用于分散活性剂的疏水蛋白的制作方法

专利名称：用于分散活性剂的疏水蛋白的制作方法
用于分散活性剂的疏水蛋白
技术领域：
本发明涉及药物，营养物或其他活性剂施用领域。其提供包含具有增强的特征的活性剂的粒子和制剂的新产物。其还提供以纳米尺度产生所述粒子的方法。
背景技术：
近年已研究差可溶性化合物的生物利用度，药物和营养物的靶向的递送和受控释放。专利申请公开CA2606861涉及差可溶性药物物质的药学稳定的纳米粒子制剂，涉及制备该制剂的方法，及涉及其使用方法。其公开包含具有纳米尺度的平均粒子大小的差可溶性药物物质，固体或半固体分散媒质，及任选地非-表面修饰赋形剂的药学制剂。所使用的分散媒质选自油，脂肪及甘油酯。缺点是用脂肪媒质，过程中需要乳化剂或加温来增加含水基质和媒质之间的相互作用。未应用蛋白。另一专利申请公开，US2005255152(A1)，公开用于靶向的药物递送的方法和组合物。所述组合物包括靶向分子，诸如特异性结合于靶向的细胞表面的受体的激素；待递送的药物，诸如会杀祀向的细胞的毒素；及纳米粒子，其在纳米粒子上或之内含有，待递送的药物，以及其上附接了靶向分子。纳米粒子可由药物或与载体关联的药物组成，所述载体诸如控制的或持续的释放物质如聚(丙交酯-共-乙交酯)，脂质体或表面活性剂。用于受控释放的药物递送系统的再一例是专利申请公开US2007053870(A1)，其中讨论了多糖-官能化的纳米粒子，包含纳米粒子的用于受控释放的药物递送系统和其制备方法。尤其是，该公开的纳米粒子包含可生物降解的聚合物核心，生物相容性聚合物乳化剂的外部水凝胶层和物理学结合于核心和水凝胶层的多糖，由此致使增强蛋白药物诸如生长因子的稳定性和受控释放。再一公开，US2008213373(A1)，描述了开发来治疗或减少呼吸道感染扩展的制剂。制剂包括微粒，纳米粒子或纳米粒子聚集物形式的药物或疫苗，及，任选地，可通过吸入递送的载体。在一实施方式中，粒子是纳米粒子，其可作为具有μ m直径的多孔纳米粒子聚集物施用，其在施用后分散进入纳米粒子。根据所述申请的作者，纳米粒子可用表面活性剂或蛋白包被来包被，即使其尚未证明或甚至推测哪种蛋白会适合。专利申请公开W02010/003811与用低量的疏水蛋白修饰大药物结晶的形态以便控制溶出率相关。作者未产生稳定的纳米粒子，而是仅产生亚稳定中间产物，其在实施例中描述的过程末了结晶化成大结晶。所述申请与以相对粗方式的传统药物技术和粉末处理相关。实施例中的起点旨在通过加热药物/HFB溶液然后使其缓慢冷却及结晶化为某些形态来创建过饱和的状态。这是制造纯有机结晶和处理药物的非常常见的方式，其中时标粗略地讲从数小时到数天。提及的尺寸范围覆盖自蛋白本身到小岩石的任何物质。粒度分布实际上公开了 ΙΟμ 100 μ m的范围。W02010/003811的方法不涉及纳米技术。为了达到最佳治疗性活性，药学制剂需要提供对于活跃的药学制剂的足够的载量，生产及存储期间充分的稳定性，及提供在身体内可接受的药代动力学性质的适当的释放速度。今天，需要解决2种主要挑战，以便优化开发中的药学制剂。无论标的的药物递送途径，口腔，肺部，经皮或肠胃外，例如，这些挑战是(I) 一般的差溶解度减慢新开发的活跃的药学制剂(API)的溶出率和⑵保证的精确的药物释放和药物递送流程，以在作用位点以最佳速度达到最佳治疗性API浓度。口腔控制的递送系统可基于它们的药物释放机理广泛地分为如下类别(1)溶解-受控释放(a.包裹溶解控制和b.基质溶解控制)，(2)扩散-受控释放(a.贮器装置和b.基质装置)，(3)离子交换树脂，⑷渗透受控释放，及(5)胃保持系统。作为赋形剂的疏水蛋白给至少溶解和扩散的机理，也许也给胃保持机理提供新解决方案。疏水蛋白的溶解增强及释放控制基于提供溶解的大表面积的小尺寸的粒子。一般而言，药物溶剂赋形齐U，如醇，甘油，PEG/PE0，丙二醇，例如，提供制剂中API的改善的溶解度。另一方面，常常使用压片赋形剂如润湿/解离剂，如淀粉，微晶纤维素，交叉-连接的羧甲基纤维素钠等。发明概述本发明的目的在于提供生产包含粒子的产品的方法，各粒子包含活性剂及疏水蛋白，具有增强的施用性质，诸如分散性或溶解度。一般，疏水粒子到含水基质的溶解度增强，但如本发明的一方面，情况可相反；疏水基质中固体亲水粒子的更佳兼容性。作为新药物赋形剂的疏水蛋白，其通过在微-和/或纳米粒子的核心中包裹活性剂物质给差溶解度和精确的药物释放和药物递送流程的问题提供剪裁的解决方案。发明人意外地发现，用由包含至少一种活性剂的核心组成的本发明的粒子，该核心至少部分被疏水蛋白包被，可实现提及的目的。本发明的包含粒子的产品特征在于权利要求I中所陈述的。本发明的另一目的旨在提供具有用于它们可靶向的功能或特征的包含活性剂的粒子或自所述粒子控制性地释放的所述活性剂。发明人发现，用作活性剂的包被的疏水蛋白的官能化提供控制动物，包括人，代谢中运动性，摄取，靶向或监控药物或活性成分的可能性。此外，连接到疏水蛋白的官能部分可作为将粒子结合到对于药物，食品或化妆品加工有益的基质的锚。该靶向的其他用途在其他活性制剂的设计，例如，在天然的产物，对照物质或化学试剂的施剂中。在另一优选的实施方式中，所述粒子由包含至少一种疏水活性剂的核心组成，所述核心至少部分被具有疏水蛋白部分和官能部分二者的融合蛋白覆盖。提供所述益处的粒子特征在于权利要求7中陈述的。本发明的另一目的是提供产生具有大面积体积比的粒子的方法。而且，作为非常小粒子沉淀疏水活性剂的方法是另一目的。优选地，呈现为尽可能均一大小的粒子产品，即尺寸和形状分布尽可能窄的单分散粒子。再一目的是用提供保护免于物理/化学/生物学株的连续或部分层包被疏水活性剂的核心的方法。本发明的方法在权利要求18及19中定义。本发明的方法导致可用于药物施用，受控释放应用和药物靶向的粒子的形成，如在权利要求22中表征。再一目的是提供用于食品，饲料，药学活性剂，天然产物和其他活性剂的施用的改善的粒子。此目的通过使用疏水蛋白作为活性剂的核心的包被来实现，如权利要求23中陈述的。以下，在详述的辅助下参照一些实施例更详细说明本发明。

图I例证纯伊曲康唑(ITR)和装载进实施例8中描述的纳米纤维纤维素基质的伊曲康唑纳米粒子的溶出率。装载的样品用海藻糖(TRE)或赤藓糖醇(ERY)冷冻干燥，以在干燥过程中保存纳米结构。KC和NFC指称不同级的纳米纤维纤维素。矩形表示ITR粉，球ITR+HFBI-DCBD+KC+TRE/ 冻干和三角 ITR+HFBI-DCBD+NFC+ERY/ 冻干。图2揭示HFBII的结构。参与结合的疏水氨基酸残基是疏水残基L7，L19，122，A61和V57。参照Hakanp迎等人i。图3显示不用(a)及用(b)疏水蛋白沉淀的药物粒子的尺寸和形状之间的比较。依赖于疏水蛋白的分别缺失或存在，自产生几个μ m长度的针(a)或基本上球形固体的纳米尺度的聚集物(b)的去离子水沉淀倍氯米松。图4显示沉淀温度对形成的粒子的效应。根据实施例Ia在冰浴中(a)及于室温(b)制备的BDP-HFBII粒子。依赖于反应温度，自产生纳米尺度球形固体聚集物(a)或几个μ m长度的杆(b)的去离子水再次沉淀倍氯米松。图5.提供在实施例Ib中产生的显示高度单分散及球形粒子的HFBII稳定化的伊曲康唑粒子的TEM图像。粒子似乎具有形成具有约70 90nm的平均直径的粒子的几百个nm的砾岩的一些趋势。所述砾岩可预期在施用后分散进纳米粒子。图6.显示在实施例2中形成的粒子的荧光显微镜图像。微粒明显是荧光和纳米粒子，其用光学显微镜几乎是非-可检测的，在荧光模式下可检测。此展示所显示的在疏水蛋白融合蛋白的辅助下官能化的纳米粒子产生的方法的可行性。荧光显微镜图像展示GFP-HFBI HFBII (I 3)包被的BDP纳米粒子(图6b ;尺度20 μ m)和微粒(图6a ;尺度100 μ m)。纳米粒子对于用常规光学显微镜适当地聚焦而言太小，但可见于荧光图像。水中游离的GFP-HFBI将水相染色成淡绿。水-BDP界面具有更高浓度的蛋白，因此是明亮的绿色。图7显示展示本发明的一实施方式的用3nm巯基琥珀酸(MSA)包被的Au纳米粒子装饰的BDP-HFBII-纳米粒子，即以猜想及定位目的的金属纳米粒子包被的纳米粒子的产生。通过在药物纳米粒子表面的金纳米粒子增强图像的对比度。图8显示结合于纤维素纳米纤维的HFBII包被的ITR纳米粒子的TEM(比例尺2ym)图像。在制备之后(8a)和在悬浮液中存储I个月之后(Sb)立即形态相同。图9 是(a)O. 3M NaCl 中制备的 ITR-HFBI-DCBD-NFC样品，及(b)O. 3MNaCl 中制备的ITR-HFBI-NFC样品的TEM图像。两种样品存储为悬浮液12天。存储之后，第I样品中的粒子形态保持相同(c)，但在第2样品中，粒子开始聚集(d)。图10可视化9 (a)在2min研磨之后，及9 (b)在5min研磨之后，HFBII悬浮液中研磨的吲哚美辛纳米粒子的TEM图像。发明详述定义为本发明的目的，本文使用的“活性剂”意指在动物，植物或其他生物中具有化学或生物学活性的任何化合物。活性剂包含药物(pharmaceutical),诸如药物(drug)或药物(medicament),诊断剂，或营养物，由此食品或饲料成分，化妆品及对照物质，诸如除草剂和杀虫剂。尤其适合于本发明的粒子的活性剂是对它们的环境具有非常低溶解度的化合物，诸如含水系统中，诸如哺乳动物，优选人代谢中的疏水化合物。此情况中的低溶解度通常在lmg/ml以下或100 μ g/ml以下。术语"疏水蛋白"在本文实质多肽在活跃的蛋白之内具有与极性和非-极性化合物的偏倚的亲和性的特征。"疏水蛋白"是一组蛋白，其至今仅见于丝状真菌，在其中它们似乎是普遍存在的。它们是分泌的蛋白，在一些情况中作为单体见于培养基，及迁移到界面，在那里它们自组装而形成薄表面层。本文术语"多肽"意指2个或更多氨基酸通过肽键接合在一起的序列。通过定义，全部蛋白是多肽。本文使用的术语多肽指肽和/或多肽和/或蛋白。在本文"载体"指可结合偶联于疏水蛋白的功能部分的基质。优选通过被疏水蛋
白衍生物包被的活性剂核心形成的复合物，其结合到具有偶联于所述疏水蛋白的功能部分的载体，给出辅助所述粒子的加工及存储的所述复合特征的本体。载体可选自单糖，葡萄糖，甘露糖，二糖，诸如乳糖，寡糖，多糖，诸如淀粉，纤维素或其衍生物。术语"药学可接受的载体或佐剂"指称可作为制剂随本发明的粒子一起施用于患者的，且当以足以递送治疗性量的活性剂的剂量施用时不毁坏其药理学活性及非毒性的载体或佐剂。一般而言，通过均匀及密切地关联活性成分与液体载体或精致地分的固体载体或二者，然后如果必需塑形产物来制备制剂。术语"药学可接受的填料"指称可与本发明的活性剂一起合并入粒子核心的填料。有利地，其通过改善处理，生物利用度，持续的或受控释放来贡献于活性剂的药理学特征。药学可接受的填料指在药学实践中用作填料的该本体物质。因此，其主要是无任何健康风险且具有用于此功能的适当的物理性质。一列可接受的填料和它们的性质可见于各种类型的药物出版物，例如由 American Pharmaceutical Association 出版的 Handbook ofPharmaceutical Excipients。在本文中，“粒子”指称包含至少核心及覆盖至少部分所述核心的包被的固体沉淀。在本文中，“包含所述活性剂的核心”可为任何形状。如果根据本发明的沉淀方法产生，核心具有向最小化的表面积的趋势，由此典型是基本上球形或球形-样，诸如卵圆形形状的粒子。当看粒子的进一步处理和制剂时，该形态也是优选的。但是，研磨方法产生更多有角形。优选所述核心包含作为至少部分晶体固体的活性剂，尽管无定形固体也存在。根据本发明的一实施方式的包含粒子的产品可描述为球形粒子的本体。所述粒子具有核心，其包含至少一种活性剂，其优选疏水。核心包被用疏水蛋白，使它们的疏水残基移向核心和亲水体远离核心和移向亲水环境或基质。在优选的实施方式中，粒子是球形且被疏水蛋白连续包被。当疏水蛋白彼此紧密相邻时，它们形成围绕核心，优选包裹核心的涂覆层，及形成粒子的均一的表面。任选地，可用结合于疏水蛋白的官能部分形成第2层。再者，所述第2层可为非连续或均一的。在本文，“至少一个尺度的粒子”意指用于定义具有最小值的粒子的尺寸或体积的量度。换言之，如果建造本发明的粒子的3-维模型，所述最小尺度是沿着其而粒子量度是最小的轴。在立方粒子的情况中，其为各边的量度。对于立方形而言，其为最短的边的量度。在完美球的特定情况中，其为直径，其同时是通过球的最大直线距离和沿着全部轴的最小尺度。对于杆或圆柱而言，其为长度/高度的较小者和直径。对于锥而言，其为长度/高度或直径的最大值。一般而言，“粒子最小维”选自3个向量，在笛卡尔坐标中根据最大宽度投影到各3-维轴，所述向量具有I-维长度，其小于2个其他向量的。关于药学制剂，明白从粒子尺寸的意义上说，观察平均粒子维。优选地，粒子代表非常窄尺寸和/或形状分布。在一些实施方式中，通过本发明的方法获得的粒子显示高单分散性。在本文“纳米粒子”指称具有至少一个纳米尺度维的粒子。它们可为任何形状，其中至少直径，长度，边，高度，宽度，幅度等，及优选2个或最优选全部维小于O. 5 μ m。纳米尺度的粒子，由此根据本发明的实施方式的纳米粒子，具有小于I μ m的至少一个平均粒子维。优选所述粒子的全部平均粒子维小于I μ m。“官能化”或“官能化的”指称添加标记，功能残基，或具有功能的氨基酸的残基或
片段或全体序列或甚至其组合的实践。功能的例包括但不限于形成化学键，结合标签，标记物，肽，配体或肽的能力。"融合多肽或蛋白"表示含有至少2个已通过重组DNA技术组合在一起的多肽部分的多肽。融合构建优选也包含目的多肽和粘接多肽之间的接头。"目的多肽"或"预选择的多肽"表示具有期望性质或可结合任何一种或更多目的分子的任何多肽。多肽选自，但不限于抗原，抗体，酶，结构蛋白，粘着蛋白或调控蛋白。在本文中，“水介质”用于定义疏水蛋白混合入研磨方法的基质。实施方式在一实施方式中提供包含粒子的产品，所述粒子各包含活性剂及疏水蛋白，其中所述粒子具有包含至少一种活性剂的核心，该核心至少部分被疏水蛋白包被。发明人发现，该粒子提供修饰粒子沉淀物的尺寸和形态的可能性。一种有利效果旨在增加所述活性剂在溶解度一般差的环境中的溶出率。疏水蛋白包被也提供在处理及使用所述粒子期间保护免于外部株。疏水蛋白包被也提供贡献于活性剂的靶向，结合或受控释放的官能化，选择的官能性的选项。本发明的一实施方式的粒子具有小于10 μ m的平均直径。粒子具有甚至更佳特征，平均粒径小于I μ m,优选O. 5 μ m和更优选小于O. 2 μ m。优选所述粒子是基本上球形，卵形或杆-样形状。本发明的一实施方式的粒子具有小于I μ m的最小尺度。粒子大小越小，粒子的总体表面积越大，由此面积/体积比。因此，在许多应用中，粒子大小的减小有益于粒子，及可能使用它们的制剂的某些特征。为此目的，优选粒子的最小尺度小于0.5 μ m，优选小于O. 2 μ m和甚至更优选小于O. I μ m。一例是活性剂是疏水药学活性剂的情况，其中纳米粒子致使经口腔，肺部，经皮或肠胃外途径的药物递送中更高生物利用度。小粒子大小也得到增强的溶出率。疏水蛋白是小细胞外蛋白，在丝状真菌中独特和普遍存在，其介导真菌和环境之间的相互作用。它们是分泌的蛋白，在一些情况中在培养基中作为单体，及迁移到界面，在那里它们自组装而形成薄表面层，但也发现它们结合于菌丝。
疏水蛋白也特征在于它们的高表面活性。通过自裂裙菌(SchizophylIumcommune)的疏水蛋白SC3形成的层已广泛地表征,及具有变化表面疏水性从而使亲水表面疏水和疏水表面亲水的性质。SC3层通过电子显微镜检容易可视化，及特征在于其紧密包装的小棒图案，且因此常常被称为小棒层。SC3层非常稳定，及仅非常粗糙的化学品诸如纯三氟乙酸或甲酸可将其溶解。例如在十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中加热不影响层。其也显示大构象变化可相关于组装和吸附。亲水性标绘图的比较形成将疏水蛋白分为2类，I和II的基础。2类共享几个通用的性质，但似乎在一些方面诸如它们的集合物的溶解度上显著不同。然而I类集合物是高度不溶性的，II类疏水蛋白集合物及吸附的表面层似乎有时例如通过60%乙醇，SDS或通过应用压力更容易解离。对于II类疏水蛋白尚无报道小棒类型表面结构，及以许多方式，II类疏水蛋白似乎在它们的行为上欠强烈。尽管通过比较一级结构可制造类之间的区别，无可在氨基酸水平制造性质差异的解释。在疏水蛋白中，最显著的特征是在疏水蛋白-家族中仅形成保守的一级结构的8
个Cys残基的模式，而且已描述此模式未保守的疏水蛋白。疏水蛋白也可在模块组成中不同，从而它们含有不同数的重复疏水蛋白单元。另外疏水蛋白显示一级结构的显著的变化。HFBI和HFBII是自真菌瑞氏木霉(Trichodermareesei)的2种II类疏水蛋白，且相当地类似,有66%的序列同一'丨生。公开的对于I和II类疏水蛋白的数据显示类之间有功能区分，其主要似乎涉及它们的聚集物的结构和溶解度。之前未报道II类疏水蛋白的表面结合的系统性调查，但I类疏水蛋白SC3的吸附表征得详细得多。在SC3的情况中，小棒层的形成似乎是结合的必要的组分。瑞氏木霉(T. reesei) HFBI的基因的分离及表征描述于(Nakari Setala, Aro et al. 199611)和HFBII的基因的分离及表征描述于(Nakari-Setala，Aro et al. 1997m)。之前描述了哈茨木霉(T. harzianum)的srhl基因的分离。在专利FI116198中，作者公开了融合蛋白向大尺度表面的固定。融合蛋白包含融合于预选择的多肽的粘接多肽。方法利用了融合蛋白的部分的粘接多肽的自发固定性质。在一实施方式中，粘接多肽是真菌疏水蛋白。在本发明的粒子中，当要增强向亲水基质，一般向疏水化合物的水溶液的溶解度时，疏水蛋白尤其有益。增强的溶出率及优化的释放基于活性剂和疏水蛋白的性质和相互作用，且基于小粒子制剂的性质(Rabinow, 2004lv, Date和Patrivale, 2004v)。根据本发明的一实施方式，当核心是疏水性时，用疏水蛋白的包被增加向水介质的溶解度。如实验部分显示，在疏水蛋白的存在下，代替在药物处理中难操作的显著更大的针，疏水药物沉淀为基本上球形，纳米尺度粒子的聚集物。嵌入疏水蛋白的亲水体的小疏水补丁导致它们在亲水和疏水物质之间的界面自身-组装。2类疏水蛋白，HFBII的结构，作为例，表示在图2中。疏水蛋白呈现对于疏水补丁的强趋势，以结合于疏水物质。用表面活性剂，例如Tween20 ,可观察减少的晶粒大小的多少类似效应,但表面活性与疏水粒子的键合是更可反转的，导致在适合的条件下脱粘。用疏水蛋白，在核心上形成的包被对包裹的活性剂相比对应的表面活性剂是更层-样的，稳定及保护性的。不像表面活性分子，疏水蛋白层可转移及紧密结合于基材。疏水蛋白形成围绕活性剂核心的立体保护层。使疏水蛋白特别感兴趣的另一性质是如界面单层细胞形成的蛋白之间的强侧相互作用。此增加悬浮液稳定性。疏水蛋白可为天然存在的野生型蛋白或化学或遗传修饰的和/或官能化的蛋白。适合于本发明的粒子的疏水蛋白优选选自I类和II类疏水蛋白。知道的疏水蛋白包括但不局限于HFBI，HFBII, SRHI和SC3或其衍生物。当选择疏水蛋白时，可开发I类和II类集合物之间的差异，以达到期望的性质。I类是高度不溶性的，II类疏水蛋白集合物及吸附的表面层似乎有时更容易解离。对于II类疏水蛋白，尚无小棒类型表面结构的报道，且以许多方式，II类疏水蛋白似乎在它们的行为上欠强烈。不受理论的束缚，II类疏水蛋白呈现为更适合于本发明的应用，其中高不溶解性可甚至是阻碍。疏水蛋白提供作为包被化合物的特定优势。产生作为融合蛋白的疏水蛋白的可能性可用于表面包括纳米粒子的表面的官能化。例如，可产生与抗体及疏水蛋白的融合蛋白。使用该融合蛋白，可使抗体官能性位于疏水蛋白-包被的粒子表面。由此融合蛋白官能性可用于将纳米粒子靶向特定位置或靶向表面官能化粒子，用于通过将其他组分结合到粒子表面而更佳或特别控制的稳定性。该官能化的一例是应用疏水蛋白与纤维素结合结构域的融合蛋白来包被活跃的药学制剂核心。将由此获得的粒子与纳米纤维纤维素溶液混合，其导致粒子与纤维素纤维的附接(图8a中的TEM图像)。所述粒子被证明在存储期间意外地耐久及稳定。由此就制造持久的和容易操作药物纳米粒子制剂展示了此方法的可行性。显著地增加的稳定性/存储时间对于处理纳米粒子确定改善。可能II类疏水蛋白尤其良好适合于描述的发明。II类疏水蛋白相比I类成员更容易产生。此外，II类相比I类欠倾向于不可逆地聚集，使它们更容易使用及操作。此外，已产生的多数融合蛋白已与II类疏水蛋白制造，因为更适合的产生方法。本发明之内，组合2种或更多不同疏水蛋白来提供本发明的粒子的期望的特征也可有用。甚至可在一个粒子中组合官能化的及非官能化的疏水蛋白。优选疏水蛋白是分离的天然蛋白。该疏水蛋白具有它们是天然的组件，由此不包括人工内容物的优势。除了野生型疏水蛋白之外，当可接受时，可使用突变体，只要它们保留疏水蛋白的表面活性-样特征。该突变体可提供这样的特征，在某些应用中，相比天然疏水蛋白呈现更佳性能，诸如对株，温度变化，PH，等的更佳抗性，可优选的尺寸或结构，对有效产生的适应性，更容易恢复，等。通常知道的，在活跃的和操作酶之中，变异在序列水平发生。本发明也意指覆盖可被认为是HFBI，HFBII，SRHI，SC3的衍生物，由此HFBI样，HFBII样，SRHI样，SC3样的多肽，其具有描述的性质及包含氨基酸序列，其与提及的多肽，由此HFBI，HFBII, SRHI, SC3在氨基酸序列水平分别具有至少40%，优选至少50%，更优选至少60%，仍更优选至少70%同源性。甚至更优选是涵盖的多肽，其包含氨基酸序列，其与提及的多肽在氨基酸序列水平具有至少80 %，最优选至少90 %的同源性。除了野生型疏水蛋白之外，可使用嵌合融合蛋白，只要它们保留疏水蛋白的特征，即键合到疏水表面的能力。根据本发明的粒子的一实施方式，疏水蛋白经官能化。官能化的粒子还可用于靶向或受控释放目的。疏水蛋白，II类成员由于产生融合蛋白的可能性而对于生物技术应用尤其有用。在融合蛋白中，编码疏水蛋白的基因连接到另一目的肽/酶。该融合蛋白已用于应用，诸如纯化，固定。其他应用也用于构建纳米结构的组件或用于将特定酶促活性导向界面(Kostiainen,等人，200vl, Kurppa,等人，200v11, Linder,等人，2002v111, Linder,等人，2004ix)。疏水蛋白的官能化可用于改善粒子及包被的性能。疏水蛋白可通过使用野生型疏水蛋白上的反应性基团诸如胺或羧基来化学修饰。反应物诸如马来酰亚胺或EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)通常用于该反应。疏水蛋白也可如[I]中描述遗传修饰为允许该反应更容易发生。也可通过制造融合蛋白来制造疏水蛋白的官能化。官能化可允许粒子靶向结合外部基质，诸如纤维素纤维，多孔或非-多孔硅，或制造具有可控制的稳定性的粒子。此可通过例如多层结构实现。在进一步延伸中，具有官能化的亲水侧的HFB可用于给这些粒子提供功能表面。此会在需要靶向，增加的循环时间和其他受控释放方法时有用。此方法的可行性在实施例2和3中展示。此外，本发明的粒子给官能团或多肽的高面积/体积比，如果需要来增加，例如，粒子的容量或活性。根据本发明，也可能产生具有期望的特定活性的官能性。此可通过采用特定量的包含功能部分的融合多肽，与特定量的游离疏水蛋白一起来达到。在本发明的优选的实施方式中，所述活性剂是药学制剂。更优选所述药学制剂是疏水化合物。本发明的粒子具有提供增加药物的生物利用度的非常小粒子大小的优势。优选药学制剂是小-分子化合物。其他适合的药物的例是基于基因的医学或治疗性肽。粒子优选包含一种活性剂。但是，在一些实施方式中，具有2种或甚至更多形成用疏水蛋白包被的核心的活性剂是有益的。分别，核心中具有其他组分是可能的，可能贡献于形成的粒子的其他特征，诸如药学可接受的填料。根据本发明的一实施方式，在本发明的粒子中，核心还包含药学可接受的填料。可将所述填料与活性剂一起合入粒子核心。包含所述填料的核心可独立地制备或它们可在本发明的方法期间形成。它们可例如伴随活性剂溶解于水混溶性溶剂，然后自与疏水蛋白合并的溶液沉淀。在疏水活性剂的情况中，所述填料优选也疏水。根据本发明的一实施方式，提供的制剂包含实施方式I的粒子和药学可接受的载体，稀释剂或赋形剂。制剂包括适合于口腔，直肠，鼻，局部(包括经皮，颊和舌下)，阴道或肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内，真皮内及玻璃体内)施用的那些。制剂可便利地呈现为单元剂型，和可通过药学领域熟知的任何方法制备。包含描述的含有活性剂的粒子的最终产物可依赖于选择的施用途径为胶体悬浮液，片剂，胶囊，乳剂，干粉，凝胶，气雾剂或一些其他药学制剂形式。该方法代表本发明的进一步特征，且包括使粒子与构成一种或更多附属成分的载体的关联的步骤。一般而言，制剂通过均匀及密切地使粒子与液体载体或精致地分开的固体载体或二者关联，然后如果必需整形产物来制备。在另一优选的实施方式中，所述活性剂是食品或饲料成分。食品中活性成分和香料的包裹被视为食品工业中纳米技术的潜在用途。包裹可控制活性成分或香料的生物利用度和稳定性。该包裹面对可通过自组装产生。食品的纳米尺度结构化也被视为改善食品质地的可能性(Groves, 2008)x。
本发明的另一方面是使用疏水蛋白制备低-溶解度活性剂粒子的方法。通过在疏水蛋白的存在下沉淀水中的疏水活性剂来制备粒子。此导致被疏水蛋白包被的固体活性剂核心的形成。换言之，蛋白然后围绕核心自组装和形成防止核心聚集的立体保护性层。更特别是，为产生包含活性剂及疏水蛋白的粒子，所述粒子具有至少一个小于I μ m的维；本发明的方法包括下列步骤(i)将所述疏水蛋白溶解于水，(ii)将所述活性剂溶解于水混溶性有机溶剂，(iii)搅拌着合并步骤i及ii的溶液，以及(iv)自合并的溶液收集形成的粒子。如在任何沉淀中，必需对待沉淀的物质优化反应条件。但是,实验研究显示,冷却反应混合物是有益的。如果在室温中进行反应，产生的粒子常常是几Pm尺度。必需达到大过饱和以获得可能的最同质和小纳米粒子。将药物溶解在以相比溶于水高得多的浓度溶解药物的水混溶性溶剂中是此前提。溶剂的选择因此是关键的和必需选择，从而可达到2相之间的大浓度差异。必要的特征是疏水蛋白的存在。疏水蛋白的优选质量是活性剂质量的10和100w-%之间。用此方法，获得的粒子具有小于I μ m的最小尺度。优选地，所述水混溶性有机溶剂选自甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，乙腈，四氢呋喃(THF)，二甲基亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)或I，4- 二噁烷。此方法之内，引导至少一些疏水蛋白经官能化的包被是可能的。另一产生包含活性剂及疏水蛋白的粒子的方法，所述粒子具有至少一个小于I μ m的平均尺度，包括下列步骤(a)将所述活性剂在包含疏水蛋白的水介质中研磨，(b)自水介质收集形成的粒子。再次，此方法也允许至少一些疏水蛋白经官能化的粒子的形成。在本发明中，也提供疏水蛋白作为用于包含疏水活性剂的核心的包被剂的用途。优选所述活性剂是营养物或药学制剂。一般而言，发明人现在已公开疏水蛋白用于药物制备的用途。根据本公开，提供以下实施例来作为证据支持观察到的作为本发明的优势的效应，但不旨在限制范围。实施例实施例Ia:沉淀处理通过修饰早先出版的方法来进行倍氯米松的沉淀，其中药物在纯水中或在表面活性剂,Tween-80 的存在下结晶化(Wang et al. 200xi，Matteucci 等人，2006xii)。通过将 BDP溶解于甲醇来制备34. 8mM 二丙酸倍氯米松(BDB，丽521. I)溶液。将O. 5ml的BDP溶液投入20ml的具有O O. 15wt-% (O 208. 3 μ Μ)HFBII的纯去离子水中。得到的水溶液具有O. 05wt-% BDP0将两种溶液用O. 2 μ m注射器式滤器过滤，以在使用之前去除可能的杂质。将接收液体用磁搅拌器剧烈搅拌，和在沉淀期间通过在冰浴或在室温中保持样品来控制溶液温度。在BDP添加之后立即作为混浊溶液观察沉淀物。透射电子显微镜(TEM):沉淀之后20min，将20 μ I的纳米粒子分散物在具有筛目尺寸300的聚乙烯醇缩甲醛膜-包被的铜网格上干燥。
HFBII浓度对粒子大小的效应当不用HFBII沉淀BDP时，形成的结晶是小μ m长的针1(1。当将HFBII用作稳定剂时，粒子大小减小到200nm以下和结晶的杆-样习性转化为球形(图3)。测定对于用BDP沉淀的HFBII的最佳浓度。在O. 008Wt-%以下的HFBII浓度中，形成针-样结晶及其以上达到圆-形纳米粒子。增加稳定剂浓度在最佳浓度以上不略微降低粒子大小。形成纳米粒子需要的HFB的最小量小于BDP质量的20%。温度对粒子大小的效应通过比较于室温和在冰-浴中进行的合成批的粒子大小来研究温度对粒子大小的效应。在更高温度，相比低温制备，粒子大小从200nm增加到几μπι(图4)。粒子形态也改变。冰-浴中制备的粒子是球形，然而于室温制备的粒子是杆-样及模拟更多本体结晶化的BDP。甚至增加用于合成的HFBII的量不足以产生纳米粒子。甲醇含量对粒子大小的效应甲醇量也是获得BDP纳米粒子中的关键参数。如果合成溶液中甲醇的量倍增，甚至用更高量的HFBII不可获得纳米粒子，且结晶再次模拟本体物质的那些。用降低量的甲醇产生的粒子与图3中显示的纳米粒子具有大约相同的尺寸和形态。实施例Ib:高度单分散伊曲康唑纳米粒子的产生如在早先部分进行合成，除了使用的药物是伊曲康唑之外。测试HFBII :伊曲康唑的2 : 1，1 : I和I : 2的质量比。TEM用于研究粒子的尺寸和形态。图像(例如图5)显示可达到70和90nm之间的高度单分散药物纳米粒子的产生。单分散性随着增加HFBII量而增加。粒子是球形和良好分散的，即不可见大粒子聚集物具有I : 2质量比。用HFBI和HFBI-DCBD融合蛋白，如用HFBII，粒子具有类似形态。伊曲康唑粒子相比倍氯米松粒子同质得多。由于方法依赖于蛋白的两性性质，似乎其用更疏水物质工作更佳。实施例2:用绿色荧光蛋白标记HFB包被的药物纳米粒子xiii以与用其他纳米粒子相同的方式进行GFP-HFBI标记的纳米粒子的合成，除了一部分HFBII用GFP-HFBI融合蛋白部分取代之外。在合成之前，将2种蛋白以I : 3比(GFP-HFBI =HFBII)溶于纯去离子水。全部其他步骤保持相同。此导致绿色紊流溶液。通过将GFP-HFBI添加到含有BDP微粒的溶液来在合成之后进行微粒的GFP标记。合成本身是自甲醇到水的BDP的简单沉淀。图6显示此实验中产生的粒子的荧光显微镜图像。微粒明显是荧光和纳米粒子，其用光学显微镜几乎非-可检测，而在荧光模式下可检测。此展示所提供的在疏水蛋白融合蛋白的辅助下产生官能化的纳米粒子的方法的可行性。实施例3:用Au-纳米粒子(在ACS Nano，4 (3) 20101750-1758中描述)标记BDP纳米粒子通过Kimura方法产生巯基琥拍酸(MSA)包被的Au纳米粒子(Kimura, K.；Takashima,S. ；Ohshima,H. Molecular Approach to the Surface Potential Estimate ofThiolate-Modified Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. B 2002，29，7260-7266)。在产生BDP-HFBII纳米粒子之后，通过将10 μ的0. 355mg/mlMSA-Au粒子-溶液简单添加到20 μ I的BDP-HFBII粒子悬浮液中来进行由MSA-Au纳米粒子的标记。在取TEM的样品之前使悬浮液静置I小时(图7)。将粒子用金纳米粒子明显包被。样品中无论何处不可见Au-MSA粒子。此展示所提供的以推测及定位目的产生金属纳米粒子包被的纳米粒子的方法的可行性。实施例4:药物纳米粒子与纤维素基质的结合将HFBI，HFBII或与纤维素结合结构域的HFBI融合蛋白(HFBI-DCBD)溶于水(0.6mg/ml)。将溶液超声处理及放置在冰浴中。通过将ITR溶解到THF中来制备伊曲康唑溶液(12mg/ml，17mM)。过滤溶液以移出可能的粉末残留物。将O. 25ml的ITR溶液快速添加到5ml的疏水蛋白溶液中。将接收液体用磁搅拌器剧烈搅拌，和通过将样品保持在冰浴中来控制溶液温度。在ITR添加之后立即作为混浊溶液观察白色沉淀，指示纳米粒子的形成。将溶液搅拌20min。通过将NHF凝胶稀释到8. 4mg/ml的浓度来制备纳米纤维纤维素溶液。在使用之前立即将溶液超声处理。将O. 71ml的NFC溶液加入纳米粒子悬浮液。此导致粒子与纤维素纤维的附接(图8a中的TEM图像)。纤维素/HFB/纳米粒子复合物非常稳定，且在I个月之内不显示降解(图Sb)。用BDP纳米粒子进行相同处理，其也显示增加的稳定性。BDP纳米粒子在溶液中已在24h之内聚集，和更稳定的ITR纳米粒子在5天之内聚集。它们也可无降解地经历物理处理，诸如离心，过滤及干燥。全部这些处理会正常导致BDP纳米粒子的强聚集。此展示此制造持久的和容易操作的药物纳米粒子制剂的方法的可行性。巨大地增加的稳定性/存储时间是纳米粒子处理的确定的改善。甚至可将HFBI包被的药物纳米粒子附接于NFC。但ITR纳米粒子与纳米纤维的结合可通过使用HFBI-DCBD代替HFBI来改善。HFBI包被的粒子与纤维素的附接是由于非特异性静电相互作用和纤维素基质之内的位阻，然而在DCBD的情况中，相互作用是特定的和应不依赖于静电学。因此，为了见2种包被之间的差异，通过在附接期间将O. 3M NaCl添加到溶液来筛选静电负荷。在合成之后立即，粒子的结合似乎甚至在此情况中等同良好，尽管在HFBI样品中有一些特有的起波的膜，其在DVBD样品中未曾见到(图9，其中(a)及(c)显示分别在t =和t = 12天以O. 3M NaCl制备的ITR-HFBI-DCBD-NFC样品；(b)和(d)显示分别在t = O和t = 12天以O. 3MNaCl制备的ITR-HFBI-NFC样品。第I样品中的粒子形态保持相同(c)，但在第2样品中，无纤维素结合结构域的粒子开始聚集(d))。HFBI-DCDB包被的粒子保持完整，但HFBI包被的离子在12天之后已可视地聚集(图9)。此展示可通过在粒子包被中使用融合蛋白代替标准非官能化的疏水蛋白获得额外的益处。实施例5:研磨过程在行星球磨机(Fritsch Pulverisette 7 Premium line)中在水介质中进行活性剂吲哚美辛的介质研磨。将Ig的吲哚美辛加入IOml的含2wt-% HFBII的纯去离子水中。研磨容器由ZrO2制造，并将70g的ZrO2研磨珠(d = Imm)用于研磨药物物质。将容器在使用之前在冰箱中冷却到约10°C，以便最小化研磨期间过高的温度。以IlOOrpm进行研磨2+3分钟，使研磨容器在研磨运行之间在冰箱中冷却lOmin。此产生非常厚的白泡沫。自泡沫直接收集TEM样品。TEM图像(图6)显示，用所述方法可达到500nm以下的粒子大小。在HFBII悬浮液中，在2分钟磨碎之后平均粒子大小是I μ m以下(图6 (a))和在5分钟研磨之后平均粒子大小是500nm以下(图6 (b))。实施例6:对溶出率的效应自更小粒子的溶出率总是更快。因此，预期自ITR+HFB纳米粒子的药物释放速度会相比自原药物粉更快。用结合于NFC的粒子做的测试也显示，当用一些药学接受的糖赋形剂冷冻干燥时，此性质可甚至在药物纳米粒子装载的纤维素基质的情况中保存(图I)。由于纤维素是药物片剂的主要成分之一，此可更容易制造这些纳米粒子的药学制剂。例如，ITR+HFBI-DCBD纳米粒子可首先结合于纤维素，然后用简单糖添加剂冷冻干燥。然后可将粉末直接压缩进具有相比用纯ITR粉制造的类似片剂快得多的溶解特征的片剂，代替疏水蛋白包被的纳米粒子。纯伊曲康唑和装载进纳米纤维纤维素基质的伊曲康唑纳米粒子的溶出率在图I中可视化。将装载的样品用海藻糖(TRE)或赤藓糖醇(ERY)冷冻干燥，以在干燥过程中保存纳米结构。相比自纯药物粉，自纤维素基质显著更快溶解。KC和NFC指称不同级的纳米纤维纤维素。参考文献1 Hakanpaa, J.，Paananen, A.，Askolin, S.，Nakari- Setala9 τ.，Parkkinen，T.，Penttila9 M. ，Linder，Μ. 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权利要求
1.固体粒子产品，各粒子在疏水核心包含活性剤，其核心至少部分被疏水蛋白包被。
2.权利要求I的产品，其中所述粒子是纳米粒子。
3.权利要求I的产品，其中所述粒子基本上是球形。
4.权利要求I或2的产品，其中所述疏水蛋白选自I类和II类疏水蛋白。
5.前述权利要求中任一项的产品，其中所述疏水蛋白选自HFBI，HFBII和SRIH或其衍生物。
6.权利要求5的产品，其中所述疏水蛋白是HFBII。
7.权利要求I 6中任一项的产品，其中所述疏水蛋白经官能化。
8.权利要求I 7中任一项的产品，其平均粒径小于IU m,优选0. 5 ii m和更优选小于0. 2 u m0
9.权利要求I的产品，其中所述核心包含第二和任选另外的活性剤。
10.权利要求I的产品，其中所述包被包含第二和任选另外的疏水蛋白。
11.权利要求中任一项的产品，其中所述活性剂是药学活性剤。
12.权利要求13的产品，其中所述核心还包含药学可接受的填料。
13.权利要求I 12中任一项的产品，其中所述活性剂是食品或饲料活性成分。
14.制剂，其包含权利要求I 13中任ー项的固体粒子产品和载体或佐剂。
15.权利要求14的制剂，其中载体或佐剂是药学可接受的载体或佐剂。
16.产生包含活性剂及疏水蛋白的粒子的方法，所述粒子具有至少ー个小于IU m的平均尺度，其中 (i)将所述疏水蛋白溶于水， (ii)将所述活性剂溶于水混溶性有机溶剤， (iii)搅拌着合并步骤i及ii的溶液，以及 (iv)自合并的溶液收集沉淀的粒子。
17.权利要求16的方法，其中所述水混溶性有机溶剂选自甲醇，こ醇，丙醇，丙酮，乙腈，四氢呋喃(THF)，ニ甲基亚砜(DMSO)，ニ甲基甲酰胺(DMF)或1，4_ ニ噁烷。
18.权利要求16或17的方法，其中至少步骤iii及任选地步骤i，ii和/或iv在冰浴中进行。
19.产生包含活性剂及疏水蛋白的粒子的方法，所述粒子具有至少ー个小于Ium的平均尺度，其中 (a)将所述活性剂在包含疏水蛋白的水介质中研磨， (b)自水介质收集形成的粒子。
20.权利要求16或19的方法，其中疏水蛋白经官能化。
21.疏水蛋白作为用于包含疏水活性剂的核心的包被剂的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述活性剂是药学活性剤。
全文摘要
在药物或其营养施用领域，提供新粒子和制剂。所述粒子各具有包含活性剂的核心和至少部分包含蛋白的包被，选自疏水蛋白。可优选的疏水蛋属于I类或II类。所述粒子呈现增强的特征，例如分散性或溶解度。本文也公开了2种产生所述纳米尺度的粒子的方法，其中，一种利用沉淀，及另一种利用湿研磨。
文档编号B01J2/30GK102802669SQ201080025973
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者P·拉克松恩, M·林德尔, T·拉克松恩, H·维罗, J·希尔凡恩 申请人:国家技术研究中心Vtt