于进行所述基于PCR的STR分 析的所述设备是单个芯片。
32.根据权利要求29的设备，其中所述物体是细胞，所述不需要的物体是污染物。
33.根据权利要求29的设备，其中所述需要的物体是正常细胞，所述不需要的物体是 癌细胞。
34.根据权利要求29的设备，进一步包括放置在所述微流仓室中的多个活瓣，来防止回流。
35.根据权利要求29的设备，进一步包括 放置在所述进入仓室的出口处的滤器。
36.根据权利要求29的设备，其中所述分选和PCR进行步骤是自动化和多重化的。
全文摘要
本发明涉及在法医样品中分选物体和鉴定所述物体的设备和方法，包括使用全息光学捕获来从污染物中分选物体，和对所述物体进行基于(单细胞)PCR的STR分析来确定它们的身份。此外，用作支持物用于分选所述物体的芯片也可以用于进行基于单细胞PCR的STR分析。在另一个实施方式中，在进行基于单细胞PCR的STR分析之前，微流控芯片被用于使所述样品流动和分选所述物体。在不存在或存在微流流动和分选的情况下，用于利用HOT的分选的芯片也可以与用于基于单细胞PCR的STR分析的芯片是同一个。
文档编号B01D11/00GK101801491SQ200880106047
公开日2010年8月11日 申请日期2008年9月11日 优先权日2007年9月13日
发明者塔尼亚·沙克拉巴季 申请人:阿尔利克斯公司