复合液体池的制作方法

专利名称：复合液体池的制作方法
复合液体池
相关申请的交叉引用 本申请要求于2010年7月22日提交的美国临时申请顺序号61/344，434,2011年4月I日提交的61/470，515和2011年4月I日提交的61/470，520的权益，所述申请各自通过引用结合到本文中。
背景 目前对生化样品的处理有许多关键性缺陷。这些包括体积大小一导致高的试剂成本；高的消耗成本；和劳动强度高的方案和过程，这些非常容易交叉污染。因为这些原因，目前无法保证在生化过程中对每个样品的完全控制和隔离。
对于多个生化过程的应用一序列珠制备、焦磷酸测序、核酸连接和聚合酶链式反应一和不限于此，体积大小、化学成本、劳动力成本和反应效率的局限是明显的。
序列珠制备是在应用-特定的化学中将小珠包被的过程。例如在DNA复制中，珠子先用DNA引物包被，然后是扩增过程。甚至对于今天的现有技术的测序仪而言，需要相对高的局部浓度的靶分子，以准确测序。目前对典型方案的评价估计，仅80%经处理的珠子被充分包被，以确保准确测序。因此为了确保相对高浓度的靶样品，必须使用大量珠子，以达到统计学准确性。此外，均勻包被的(even coated)珠子从一个孔向另一个转移,都不可避免地导致珠子和悬浮流体的损失。这是目前移液和液体处理系统中固有的死体积和无效性的结果。该生化过程通常是在96孔或384孔静态孔板中进行，其通常的体积范围为10微升至200微升。
另一生化过程，焦磷酸测序，将相当高浓度的核酸与引物-包被的珠混合。核酸附着在珠子上并形成纯系群体(clonal colony) 0然后再用基于乳液的PCR将其扩增。测序仪器含有大量皮升-体积的孔，这对于单个珠子连同测序所需的相关酶而言足够大。焦磷酸测序使用萤光素酶来发光作为读出(readout)，并且测序仪器对于每个添加的核苷酸都为孔拍照。该过程中的一个关键问题是珠子被引物有效包被。使用现有技术，一定百分比的珠子并未被引物化学适当地包被，导致较差的反应效率。使用目前的技术来改进珠子的包被效率，将需要试剂成本的不可持续的增加。
在核酸连接中，也出现类似的生化过程的问题。核酸连接在现代分子生物学研究中已经成为重要工具，用于产生重组核酸序列。例如，将核酸连接酶与限制酶一起使用，将核酸片段，通常是基因，插入到质粒中，用于遗传工程。核酸连接是分子生物学中相对常用的技术，其中可通过一种称为连接酶的酶的作用，在特定温度通常16 - 25。C(取决于所用的方案)下，将短链DNA连接在一起。为了将两条以上的短DNA链序列连接在一起，例如在合成遗传序列的构建中，可以将所有DNA链混合，再进行连接。这将会产生随机序列，其中一条链的末端将与错误链的起始端连接。这种错误序列，或方向，在合成构建的基因(其中遗传密码的顺序至关重要)中是不想要的。为了正确进行该技术，必须先将相邻序列的配对组合连接起来，以得到正确方向。再将这些配对合成的构建体以正确方向连接，得到甚至更长的合成构建体。该过程涉及大量而复杂的化学过程和操作。这是非常耗费人力的过程，如果用现有的液体处理，并且导致大的消耗成本，还要遭受静态孔板和移液管吸取的已知的死体积损失。另外，使用现有的液体处理技术，小体积的混合和控制受限于相对小体积的吸取和操作的能力。核酸连接中所用的典型体积是10 - 200微升，且核酸链长介于50-200个碱基对。聚合酶链式反应(PCR)已广泛用于扩增目标DNA和cDNA，用于分子生物学的多种应用。PCR技术扩增单一拷贝或少数拷贝的一段DNA，得到数千至数十亿拷贝的特定DNA序列。现代PCR仪器进行PCR过程的反应体积范围为10 - 200微升。在小体积中进行PCR的最大障碍之一是难以用手工移液管来操作小体积的组成试剂。大的体积量是现有技术在分配和混合亚纳升体积中性能不佳的直接结果。此外，对于基于流动系统的下一代微流体技术而言，这些依然受限于所分配的起始体积与生化过程所需的实际样品量。这些微流体系统在生化过程期间也受限于确定的样品方案控制。这些系统通常依赖于微量规模的流体通道网络，以转运和混合亚微升体积。这些技术的一些主要缺陷在于:微流体卡(miciOfluidiccard)的单次使用，为了防止污染；缺乏对各单个样品的动态控制，在生化过程的任意点转运和混合任何单个样品；和系统的密闭结构。具体地讲，数字聚合酶链式反应(DigitalPolymerase Chain Reaction, dPCR)的现有方法是这样进行的:通过将起始样品分为多个更小体积的样品，直到每个亚体积中只留下一个DNA模板。对含有DNA的阳性亚体积进行计数，就可求出原体积中的起始拷贝数。通常，这包括多个系列稀释步骤，得到在每份反应体积中具有在统计学上的一个DNA靶的样品体积。在统计学上，可测试总体积的一个亚组，以测定起始拷贝数，从而允许减少PCR反应总数。然而对于稀有靶标检测，需要测试更大的体积亚组，以提高统计学准确性。这导致更大数量的空白体积和更大的测试体积，导致使用更多的化学品、时间、仪器、样品处理和处理步骤。dPCR的另一方法是在油基载体中产生测试体积的乳液。该方法试图减少为得到结果所需的仪器数量和为得到结果所需要的时间。首先，将靶样品在载体油中稀释并乳化成足够小的体积，其统计学分布是每一滴小于一个拷贝。然后还可将这种较大体积作为单一样品体积来处理并使用PCR方案进行加工处理。然而该方法通常限制在终点检测。需要流式细胞仪形式的更多仪器，从而能够测定流过传感器的每一液滴中靶的存在情况。流式细胞仪是低速；昂贵的；可需要特定流体介质并且仅允许终点检测。终点检测的限制包括需要后续处理步骤；较低灵敏度；更长时间才能得到结果；特异性和更多的仪器。基于乳液的PCR方法的另一个挑战是所需稳定性和对每一滴的控制。液滴的合并或碎裂给处理过程带来更多的统计误差。现今的移液和液体处理系统不能处理100%的给定起始体积。对于移液，液体储存系统(静态孔板)和系统内的机械致动都能阻碍对样品的完全吸取。这种损失或在静态板中的死体积是由表面润湿性质和几何学所致，两者均是现有技术无法解决的。在流动系统中，在生化过程期间或结束时对单个生物样品的收集，对于现有技术证明是非常具有挑战性的。典型的连续流动系统由泵和贮器组成，这通常使得容易的临界流体的取回(尤其是在微量规模上)，变得技术上困难的。另外，在流动系统内，系统的最初启动是耗时而昂贵的，并且如果做得不正确，就会导致灾难性的测试失败，需要重新测试生物样品。现有生化过程的另一个缺陷就是对于纳升和亚纳升体积不能自动化地进行生化过程。各单个样品的转运、混合或取回不能通过现有自动化技术来进行。在更一般的化学处理例如需要操作少量流体的普通微量化学中，可以清楚地看到现有技术在废流体体积残留在静态孔板或系统之中的局限。这是现有技术缺乏分配和控制今后复杂的分子生物学技术所需的更小体积的能力的结果，并且需要改进效率。因此，本发明涉及提供改进的样品处理，以克服以上问题的至少一些。概述
公开了制造和处理复合液体池(composite liquid cell)的装置、系统和方法。附图简述


图1A和图1B示意性地说明使用静电力的复合液体池的产生。图2A和图2B示意性地说明使用疏水作用的复合液体池的产生。图3A和图3B示意性地说明使用定向空气控制的复合液体池的产生。图4A-4F示意性地说明使用控制管和可变流向的复合液体池的产生；
图5示意性地说明使用静电力的复合液体池的控制。图6A-6C示意性地说明使用疏水作用的复合液体池的控制。图7示意性地说明使用定向空气控制的复合液体池的控制。图8示意性地说明锚定复合液体池的静态控制突出物(spur)。图9A和图9B示意性地说明使用静电力的沿静态疏水性控制表面的生化连续流动处理的转运机制。图10A-10F示意性地说明使用控制管和可变流向的本发明的多样品复合液体池的产生。图11A-11C示意性地说明使用静电力的多样品复合液体池的产生。图12A和图12B是照片，显示多样品复合液体池。图13A-13C示意性地说明使用表面张力的多样品复合液体池的产生。图14A和图14B示意性地说明使用机械搅拌的多样品复合液体池的产生。图15A和图15B是基于乳液的多样品复合液体池的照片。图16是具有多个内部样品靶的多样品复合液体池的照片。图17A和图17B示意性地说明使用定向空气控制的多样品复合池的产生。图18A-18C示意性地说明使用疏水作用的多样品复合液体池的控制。图19A和图19B示意性地说明使用具有稳定部件(feature)的疏水性控制表面的多样品复合池转运。图20示意性地说明使用静电力的多样品复合液体池的控制。图21示意性地说明使用定向空气控制的多样品复合液体池的控制。图22示意性地说明锚定多样品复合液体池的静态控制突出物。图23是带有中央控制体积(用于排列复合液体池的原始样品)的多样品复合液体池的照片。图24A-24D示意性地说明复合液体池的单元疏水性稳定部件。图25A-2 示意性地说明复合液体池的多种不同疏水性稳定部件形状。图26示意性地说明单个复合液体池的2个疏水性稳定部件。图27A-27B示意性地说明使用控制管和可变流向，复合液体池在沿着具有稳定部件的疏水性杆(spar)的离散的位置上的定位。图28示意性地说明一系列疏水性稳定部件。图29示意性地说明使用具有稳定部件的疏水性控制表面，复合液体池的转运机制。图30A和图30B示意性地说明使用疏水性稳定部件，一系列复合液体池的转运机制。图31是说明单个复合液体池网络的图示。图32A-32F是说明复合流体网络内的复合液体池的转运方法的图示。图33A-33E是说明复合流体网络内的复合液体池的混合过程的图示。图34A和34B是显示复合流体网络内的2个复合液体池的合并的照片。图35A-35C是显示复合流体网络内的2个复合液体池合并以产生多样品复合液体池的照片。图36A-36E示意性地说明复合流体网络内的复合液体池的混合过程，以产生多样品复合液体池。图37A-37C示意性地说明以2个阶段合并4个复合液体池的复合流体网络。图38A-38G示意性地说明以5个阶段合并32个复合液体池的复合流体网络。图39示意性地说明等温核酸扩增的复合液体池仪器。图40示意性地说明盘状疏水性平台上的一系列稳定部件。图40A显示示例性的使用盘状平台的系统。图41A-41D是说明复合流体网络产生的图示。图42A-42D是说明疏水性控制表面的图示，用于不混溶的缓冲封装流体路径控制(immiscible buffer encapsulating fluid path control)。图43-47说明可作为控制器编程来执行的多种方法。详述
本发明在一些实施方案中提供用于在不混溶的流体池中和位于互不混溶载体流体的自由表面上产生生物样品的系统和方法。这包括在这样的复合液体池(同义词为“复合流体池”)内和位于不混溶的载体流体上产生、和/或位置控制、和/或运动控制、和/或混合、和/或处理生物样品。生物样品密度通常介于载体流体和复合液体池的外部流体的密度之间。载体流体的密度通常高于复合液体池的外部流体的密度。所涉及流体的典型密度值范围:载体流体为1，300至2，000 kg/m3,不混溶的流体池为700至990 kg/m3,生物样品为900至1200 kg/m3。这样一组操作液体和密度的实例在本文中有概述但不限于此；载体流体是Fluorinert FC-40 (氟代烃油(fIuorocarbonatedoil))，密度大约1，900 kg/m3 ;复合液体池的外部流体是苯甲基聚硅氧烷(硅油)，密度大约920 kg/m3 ;生物样品是PCR试剂的水性基溶液，密度大约1000 kg/m3。在另一个实施方案中，载体流体是全氟化胺油(perfluorinated amine oil)。在另一个实施方案中，所述封装流体(encapsulating fluid)是基于苯甲基聚娃氧烷的油和聚山梨酯添加剂的溶液。所述添加剂的亲水性-亲脂性平衡数值范围为2-8。添加剂的组合总亲水性-亲脂性平衡数值范围为2-8。聚山梨酯添加剂的实例是司盘80、司盘65和吐温20，但不限于此。缓冲封装流体内的这些添加剂的范围介于0.001%和10%之间。在另一个实施方案中，靶样品是在水性介质中的固体颗粒悬液，封装流体是基于苯甲基聚硅氧烷的油，在为基于氟代烃的油的载体流体上。在另一个实施方案中，靶样品是基于苯甲基聚硅氧烷的油中的水性介质，封装流体是基于苯甲基聚硅氧烷的油，在为基于氟代烃的油的载体流体上。在一些实施方案中,控制表面是疏水性材料。用于制造和操作复合液体池的系统通常包括处于控制器(例如可编程的计算机)控制之下的液体处理系统。通常对控制器编程，以使液体处理系统进行各种步骤，其程序步骤储存在非暂时的计算机可读的介质中。产牛复合液体池
参考图1A，使用控制表面4，可混合位于互不混溶的载体流体3的自由表面上的生物样品I和互不混溶的流体池2。在一个实施方案中，控制表面4使用静电力来控制不混溶的流体池2的位置。控制表面被充电并使之密切接近不混溶的流体池，就会发生电荷分离。例如将高度正电荷给予控制表面，不混溶的流体池内带负电荷的离子将向带电体分离。结果是两极电荷分离并且引力朝向带电体。参考图1B，产生复合液体池5。在另一个实施方案中，参考图2A，使用控制表面23，可混合位于互不混溶载体流体22的自由表面上的生物样品21和互不混溶的流体池20。控制表面23利用疏水作用来控制不混溶的流体池20的位置。疏水性表面排斥水性基介质，但硅基油容易润湿表面，允许使用毛细管张力控制。使控制表面23接触不混溶的流体池20将会导致主体表面被不混溶的流体池20润湿。然后，可通过平移控制表面23将流体池转运到载体流体22上的位置。参考图2B，产生复合池24。在另一个实施方案中，参考图3A，使用定向控制管33，可混合位于互不混溶载体流体32的自由表面上的生物样品31和互不混溶的流体池30。定向控制管33提供空气喷射，其当定向碰撞不混溶的流体池30时产生大于平移阻力的曳力，因而以受控方式转运池流体。参考图3B，产生复合液体池34。在另一个实施方案中，参考图4A,使用所不的方法和系统,可产生复合液体池。参考图4A，孔板41在一个或多个位置(B1、B2、B3)含有生物样品42并覆盖有不混溶的流体43。控制管44具有跨该管的可控压力。在这种操作模式中，管内保持持续压降，因而将不混溶的流体43吸入管内，当将管平移而接触不混溶的流体43时。不混溶的流体43的体积被吸入管内。参考图4B，控制管44转到生物样品41并吸取一定体积的生物样品Cl。参考图4C，控制管回到不混溶的流体层，吸取一定体积的不混溶流体。在此之后，控制管退出流体覆盖物并取回空气，然后在同一生物样品位置或新的生物样品位置重复该程序。参考图4D，控制管中装载生物样品Cl、C2、C3、不混溶的流体以及分隔不混溶的流体和生物样品的空气间隙45。参考图4E，控制管位于容纳在生物相容的容器47中的载体油层46之上。控制管可接触载体油46的自由表面或位于在其上O - 3mm。在控制管和不混溶的流体中颠倒流动方向，将样品和不混溶的流体沉积在载体油的自由表面上，产生复合液体池。参考图4F，一旦沉积完整复合液体池48，控制管平移到新位置，以沉积下一个复合液体池。转运复合液体池 在另一个实施方案中，参考图5，使用控制表面53，在不混溶的载体流体52上转运复合液体池51。控制表面53使用静电力来控制复合液体池52的位置。控制表面被充电并使之密切接近复合液体池的外部流体，就会发生电荷分离。例如将高度正电荷给予控制表面，不混溶的流体池内带负电荷的离子将向带电体分离。结果是两极电荷分离并且引力朝向带电体。使用该转运动作，可合并一个或多个复合液体池或可将额外生物样品添加到复合液体池。在另一个实施方案中，参考图6A，使用控制表面63，可转运位于互不混溶载体流体62的自由表面上的复合液体池61。控制表面63使用疏水作用来控制复合液体池61的位置。疏水性表面排斥水性基介质，但硅基油容易润湿表面，允许使用毛细管张力控制。使控制表面63接触复合液体池61将会导致该主体表面被复合液体池61的外部流体润湿。然后可通过平移控制表面63将复合液体池转运到载体流体62上的位置。使用该转运动作，可合并一个或多个复合液体池或可将额外生物样品添加到复合液体池。在另一个实施方案中，参考图7，使用定向控制管73，可对位于不混溶的载体流体72上的复合液体池71进行位置控制。定向控制管73提供空气喷射，其当定向碰撞复合液体池71时产生大于平移阻力的曳力，因而以受控方式转运池流体。使用该转运动作，可合并一个或多个复合液体池或可将额外生物样品添加到复合液体池。在另一个实施方案中，参考图8A，使用连接到基底84上的疏水性突出物83，可临时锚定位于不混溶的载体流体82上的复合液体池81。使用该转运动作，可合并一个或多个复合液体池或可将额外生物样品添加到复合液体池。在另一个实施方案中，使用静电力和疏水作用的组合，可移动复合液体池。参考图9A和9B，将复合液体池91定位在不混溶的载体流体92上，并接触疏水性轨道(hydrophobic track) 93而放置。动态控制表面94使用流体静力将复合液体池沿限定的疏水性轨道移动。控制表面94也可用于将复合液体池与疏水性杆分开并独立移动复合液体池或移至另一疏水性位置。使用该转运动作，可合并一个或多个复合液体池或可将额外生物样品添加到复合液体池。在另一个实施方案中，疏水性杆部分淹没在载体流体中。在另一个实施方案中，有多个控制表面，允许离散的复合液体池的独立动作。在另一个实施方案中，转运动作是使用疏水作用的动态控制的组合。将复合液体池定位在不混溶的载体流体上并接触疏水性轨道放置。使用疏水作用的动态控制表面将复合液体池沿限定的疏水性轨道移动。控制表面也可用于将复合液体池与疏水性杆分开并独立移动复合液体池或移至另一疏水性位置。使用该转运动作，可合并一个或多个复合液体池或可将额外生物样品添加到复合液体池。在另一个实施方案中，载体流体是连续流动流体并随其所得动量将复合液体池沿其流线转运。在另一个实施方案中，静态疏水性表面有助于载体流体动量，其中复合液体池可沿该表面前进。在另一个实施方案中，动态疏水性表面有助于载体流体动量，复合液体池可藉此而被转运。除非另有说明，否则本文所公开的任何内容一般而言涉及复合液体池，特别也可适用于多样品复合液体池。产生具有多样品的复合液体池 在一个实施方案中，参考图10A-10F,可用所不方法和系统产生复合液体池。参考图10A，孔板41在一个或多个位置(B101、B102、B103)含有生物样品42并覆盖有不混溶的流体43。控制管44具有跨该管的可控压力。在这种操作模式中，管内保持持续压降，因而将不混溶的流体43吸入控制管44内，当控制管44转而接触不混溶的流体43时。不混溶的流体43的体积被吸入管内。参考图10B，控制管44转到生物样品41并吸取一定体积的生物样品C101。参考图10C，控制管回到不混溶的流体层，吸取一定体积的不混溶的流体。在此之后，控制管在同一生物样品上重复该程序或平移但仍在流体覆盖物内，然后在新生物样品位置上重复该程序。对于多样品复合液体池，在吸取不混溶的流体和生物样品之后，控制管然后从不混溶的油退出并取回空气，然后对新复合液体池重复该程序。参考图10D，控制管中装载生物样品C101、C102、C103和不混溶的流体，用于多样品复合液体池。参考图10E，控制管位于容纳在生物相容的容器47中的载体油层46之上。控制管可接触载体油46的自由表面或位于其上O - 3_。在控制管和不混溶的流体中颠倒流动方向，将样品和不混溶的流体沉积在载体油的自由表面上，产生多样品复合液体池。参考图10F，一旦沉积完整复合液体池48，控制管平移到新位置，以沉积下一个多样品复合液体池。参考图1IA-11C，可使用控制表面204，混合位于互不混溶载体流体203的自由表面上的一个或多个位置(S1、S2)的生物样品201和一个或多个位置(01、02)的互不混溶的流体池202。控制表面204使用静电力来控制不混溶的流体池202的位置。控制表面被充电并使之密切接近不混溶的流体池202，就会发生电荷分离。例如将高度正电荷给予控制表面204，不混溶的流体池202内带负电荷的离子将向带电体而分离。结果是两极电荷分离并且引力朝向带电体。参考图11B，在一个或多个位置(D1、D2)产生复合液体池205。控制表面204使用静电力来控制复合液体池205的位置。参考图11C，通过合并两个或更多个复合液体池产生多样品复合液体池206。图12A和12B是显示由此法而得到的多样品复合液体池的图。在该实例中，产生了复合液体池，其包含含2%绿色染料的2.5微升体积的蒸馏水和含5%聚山梨酯添加剂-司盘80(v/v)的15微升的不混溶流体苯甲基聚硅氧烷-PD5油。用同样试剂，但蒸馏水中用2%红色染料替代绿色染料，产生第二复合液体池。图中颜色可辨别为不同灰色阴影。使用疏水性表面(在这些图像中可见的倒V形)合并2个复合液体池，并位于疏水性杆上的稳定部件内。在另一个实施方案中，参考图13A-13C，使用管状控制表面223的疏水作用，可合并控制管223内的生物样品220和位于互不混溶载体流体222的自由表面上的互不混溶的流体池221。控制管223使用疏水作用来控制不混溶的流体池221的位置。疏水性表面排斥水性基介质，但硅基油容易润湿表面，允许使用毛细管张力控制。参考图13B，通过使控制管223接触不混溶的流体池221将会导致该主体表面被不混溶的流体池221润湿。然后可释放生物样品220，以接触载体流体222上的不混溶的流体池221。如图13B所示，产生复合液体池224。参考图13C，通过用另一生物样品体积来重复该程序，产生多样品复合液体池 225。在另一个实施方案中，参考图14A和14B,使用超声表面235,可细分位于互不混溶载体流体232的自由表面上的互不混溶的流体池231内的生物样品230。参考图14B，产生多样品复合液体池236。
图15A和图15B是显示像图14B的池236的多样品复合液体池的图。在该实例中，将100微升体积的蒸馏水在500微升不混溶的流体池中涡旋，所述流体池由基于苯甲基聚硅氧烷的油-PD5和5%聚山梨酯添加剂-司盘80 (v/v)组成。图15B使用含2%绿色染料的蒸馏水，用于生物样品。图15A和图15B是20微升代表性的样品。在另一个实施方案中，产生具有多个不同样品靶的多个样品的复合液体池。参考图16，将4个不同样品靶乳化并一起稳定混合为具有多个内部样品靶的单个多样品复合液体池。用含绿色染料2%、蓝色染料2%、黄色染料5%和无染料的10微升蒸馏水在由基于苯甲基聚硅氧烷的油-PD5和5%聚山梨酯添加剂-司盘80 (v/v)组成的500微升不混溶的流体池中，产生4个单独的复合液体池。乳化之后，合并复合液体池，参见图16。根据图16，明显的是，无染料的水样品未被染色水样品污染，表明多样品复合液体池内的样品之间没有转移。不同颜色可辨别为不同灰色阴影。在另一个实施方案中，参考图17A和17B，使用定向控制管243，合并位于互不混溶载体流体242的自由表面上的互不混溶的流体池240和两种或更多种生物样品241。定向控制管243提供空气喷射，其当定向碰撞样品241时产生大于平移阻力的曳力，因而以受控方式转运缓冲流体240和样品241。参考图17B，产生所得的多样品复合液体池244。转运具有多个样品的复合液体池
转运复合液体池的所有通用方法，例如以上讨论的那些，也都适用于多样品复合液体池。参考图18A-18C，以及关于6A-6C所解释的，使用具有疏水性控制表面263的装置，可转运位于互不混溶载体流体262的自由表面上的多样品复合液体池261。在另一个实施方案中，控制表面部分淹没在载体流体中。参考图19A和19B，位于不混溶的载体293的自由表面上的多样品复合液体池290被限制在2个疏水性杆291之间。疏水性杆291在其内部具有稳定部件292。如图19A所示，这些部件用于控制复合液体池内的样品，如图19B所示，疏水性杆可沿载体流体293移动，稳定转运多样品复合液体池290。在另一个实施方案中，参考图20并且关于图5所解释的，通过装置控制表面253，使用静电力，将多样品复合液体池251在不混溶的载体流体252上转运。在另一个实施方案中，参考图21并且关于图7所解释的，使用提供空气喷射的定向控制管273，可对位于不混溶的载体流体272上的复合液体池271进行位置控制。在另一个实施方案中，参考图22并且关于图8所解释的，使用连接到基底284上的疏水性突出物283，可临时锚定位于不混溶的载体流体282上的多样品复合液体池281。对于复合液体池的多个样品体积的内部控制
在一个实施方案中，可排列多样品复合液体池的内部样品体积，用于2D分析。参考图23，可将大样品体积加入复合液体池并位于中间，导致原始复合液体池样品排列成环形，用于分析。将含2%绿色染料的100微升体积的蒸馏水在500微升不混溶的流体池中涡旋，所述流体池由基于苯甲基聚硅氧烷的油-PD5和5%聚山梨酯添加剂-司盘80(v/v)组成。分割20微升代表性的样品，将大的未染色水样品，约10微升移液至复合液体池中心。所得结构见图23。在一个实施方案中，使用山梨酸酯添加剂，重组多样品复合液体池的内部样品。聚山梨酯添加剂的实例是司盘80和吐温20但不限于此。缓冲封装流体内的这些添加剂范围介于0.001%和10%之间。用于稳定的机械部件
参考图24A-24D，包含封装在位于互不混溶载体流体313的自由表面上的不混溶的缓冲流体312中的靶样品311的复合液体池稳定位于疏水性表面314。疏水性表面314位于互不混溶的载体流体313之上或之中。具有局部稳定部件315的疏水性表面314控制复合液体池的位置。稳定部件允许在复合液体池内和位于不混溶的载体流体上产生、和/或位置控制、和/或移动控制、和/或混合、和/或拆分、和/或处理生物样品。参考图24B，在一个实施方案中，包含封装在位于互不混溶载体流体303的自由表面上的大约12微升的不混溶的缓冲液302中的大约1.7微升靶样品301的复合液体池，稳定位于具有倒V形表面304的疏水性部件404。疏水性表面位于互不混溶的载体流体303之上或之中。具有局部稳定部件的疏水性装置或部件304控制复合液体池的位置。在一个实施方案中，稳定部件是45度的V型切口(notch)，且面深度(face depth)为2.5mm，厚度为1.5_。这用于控制微升大小的复合液体池。参考图24C，显示了该实施方案的底部示意图。参考图24D，显示了前述实施方案，其具有保留载体流体的环绕壁的外壳305。参考图25A-25D，稳定部件具有为了给定应用而调整的若干参数。这些参数中有2个是部件形状和部件厚度。部件形状对内部样品321的总体大小和位置控制有影响。参考图25A，倒’V’形稳定部件324用所图示的切点A & B控制内部样品321位置。参考图25B，曲线形稳定部件325对样品内部位置的控制更少。形状变化允许定制复合液体池内部样品321与封装缓冲流体322的比率。通常，圆形可达到更大的样品体积与封装流体比率并维持无污染样品。参考图25C，稳定部件的厚度C影响复合液体池的稳定，允许定制应用。对于更大厚度，通常大于50%的复合液体池直径，稳定性不提高。对于静态控制或处理复合液体池，5 - 50%的厚度范围足够稳定自由载体表面323上的复合液体池。稳定部件位于载体流体之上或之中。参考图25D，稳定部件可以是锥形，用于在复合液体池内和位于不混溶的载体流体上的复合液体池产生、和/或位置控制、和/或移动控制、和/或混合、和/或拆分、和/或处理生物样品。参考图26，位于不混溶的载体流体332上的复合液体池331位于具有位置部件334的2个疏水性表面之间。稳定部件允许在复合液体池内和位于不混溶的载体流体上产生、和/或位置控制、和/或移动控制、和/或混合、和/或拆分、和/或处理生物样品。参考图28，可产生离散的复合液体池网络。产生具有机械部件的复合液体池
可如前所述，例如图4A-D，产生复合液体池。参考图27A，控制管位于容纳在生物相容的容器47中的载体油层46之上。控制管可接触载体油46的自由表面或位于在其上O -3mm。在控制管和不混溶的流体中颠倒流动方向，将样品和不混溶的流体沉积在载体油的自由表面上，在疏水性杆349上的稳定部件，产生复合液体池。参考图27B，一旦沉积完整复合液体池48，控制管沿着疏水性杆349平移到新位置，以在稳定部件上沉积下一个复合液体池。在另一个实施方案中，具有稳定部件的两个或更多个疏水性表面用于控制复合液体池位置。疏水性杆上的稳定部件的使用，允许在受控的和离散的位置上产生复合液体池，因此改善样品跟踪和/或自动化和/或过程控制。
转运具有机械部件的复合液体池
在一些实施方案中，参考图29，使用控制表面363，可转运位于互不混溶载体流体362的自由表面上的复合液体池361。控制表面363使用疏水作用来控制复合液体池361的位置。疏水性表面排斥水性基介质，但硅基油容易润湿表面，允许使用毛细管张力控制。使控制表面363接触复合液体池361将会导致该主体表面被复合液体池361的外部流体润湿。然后可通过平移控制表面363将复合液体池转运到载体流体362上的位置。使用该转运动作，可合并一个或多个复合液体池或可将额外生物样品添加到复合液体池。在一些实施方案中，参考图30A和图30B，使用控制表面373，可转运位于互不混溶载体流体372的自由表面上的一排复合液体池371。控制表面373使用疏水作用来控制复合液体池371的位置。疏水性表面排斥水性基介质，但硅基油容易润湿表面，允许使用毛细管张力控制。控制表面373被不超过0.5倍样品直径分隔，以确保样品位置受限。通过平移控制表面373，复合液体池排列371被转运到载体流体372上的位置。对稳定部件使用该转运动作，可单独处理复合液体池，确保所有离散位置的样品的准确度和/或参考稳定部件位置。该实施方案防止不受控的样品合并和/或损失。复合液体池网络
参考图31，复合液体池网络由至少2个稳定区381和连接区382组成。每个稳定区允许在复合液体池384内和位于不混溶的载体流体385上产生、和/或位置控制、和/或移动控制、和/或混合、和/或拆分、和/或处理生物样品383。在一些实施方案中，参考图32A-32F，复合液体池网络用于转运复合液体池。参考图32A，载体油392上的复合液体池391位于具有稳定部件393的一组疏水性杆。参考图32B，控制管394位于这样的位置区或在这样的位置区中，所述位置是复合液体池391被移向的位置。控制管394位于载体流体392的自由表面上并开始输注不混溶的封装缓冲流体395。参考图32C，封装流体395穿过网络并与复合液体池391合并。控制管394被终止并颠倒其流动方向。参考图32D，复合液体池从原始稳定部件位置移至新的指定位置。参考图32E，当复合液体池在新位置时，控制管394中的流动被终止并移出。参考图32F，复合液体池已转运到新位置，用于处理。在另一个实施方案中，使用封装缓冲流体的受控注射和取回，两个或更多个复合液体池可同时转运。在另一个实施方案中，参考图33A-33E，复合流体网络用于转运和合并2个复合液体池。参考图33A，载体流体402上的复合液体池401位于疏水性结构403内。参考图33B，将不混溶的封装缓冲流体404在控制位置405注射到载体流体402。参考图33C，不混溶的封装缓冲流体404穿过网络并与复合液体池401合并。不混溶的封装缓冲流体404的输注被终止。参考图33D，不混溶的封装缓冲流体404从控制位置405取回，内部样品从其原始位置移至新位置。参考图33E，当样品在新位置上时，在控制位置405的不混溶的封装缓冲流体404流动被终止。样品合并产生单个样品复合液体池。复杂封装油界面的形成(其周围界限是控制表面、载体油和空气界面)由自由表面能控制，所述自由表面能与封装油/空气界面的表面积成比例。封装油的受控取出将致使系统将表面积减到最小，导致封装油从网络末端等量移出。这种界面从网络末端的收缩也转运其中所含有的水性液滴。图34A是具有2个复合液体池的复合流体网络图。该图中的复合液体池含有2.5微升样品体积的蒸馏水，一份染红的样品和另一份染蓝的样品。封装缓冲流体是在不混溶的氟代烃载体-FC40上的不混溶的流体苯甲基聚硅氧烷-PD5油。疏水性杆是基于PTFE的材料，其位于载体流体和空气的界面上。稳定部件具有这样的维度:最宽为大约2_，大约45度角。图34B显示具有单个内部样品的单个复合液体池，这是先前2个复合液体池样品体积经上述方法合并而来的结果。参考图35A-35C和36A-36E，封装流体具有添加剂，并且复合液体池的合并产生多样品复合液体池。复合液体池网络的实例在本文中概述，但不限于此；参考图37A-37C，复合液体池网络用于以2个阶段将4个复合液体池合并。参考图37B，在邻近稳定部件的复合液体池首先合并。参考图37C，合并其余复合液体池样品，产生单个复合液体池。参考图38A-38G，另一实例是以5个阶段将32个复合液体池合并的网络。参考图38A，在复合液体池装载之前的疏水性杆网络和载体油。参考图38B，复合液体池在复合流体网络外部位置装载。参考图38C，使用不混溶的缓冲封装流体的输注/取回过程，合并在邻近稳定部件的复合液体池。参考图38D，复合液体池处理的第二阶段，使用不混溶的缓冲封装流体的输注/取回过程，合并在邻近稳定部件的复合液体池。复合液体池现在含有4个原先沉积的复合液体池。参考图38E，复合液体池处理的第三阶段，使用不混溶的缓冲封装流体的输注/取回过程，合并在邻近稳定部件的复合液体池。复合液体池现在含有8个原先沉积的复合液体池。参考图38F，复合液体池处理的第四阶段，使用不混溶的缓冲封装流体的输注/取回过程，合并在邻近稳定部件的复合液体池。复合液体池现在含有16个原先沉积的复合液体池。参考图38G，复合液体池处理的第五阶段，使用不混溶的缓冲封装流体的输注/取回过程，合并在邻近稳定部件的复合液体池。复合液体池现在含有全部32个原先沉积的复合液体池。在每一阶段，都可进行复合液体池的生物处理过程。这些过程可包括但不限于:聚合酶链式反应、和/或热循环、和/或等温扩增、和/或光学分析、和/或另外试剂的添加。在另一个实施方案中，参考图41A-41D，使用输注不混溶的封装缓冲流体的方法，产生复合流体网络。参考图41A，靶样品分配在载体流体上的疏水性杆网络内。参考图41B，不混溶的封装缓冲流体输注在载体流体上。参考图41C，不混溶的封装缓冲流体将样品体积封装在疏水性杆的稳定部件内。参考图41D，显示了复合流体网络的一个实施方案。在另一个实施方案中，参考图42A-42D，复合流体网络具有疏水性控制表面，以控制载体流体上的不混溶的封装缓冲流体网络路径。参考图42A，复合流体网络在不混溶的封装缓冲流体内在离散的稳定部件中具有2个样品。参考图42B，疏水性控制表面用于剪切不混溶的封装缓冲流体，同时维持载体流体路径。参考图42C，不混溶的封装缓冲流体可被取回。参考图42D，产生2个离散的复合液体池。该方法也用于通过复合流体网络发展复合液体池和/或从其它过程中分离复合流体网络内的复合液体池。处理复合液体池
在某些实施方案中，系统可包括在方法结束时实现靶样品组合的以任何顺序的一个或多个以下步骤:提取样品用于靶；处理样品，用于上样到分配系统；分配靶样品；分配不混溶的封装流体池；分配载体流体；混合生物样品和不混溶的封装流体池；混合生物样品和复合液体池；混合生物样品和多样品复合液体池；控制不混溶的封装流体池的运动；控制载体流体的运动；转运一个或多个不混溶的流体池；转运一个或多个不混溶的流体池，以合并一种或多种生物样品；转运一个或多个复合液体池，以合并一种或多种生物样品-M运一个或多个多样品复合液体池，以合并一种或多种生物样品；转运一个或多个复合液体池，以合并一个或多个复合液体池；转运一个或多个多样品复合液体池，以合并一个或多个复合液体池；转运一个或多个多样品复合液体池，以合并一个或多个多样品复合液体池；检测复合液体池内的生物样品的效应；检测多样品复合液体池内的生物样品的效应；检测多样品复合液体池内的生物样品的效应；将输出信息提供给检测使用者；分析输出的检测数据。生物方案的实例在紧接着的部分给出。PCR
聚合酶链式反应(PCR)已广泛用于扩增目标DNA和cDNA，用于分子生物学的多种应用。PCR技术扩增单一拷贝或少数拷贝的一段DNA，产生数千至数十亿拷贝的特定DNA序列。现代PCR仪器进行PCR过程的反应体积范围为10 - 200微升。在小体积中进行PCR的最大障碍之一是难以用手动移液器来操作小体积的组成试剂。PCR的另一个障碍是允许生产量增加的多重反应的困难。本发明的方法通常包括合并必要流体以形成所得多样品复合液体池。在一个实施方案中，靶样品是水性生物样品，其包含核酸扩增所需试剂，而外部流体池是含聚山梨酯添加剂(司盘80)的硅油(苯甲基聚硅氧烷，PD5)，在氟代烃基油(Fluorinert FC-40)的载体流体上。排列单个试剂，使得PCR的所有必要组分都位于单个复合液体池。这阻止了生物试剂的交叉污染。以正确顺序将单个复合液体池组分合并在一起。再将单个复合液体池合并在一起，形成多样品复合液体池。再将多样品复合液体池转运到不同热区或光学检测区(optical interrogation zone),在此通过突光测量而进行产物的定量测量。复合液体池内的PCR靶体积的配置防止在热循环期间蒸发。通常热循环温度范围介于55 - 95° C之间。在又一实施方案中，复合液体池可具有作为离散样品添加的相关检测标记。在又一实施方案中，可能需要PCR后的反应物的合并，用于进一步处理，其可包括基因测序。对于这些相对小的靶体积而言，多样品复合液体池的使用极大地简化了收集和测序程序。可将单独处理之后的多样品复合液体池选择性地合并,从最终收集体积中除去任何非特异性扩增反应物或无效反应物。将由许多不同靶分子组成的合并的最终靶体积转移至测序仪，进行详细分析。当生物样品被处理时，复合液体池促进了 100%的体积回收，并且无需接触任何固体表面并且还具有抗润湿特征的额外益处。另外，极大地减少了热循环所需的流体体积一移除了静态孔板全部物质和热阻一靶向加热策略有利于降低仪器功率和加快反应处理时间。
权利要求
1.一种样品处理系统,其包括: 样品液体输入； 封装液体输入； 包括稳定部件的载体液体导管； 液体处理系统；和 与所述液体处理系统操作性连接的控制器； 其中对所述控制器编程，使所述液体处理系统: (1)从所述封装液体输入中吸取封装液体； (2)将所吸封装液体排出到(a)所述载体液体导管中的载体液体的自由表面上和(b)靠近所述稳定部件，所述封装液体与所述载体液体不混溶，使得所排出封装液体不与所述载体液体混合，漂浮在所述载体液体上面，并被所述稳定部件固定； (3)从所述样品液体输入中吸取样品液体；和 (4)排出所吸样品液体，所述样品液体与所述封装液体和与所述载体液体不混溶，使得所述样品液体与所述封装液体或与所述载体液体不混合。
2.权利要求1的系统，其中所述液体处理系统包括控制管和驱动器，并且对所述控制器编程，以开动所述驱动器以使所述控制管进行步骤(I)和(3)，然后进行步骤(2)和(4)。
3.权利要求2的系统，其中对所述控制器编程，以开动所述驱动器以使所述控制管进行步骤(I)，然后步骤(3)，然后(5)吸取额外封装液体，然后￠)排出所述封装液体，然后进行步骤(4)，然后步骤(2)，使得所述封装液体、所述样品液体和额外封装液体作为一个单元从所述控制管中排出到所述载体液体导管中的载体液体的自由表面上，所述封装液体和额外封装液体从而合并并且包围所述样品液体，形成复合液体池。
4.权利要求3的系统，其中对所述控制器进一步编程，以开动所述驱动器以使所述控制管在步骤(5)之后和在步骤(6)之前(7)吸取分离器。
5.权利要求4的系统，其中所述分离器包括空气。
6.权利要求4或权利要求5的系统，其中对所述控制器进一步编程，以开动所述驱动器以使所述控制管在步骤(7)之后和在步骤(6)之前(Ia)从封装液体输入吸取封装液体，然后(3a)从样品液体输入吸取样品液体，然后(5a)吸取额外封装液体，然后^a)将步骤(Ia)和(5a)的封装液体与步骤(3a)的样品液体作为第二单元从控制管中排出到载体液体导管中的载体液体的自由表面上，所述第二单元从而形成第二复合液体池。
7.权利要求3的系统，其中对所`述控制器进一步编程，以开动所述驱动器以使所述控制管在步骤(5)之后和步骤(6)之前(8)从第二样品液体输入中吸取第二样品液体，所述第二样品液体与所述载体液体和所述封装液体不混溶，然后(9)吸取额外封装液体，然后(10)将步骤(9)的额外封装液体和第二样品液体排出到所述单元内，使得由此产生的复合液体池包含一滴所述样品液体和一滴所述第二样品液体。
8.权利要求1的系统，其中所述液体处理系统包括控制管和驱动器，并对所述控制器编程，以开动所述驱动器以使所述控制管按照所列出的顺序进行步骤(I)至(4)。
9.权利要求8的系统，其中对所述控制器编程，以进行步骤(I)，然后对多个稳定部件重复步骤(2)，然后进行步骤(3)，然后对所述多个稳定部件重复步骤(4)，从而形成多个分布在所述稳定部件中的复合液体池。
10.权利要求8或权利要求9的系统，其中对所述控制器进一步编程，以开动所述驱动器以使所述控制管(11)吸取与所述样品液体可混溶的试剂，和(12)紧邻所排出样品液体排出所述试剂。
11.前述权利要求中任一项的系统，其中(a)所述载体液体导管包括浴器，将其制成一定大小以容纳载体液体浴器上的可在其中旋转的圆盘；(b)在所述圆盘中形成稳定部件；(C)所述系统还包括(I)与圆盘操作性偶联并使其在浴器中旋转的旋转驱动器，和(2)运动系统，其相对于载体液体导管垂直平移至少液体处理系统的排出部分；和(d)控制器与旋转驱动器和运动系统操作性连接并经过编程以使所述旋转系统旋转所述圆盘并使运动系统相对于所述圆盘垂直平移液体处理系统的排出部分。
12.权利要求11的系统，其中对所述控制器进一步编程，以开动所述运动系统以使所述控制管相对于所述载体液体导管，移动在载体液体的自由表面上形成的复合液体池。
13.前述权利要求中任一项的系统，其中对所述控制器进一步编程，以使所述液体处理系统在所述载体液体的自由表面上形成的并被缝隙隔开的2个复合液体池之间排出足够的封装液体，液体填补该缝隙，从而使所述2个复合液体池彼此合并。
14.前述权利要求中任一项的系统，其中对所述控制器编程，以使所述液体处理系统紧邻所排出封装液体排出步骤(4)的样品液体。
15.一种样品处理方法，其包括: 从封装液体输入中吸取封装液体； 将所吸封装液体排出到(a)包括稳定部件的载体液体导管中的载体液体的自由表面上和(b)靠近所述稳定部件，所述封装液体与所述载体液体不混溶，使得所排出封装液体不与所述载体液体混合，漂浮在所述载体液体上面，并被所述稳定部件固定； 从样品液体输入中吸取样品液体；和 排出所吸样品液体，所述样品液体与所述封装液体和与所述载体液体不混溶，使得所述样品液体与所述封 装液体或与所述载体液体不混合。
全文摘要
样品处理方法可包括从封装液体输入中吸取封装液体；将所吸封装液体排出到(a)包括稳定部件的载体液体导管中的载体液体的自由表面上和(b)靠近所述稳定部件，所述封装液体与所述载体液体不混溶，使得所排出封装液体不与所述载体液体混合，漂浮在所述载体液体上面，并被所述稳定部件固定；从样品液体输入中吸取样品液体；和排出所吸样品液体，所述样品液体与所述封装液体和与所述载体液体不混溶，使得所述样品液体与所述封装液体或与所述载体液体不混合。
文档编号B01L3/00GK103153466SQ201180044805
公开日2013年6月12日 申请日期2011年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者K.卡兰, P.托希, I.罗斯卡, P.弗勒明, S.吉尔霍利, M.基恩 申请人:基因细胞生物系统有限公司