用于可靠地控制分子的浓度分布以刺激目标的微流体系统的制作方法

用于可靠地控制分子的浓度分布以刺激目标的微流体系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于控制能够刺激例如由活细胞的组件形成的目标的分子的浓度分布的微流体系统，该系统包括:微流体装置(1)，其包括设有用于至少一种流体的至少一个进口孔（21）和至少一个出口孔（22）的至少一个微流体通道（4）；用于为所述微流体通道(4)供应包含能刺激目标的分子的至少一种流体的至少一个装置；至少一个腔室（8）或者另一微流体通道，其包括用于接收所述目标的一底座（6）；以及-将所述腔室(8)或另一微流体通道与所述微流体通道(4)分隔开的至少一个微孔薄膜（5），所述微孔薄膜（5）远离底座(6)设置，以使得当所述供应机构给所述微流体通道（4）供应按层流、与所述微孔薄膜（5）接触地流动的所述至少一种流体时，能刺激目标的分子在已经穿过微孔薄膜（5）通过腔室(8)或者另一微流体通道之后，然后扩散以便最后在该腔室(8)或者该另一微流体通道中形成一稳定的浓度分布。
【专利说明】用于可靠地控制分子的浓度分布以刺激目标的微流体系统
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及微流体领域。
【背景技术】
[0002]微流体应用系统具有微米尺寸，其尺寸通常在几十微米到几百微米之间。
[0003]所述系统可用于许多领域，例如，细胞诊断试验、医学产品研制、基本的生物科学或者美容术。
[0004]在所述领域中，存在对用于定量测定活细胞对某些分子的反应(响应response)且特别是对空间上和临时受控的浓度分布的反应的微流体系统的增加的需求。
[0005]例如，可能存在测量癌细胞对用于化学疗法的分子的反应的问题。该反应的精确测定要求对产生该反应的分子施加控制。该控制可涉及与癌细胞相互作用的分子的数量、癌细胞暴露于其中的分子的浓度分布、所述分子的数量和/或用在癌细胞上的所述分子的浓度分布随时间的变化等。
[0006]在美容术领域，可以使用微流体系统来测试某些分子对活细胞和/或细胞组织的毒性。对给予细胞的可以是有毒的分子数量的控制和给予所述分子的确定方式在确定毒性阈值时是必需的。
[0007]在文件US7374906中提出了一种广泛用于刺激活细胞的微流体系统的实例。该微流体系统特别是允许活细胞经受分子的浓度梯度，该浓度梯度的分布是直线型的并且在时间上是稳定的。
[0008]该类微流体系统的主要缺点是使活细胞经受产生剪切力的流体，使其紊乱。当旨在研究神经细胞的生长锥的趋化性反应时，该剪切效应是特别麻烦的。实际上，流体产生的剪切应力更改了最佳情况中的目标细胞的反应或者引起了细胞的死亡或者分离。
[0009]利用该文件中所公开的系统按该方式来研究活细胞的生理特性是受到了干扰的。
[0010]因此，已经提出了在不受流体干扰的情况下使活细胞经受分子的浓度梯度的解决方案。
[0011]例如，在“Biomed Microdevices” (生物群落微装置)(2009)的第11卷第65-73 页、Taesung Kim, Mikhail Pinelis 和 Michel M Maharbiz 的论文 “Generatingsteep, shear-free gradients of small molecules for cell culture，，中提出了一种应用可刺激活细胞的分子的浓度梯度的微流体系统。
[0012]该微流体系统包括一微流体装置10和用于向所述装置供给流体的机构(未显示)。
[0013]图1中按分解透视图的形式示出了该文件中公开的微流体系统10。
[0014]其包括一聚二甲硅氧烷(PDMS)底座11，该底座11包括大致正方形形状的一中心区域12，该中心区域12连接到按相对于中心部分12成十字形设置的通道13a、13b、13c和13d上。其还包括覆盖所述PDMS底座11的中心区域12的一聚脂微孔薄膜14。最后，其包括覆盖聚脂薄膜14、PDMS底座11和通道13a、13b、13c、13d的一 PDMS盖子15(图1中按截去尖端的形式示出了盖子15)。[0015]因此，微流体系统10被聚脂薄膜14分隔成两部分。
[0016]第一部分形成了其中可以使流动流体循环的通道，所述通道在顶端处被薄膜14封闭住，薄膜的下侧从而形成了使该通道经受流体的壁。
[0017]与通道相反的第二部分是由薄膜14的上侧形成的，并且被培养的活细胞(LC)位于其上面。
[0018]未示出供应流体的机构。然而，应当注意到，第一流体通过进口 El被引入到微流体系统10的底座11中，并且第二流体通过与进口 El相反的进口 E2被引入到微流体系统10的该底座11中。所述流体中的至少一个包含用于通过聚脂薄膜14来刺激活细胞的分子。
[0019]因此，使经进口 El、E2进入在微流体系统10的底座11中循环的流体面对面地接触，在所述两个流体的分界面处产生了一混合区域，并且然后通过出口 S离开该底座11。
[0020]为了在时间以及空间上控制活细胞的培养，可以利用微流体系统10来调节流体的流量以便在聚脂薄膜14上形成预定的分子浓度分布。
[0021]更确切地说，在选择合适的流体之后，调节两个流体中每个的流量以允许在两个流体之间的分界面处形成非常特殊的混合区域，即，形成用来刺激活细胞的非常特殊的分子浓度分布。其中按照限定的分布来产生浓度梯度的该混合区域大致沿图1中所示的穿过底座11的两个出口 S的轴线A延伸。
[0022]然而，该微流体系统具有几个缺点。
[0023]第一，必须非常精确地控制来自进口 El、E2的流体的相应流量，以便在聚脂薄膜14的下侧产生稳定的分子浓度分布。
[0024]在微流体系统10的上游处，即在流体供应机构自身执行流体流量的这种控制，在两个流体间的分界面处，对于底座11中的其部分产生梯度。
[0025]因此，所述两个流体中的一个或另一个的流量的扰动改变了两个流体之间的分界面，并且因此还改变了薄膜14的下侧处的分子浓度分布。因此，难以达到浓度分布的稳定性。
[0026]此外，因为活细胞设置在薄膜14的上侧，所以应用在活细胞上的浓度分布大致相当于应用在薄膜下侧上的分布。当薄膜14具有ΙΟμπι的小厚度时，这是更真实的。
[0027]第二，在活细胞上获得的浓度分布的斜率取决于微流体通道中的流体速度和两个流体之间的分界面距离进口 Ε1、Ε2的位置。因此很难控制分布的斜率。
[0028]第三，微流体系统10应用一聚脂薄膜14，其下侧粘到PDMS底座11的正方形的边缘，其上侧粘到由PDMS制成的盖子15。选择所述材料，因为其特别是允许通过该文件中所述工艺将薄膜14、底座11和盖子15粘到一起。通道13a、13b、13c、13d和薄膜14上存在的盖子15允许增强薄膜14与底座11之间的机械阻力和密闭性，实际上仅通过在底座11的边缘上进行薄膜14与底座11之间的粘附。此外，利用PDMS预聚物的沉积来执行薄膜14的粘附，其允许通过在机械压力下加热来进行装置的不可逆制造。一旦已经将薄膜14和盖子15粘附到一起，则可以通过盖子15侧面上留下的开口来将细胞插设到薄膜14上。
[0029]利用所述材料的选择和该配置，从而可以获得合适的机械抗性和密闭度。
[0030]为了确保通道与薄膜14之间的密闭性，必需通过盖子来封闭微流体系统。然后，需要在微流体系统10内部进行细胞培养。对于非常复杂的细胞培养，例如神经细胞的原代培养、组织的移植或切片，是非常不现实的。
[0031]此外，带有PDMS盖子15，不能看到或者很难看到活细胞对刺激的反应。更关键的是PDMS盖子必须具有某一厚度以允许其操作，因为该材料具有较低的弹性模量。较大的厚度甚至进一步降低了该材料的光学性质。因此，很难通过合适的光学装置来观察到设置在薄膜上的活细胞的反应。

【发明内容】

[0032]本发明的一个目标是克服所述缺点中的至少一个。
[0033]为了实现所述目标中的至少一个，本发明提出了一种用于控制可刺激例如由一组活细胞形成的目标的分子的浓度分布的微流体系统，所述系统包括:
[0034]-一微流体装置，其包括设有用于至少一种流体的至少一个进口孔和至少一个出口孔的至少一个微流体通道；
[0035]-至少一个装置，其用于给微流体通道供应包括可刺激目标的分子的至少一种流体；
[0036]-具有用来接收目标的底座的至少一个腔室或者另一个微流体通道；以及
[0037]-将腔室或者另一微流体通道与所述微流体通道分隔开的至少一个微孔薄膜，
[0038]所述微孔薄膜远离底座设置，以使得当所述供应机构向微流体通道供应所述至少一种流体时，其按层流状态与微孔薄膜接触地流动，然后，可刺激目标的分子在经过微孔薄膜、通过腔室或者所述另一微流体通道之后扩散，并且最后在该腔室或者该另一微流体通道中形成稳定的浓度分布。
[0039]系统可预计有其他技术特征，单独或者组合:
[0040]-微流体通道包括由选自于以下物质的材料制成的盖子:玻璃或者硅、非弹性体的光致交联(photocrosslinked)聚合物、金属、电导体或者半导体的合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体；
[0041]-用于流体的所述至少一个进口孔和所述至少一个出口孔形成在盖子中；
[0042]-微流体通道包括由光致固化和/或热固化的树脂制成的至少一个壁；
[0043]-微孔薄膜在微流体通道的侧壁上横向地延伸以在底面处封闭所述通道；
[0044]-微流体通道设置在几个等级(高度)处，每个等级具有用于至少一种流体的至少一个进口孔；
[0045]-腔室或所述另一微流体通道的底座是由光学透明材料制成的；
[0046]-腔室或者所述另一微流体通道包括由光致固化和/或热固化的树脂制成的侧壁；
[0047]-微孔薄膜在腔室或者所述另一微流体通道的侧壁之间横向地延伸以在顶部处封闭所述腔室或者所述另一微流体通道；
[0048]-微孔薄膜是由选自于以下物质的材料制成的:玻璃、聚碳酸酯、聚脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、石英、硅、二氧化硅或者碳化硅；
[0049]-微孔薄膜包括密度在IO3到101°孔/cm2之间的小孔；
[0050]-小孔具有在0.05 μ m到12 μ m之间的水力直径，优选在0.05 μ m到3 μ m之间的
水力直径；[0051]-其包括一光学可视化机构；
[0052]-所述光学装置应用光敏局部显微技术或者受激发射减损显微技术。
【专利附图】

【附图说明】
[0053]本发明的其他特征、目的和优点出现在以下参见附图的详细说明中:
[0054]-图2是根据本发明的微流体装置的简图，其处于局部剖视图；
[0055]-图3(a)到3 Cd)酌情显示了图2中所示的微流体装置的制造工艺的步骤或者在该工艺的某些步骤的结尾处获得的中间结构；
[0056]-图4(a)到4 (c)显示了在由装置的底座和侧壁形成的组件的制造期间获得的中间结构，所述组件用来形成图2的微流体装置的一部分；
[0057]-图5(a)显示了根据本发明的微流体装置的微流体通道，图5 (b)显示了在根据本发明的该第一通道中流动的流体，并且图5 (c)显示了在根据本发明的装置的腔室中所获得的浓度分布；
[0058]-图6(a)到6 (C)全部以剖视图显示了根据本发明的微流体装置，通过其可以连续地观察到用于刺激在装置的腔室中的活细胞的分子的浓度分布随时间稳定性的不同阶段；
[0059]-图7(a)显示了根据本发明的微流体装置的另一微流体通道，图7 (b)显示了在该第一通道中流动的流体，并且图7 (c)显示了在根据本发明的装置的腔室中所获得的浓度分布；
[0060]-图8显示了对于不同方案通过扩散来建立用于刺激活细胞的分子的恒定方式随时间的变化；
[0061]-图9是根据本发明的微流体装置的一实施例的剖视图的简图，能够产生比图2中示意性地示出的微流体装置更复杂的浓度分布；
[0062]-图10显示了类似于以上在根据图9的微流体装置的腔室中所获得的空间上定期的浓度分布；
[0063]-图11(a)到11 (c)显示了以图9中所示的微流体装置的制造工艺获得几个中间结构。
【具体实施方式】
[0064]本发明涉及一种用于控制分子的浓度分布的微流体系统以能够刺激例如由一组活细胞形成的目标，所述系统包括微流体装置和用于给该装置供应包括能刺激该目标的分子的至少一种流体的至少一个机构。
[0065]参见图2描述了微流体装置，并且参见图3 (a)到3 (d)和4 (a)到4 (C)描述了该装置的制造工艺。然后将参见图5(a)和6(a)来描述作为非限制性实例的、可用在该装置内的微流体通道的特殊形式。
[0066]图2以局部剖视图、透视图的形式示出了根据本发明的微流体装置I。
[0067]该微流体装置I包括有利地为刚性的、设有两个孔口 21、22的一盖子2和有利地由光致固化和/或热固化的树脂制成的侧壁3。装置I的侧壁3被制造成光致固化和/或热固化的树脂的单层。[0068]微流体装置I还在其下半部分中包括被横过侧壁3的底座延伸的微孔薄膜5覆盖的一开口 47。侧壁3、盖子2和微孔薄膜5允许限定出一微流体通道4，由所述孔口 21、22构成了微流体通道4的进口和出口。
[0069]微孔薄膜5防止在微通道4中流动的流体流到该薄膜的另一侧，然而，该薄膜的另一侧允许由微流体通道4中的流体携带的可刺激目标的分子扩散。
[0070]该微流体装置I还包括有利地为刚性且透明的一底座6和有利地由光致固化和/或热固化的树脂制成的侧壁7a、7b。所述侧壁7a、7b、底座6和微孔薄膜允许形成用于目标细胞的培养腔室的一腔室8。为了形成所述腔室8，设置四个侧壁，但实际上所述侧壁可以被比作单个轮廓，因为制造工艺有利地所述侧壁生产为一件。
[0071]腔室8的底部是由底座6的上侧61形成，其用来接收例如由活细胞形成的目标。因此，活细胞未设置在腔室8的底座6上的微孔薄膜5上，而是远离微孔薄膜5。因此，其可以被在与微流体装置4分隔开的标准条件下培养。
[0072]因此，微孔薄膜5将装置分隔成两个单独的微流体通道4、8。微流体通道4允许包含可刺激目标的分子的流体循环(环流)。如将在稍后的说明中更详细地阐明的，通过经由微孔薄膜5扩散到腔室8中，并且然后通过腔室8 (培养腔室)扩散来执行，在腔室8的底部存在例如被刺激的活细胞(LC)。
[0073]有利地，底座6是由例如玻璃的光学透明材料制成。这是有好处的，因为可在装置外设置光学可视机构来例如观察对位于腔室8底部的活细胞的刺激的反应。
[0074]盖子2可由选自于以下的材料制成的:玻璃或者硅、非弹性体的光致交联聚合物、金属、电导体或者半导体的合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体。
[0075]选择微孔薄膜5的小孔的尺寸以防止流体在第一微流体通道4与腔室8之间的任何通过。如果小孔是圆柱形的，则该尺寸可与小孔直径相比。一般地说，小孔的尺寸可与后者的水力直径相比。
[0076]实际上，微孔薄膜5不能完全不受流体通道的影响。因此，可以认为，如果流过微孔薄膜5的流体的速度低于极限值，则位于腔室8底部的细胞不会经受任何流体。
[0077]例如，可以认为，该限制速度为I μ m/s的量级。在该情况中，甚至对于具有例如20 μ m的较小高度h’的腔室8，施加在细胞上的剪切应力是可以忽略的。
[0078]此外，微流体通道4中的速度通常在100 μ m/s到1000 μ m/s之间。
[0079]因此，为了达到I μ m/s的极限值，取决于通道4中的流体速度，微孔薄膜5的流体阻力K，必须大于微流体通道4的流体阻力Rh, ait的100到1000倍。
[0080]特别是，如果微流体通道4中流体的流速为1000 μ m/s，则其需要注意到以下不等式:
[0081]1000*Rh,通道 <Rh,薄膜(Rl)
[0082]以确保通过薄膜5的流体的速度充分低于假定的I μ m/s的极限值。
[0083]此外，如果假定有高h、宽w且长L的一矩形微流体通道4以及厚e并且具有半径r/>a、表面小孔密度P的圆柱形的且相同的小孔的微孔薄膜5，则按以下形式来编写关系式(Rl):
[0084]1000* μ.L/ (w.h3) < μ.e/ (r 小孔 4.P.Lw) (R2)
[0085]并且:[0086]Θ =r 小孔 4.p/e〈l(T3*h3/L2 (R3)
[0087]对于高度h=100 μ m、宽度W=1000 μ m且长度L=1000 μ m的微流体通道4，则条件Θ必须小于10_9m以满足关系式(R3)。此外，如果考虑到有半径为I μ m的圆柱形小孔和10 μ m厚的薄膜，则表面小孔密度P必须小于IO6孔/cm2。
[0088]当然，一方面，可以将关系式(R3)归纳为通过微孔薄膜5的流体的限制速度的假定值的函数，另一方面，归纳为该流体在微流体通道4中的流速的函数。
[0089]微孔薄膜5可具有水力直径在0.05μπι到12 μ m之间的小孔。特别是，如果小孔是圆柱形的，则小孔的水力直径相当于其直径。
[0090]然而，有利地，该水力直径将在0.05μπι到3μπι之间。实际上，应当注意到，对于可能遇到大部分使用条件，使用具有其水力直径小于3 μ m的小孔的薄膜阻止了腔室8中的所有流体通道。
[0091]目前，薄膜制造厂提供其小孔的水力直径通常大于0.2 μ m的薄膜。在本发明的上下文中，因此小孔可有利地具有在0.2μπ?到3μπ?之间的水力直径。然而，理论上，小孔的水力直径没有下限，这说明了为什么考虑应用其水力直径达到0.05 μ m的小孔。
[0092]如果使用更大的小孔，则微流体装置更难以用来(例如，选择微流体通道4中的流量)确保流体不通过微孔薄膜5。
[0093]至于小孔密度，可以在IO3到101°孔/cm2之间。小孔高度可以在50nm至Ij IOOym之间。
[0094]此外，微孔薄膜5可以由例如玻璃、石英、硅、二氧化硅或碳化硅或者与能用于微流体装置的其余部分的聚合物具有相同性能的聚合物的各种材料制成。因此，可以使用聚碳酸酯、聚脂或者聚对苯二甲酸乙二醇酯。
[0095]根据第一实例，可以设想一聚碳酸酯微孔薄膜5，其中小孔的水力直径在0.2μπι到I μ m之间，例如为Whatman公司的Cyclopore类型(Whatman Cyclopore?)。根据第二实例，可以设想一聚脂微孔薄膜5，其中小孔的水力直径在0.4μπι到3μπι之间，例如为
Corning 公司的 Transwell 类型(Coming? Transwell? )。根据第三实例，可以设想一
聚对苯二甲酸乙二醇酯微孔薄膜5，其中小孔的水力直径在0.4 μ m到8 μ m之间，例如为Becton Dickinson 公司的 “Track-Etched 类型”。
[0096]所述微孔薄膜具有适合以下参见图3(a)到3(d)所描述的微流体装置I的制造工艺的优点。其还具有生物相容和具体地说可渗透任何分子的可功能化(functional izable)的优点。“可功能化”是指可以在化学性质上改进微孔薄膜5以实现一特殊功能(某些生物种的保持力、化学反应等)。
[0097]通常，装置可具有以下尺寸。微流体通道的高度h可以在Ιμπι到ΙΟΟΟμπι之间，有利地在ΙΟμπι到200μπι之间。其宽度(未显示)可以在ΙΟμπι到2mm之间。腔室8的高度h’可以在IOym到1000ym之间，有利地在50μπι到200 μ m之间。此外，进口 E和出口S之间的距离为几厘米。
[0098]根据本发明的微流体装置I的制造工艺的实例为至少包括以下步骤的一工艺:
[0099](a)使用由弹性体材料制成的一印模I’来压印放置在设有微孔薄膜5的衬底2’上的可光致固化和/或热固化的液体；
[0100](b)光照和/或加热液体L以形成在其底座处被微孔薄膜5封闭的第一侧壁3 ；[0101](C)在与衬底2’相对的一侧，将设有至少两个孔口 21、22的盖子3粘附到第一侧壁3以形成流体可以在其中循环的一微流体通道4 ；
[0102](d)在已经移除了衬底2’之后，将至少包括由光致固化和/或热固化的树脂制成的至少两个第二侧壁7a、7b和底座6的一组件粘附到第一侧壁3的可通过移除衬底2’来接近的那部分上，以形成腔室8。
[0103]该工艺是基于文件W02008/009803中所公开的工艺。
[0104]图3 Ca)中示出了步骤(a)期间执行的操作。
[0105]用于步骤(a)的印模I’可以由例如PDMS的弹性体材料制成。其具有用作与所希望生产的微流体装置I互补的模具的轮廓。因此，印模I’具有与所希望获得的微流体装置I的通道4相对应的凸起I’ a。其还具有包围凸起I’ a的中空区域I’ b，其是用来形成微流体装置I的所述第一侧壁3的区域。衬底2’也可以由PDMS制成并且具有平坦的轮廓。
[0106]微孔薄膜5预先设置在衬底2’上，将印模I’压到衬底2’上。因此，印模I’通过凸起I’ a将薄膜5挤压到衬底2’上。
[0107]其次，呈液态形式LR的光致交联和/或光致聚合的树脂按合适数量注入到位于印模I’与衬底2’之间的空间中，特别是注入到印模I’的中空区域I’b中。该注入不会改变微孔薄膜5的位置，因为微孔薄膜5被楔入在印模I’与衬底2’之间。
[0108]光致交联和/或光致聚合的树脂是基于单体和/或预聚物的溶液或者悬飘液。在本发明的工艺中通常使用光致交联和/或光致聚合的树脂用作胶水或者表面涂料。
[0109]有利地，选择通常用于光学领域的粘合剂、胶水或者表面涂料。一旦树脂已经被照射和光致交联和/或光致聚合，则其变成固体。优选是，如此形成的固体是透明的，并且没有气泡或者任何其他不规则性。
[0110]所述树脂通常基于环氧、环氧硅烷、丙烯酸盐、异丁烯酸、丙烯酸或甲基丙烯酸类的单体/共聚单体/预聚物，但是还可以提及硫醇烯(thiolene)、聚氨基甲酸酯和氨基甲酸乙酯-丙烯酸酯树脂。所述树脂可以例如由聚丙烯酰胺凝胶的光致交联的水凝胶来代替，并且选择其在室温下为液体的。所述树脂还可以由聚二甲硅氧烷(PDMS)来代替。
[0111]在可用于本发明的光致交联树脂之中，可能提及了 Norland Optics公司按商标“NOA? Norland Optical Adhesives” 销售的产品，例如,N0A81 和 N0A60,由 Dymax 公司以“Dymax Adhesive和光固化系统”类别销售的产品，由Bohle公司以“UV粘合剂”类别销售的产品，由Sartomer公司在商业标准SR492和SR499下销售的产品。
[0112]通过利用例如以紫外线(UV)、可见光照射或者红外线(IR)辐射的任何合适方法的光敏化来进行所述树脂的聚合和/或交联。
[0113]优选是，选择一种树脂，其一旦被聚合和/或交联，则为刚性的和不易弯的，这是因为当流体在压力下在微流体装置I中循环时弹性树脂趋向于变形。然而，对于某些应用，例如活细胞的弹性研究，并不排除使用光致交联的弹性树脂。
[0114]在以液态树脂LR注入位于印模I’与衬底2’之间的容积中之后，在印模I’上施加一压力以将任何可能过剩的树脂排出。在图2中，弹性的印模I’的凸出部且特别是凸起I’a与衬底2’接触。液态树脂呈现出印模I’中中空区域的形状。
[0115]在图3 (b)中示出了步骤(b)的末尾获得的所述结构。
[0116]在步骤(b)期间，通过印模I’，沿垂直于装置的底座的轴线进行树脂的照射。必须正确地按比例照射，以便如果需要，在所述第一树脂的侧壁3的表面上留下能起作用的聚合和/或交联点。然后，从该装置去除印模I’。图3 (b)显示了由光致聚合和/或光致交联的树脂制成的第一侧壁3，其具有与印模I’的中空区域互补的轮廓。
[0117]很清楚，有可设想印模I’的轮廓是如此的，以便光致聚合和/或光致交联的树脂限定出其他图案。这对于根据本发明的微流体装置100的情况是值得注意的，将参见图9进一步描述。
[0118]利用弹性印模I’压印到液态的树脂中允许获得具有很好清晰度的非常小尺寸的结构。
[0119]然后，在步骤(C)期间，将具有至少两个孔口 21、22的盖子2在所述第一侧壁3预先接触印模I’的一侧处固定到装置上。然后，可以移除衬底2’。
[0120]在图3 (c)中示出了步骤(C)的末尾获得的所述结构。
[0121]在没有将微孔薄膜从光致聚合和/或光致交联的树脂上松开的情况下并且在没有拔出或者局部地撕破的情况下进行衬底2’的移除
[0122]盖子2可由玻璃、硅、固态聚合物薄膜、金属、导体或半导体的合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体制成。
[0123]优选玻璃载片、聚合物膜或者硅载片。依据微流体装置I的目的应用来选择用来形成盖子2的材料。
[0124]因此，由例如玻璃的光学透明材料制成的盖子2更适于方便观测和光检测(透明性)。玻璃的另一优点是其很好的导热性，其允许均匀地加热装置。
[0125]应当注意到，微孔薄膜5设置在微流体通道4的下半部分处使得其用途和活细胞培养的标准规约相适合。实际上，然后可设想，底座6是在其上培养活细胞的玻璃载片，然后将所述载片固定到步骤(c)的末尾所获得的结构上以形成腔室8 (培养腔室)，如稍后在说明书中阐明的。
[0126]可以根据以下工艺步骤来生产包括底座6和两个第二侧壁7a、7b的组件:
[0127]G1)使用由弹性体材料制成的一敞口模具3’(open mold),其具有用来接收光致固化和/或热固化的液态树脂LR的衬底侧3’ a和空腔3’ b ；
[0128](e2)将底座6设置到模具3’的衬底侧3’ a上；
[0129](e3)将掩模4’设置到底座6上，然后光照或者加热以形成所述第二侧壁7a、7b。
[0130]在步骤(e3)由光照液态树脂构成的情况下，图4 (a)示出了在步骤(θι)到(e3)的末尾所获得的结构。
[0131]类似于印模I’和衬底2’，模具3’可以由例如PDMS的弹性材料制成。
[0132]用来形成壁7a、7b的光致固化和/或热固化的液态树脂可以选自于已经描述了其特征的用于步骤(a)的液态树脂。优选是，用于步骤(a)和(ei)到(e3)的液态树脂是相同的。作为一变型，可使用例如如上所述的光致交联的水凝胶或者聚二甲硅氧烷(PDMS)。
[0133]底座6可以选自于用于盖子的材料。有利地，可以使用光学透明材料以便于利用专用设备来进行光学目测可视化。该光学透明材料可特别是玻璃，因此通常应用形成为玻璃盖子的底座6来培养活细胞(LC)。此外，使用玻璃允许获得该衬底可用的化学和生物表面处理的优点。
[0134]掩模4’可具有允许光照液态树脂的精确区域以形成微流体装置的所述第二侧壁7a,7b 的孔口 4，a、4，b。
[0135]一旦完成步骤(e3)，所有剩下的就是在步骤(e4)中移除掩模4’和模具3’以刚好留下由所述第二侧壁7a、7b和底座6所形成的组件。图4 (b)中示出了该组件。
[0136]通常，然后进行步骤(e5)，包括利用按体积计算90/10比例的乙醇/丙酮混合物来冲洗所述组件。该冲洗允许移除没有被光照或者没有被加热而可能保持在底座6上的所有树脂。
[0137]然后，在设置利用在步骤(C)末尾所获得结构的该组件之前并且在开始步骤(d)之前，培养活细胞(LC)。
[0138]为此，需要使组件生物相适合。
[0139]为了该目的，可以例如利用UV强烈地光照组件，紧跟着在例如水的中性溶液中猛烈地冲洗几小时。
[0140]最后，然后可以在底座6的上侧61处进行活细胞的培养，如图4 (C)中所示。在标准条件下进行该培养。特别是可以在呈传统的玻璃载片形式的底座6上进行所述培养。
[0141]一旦完成该培养，则可以进行步骤(d)。
[0142]在图3 Cd)中所示的步骤(d)中执行该操作。
[0143]一旦已经执行步骤(d)，则随时可使用微流体装置I。特别是包括底座6的上侧61上的活细胞，该上侧61与腔室8 (培养腔室)中的微孔薄膜5相对。
[0144]为了使用该微流体装置1，使其与也属于根据本发明的微流体系统的流体供应机构(未显示)结合到一起。该供应机构允许给微流体通道供应包含可刺激活细胞的分子的至少一种流体。
[0145]该供应机构例如可由通过毛细管连接到微流体通道4上的一组流体储罐形成。利用该装置，则可在使来自不同储罐的不同流体进入微流体通道之前对其进行稀释和/或混
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[0146]此外，微流体通道4可具有特定形状。
[0147]图5 Ca)中以透视图的形式示意性地显示了可被使用的微流体通道4的一实例。
[0148]其是用于两个不同流体FpF2的微流体通道4。流体FpF2仅在两个流体之一和用于目标细胞的刺激分子的低浓度方面不同。流体在两个支管42、43中被输送，所述两个支管42、43组成具有一分界面41的公共歧管44，微流体装置I的微孔薄膜5计划设置在该分界面41处。
[0149]很清楚，在该特殊情况下，供应机构分别为流体Fp F2提供了两个流体源。
[0150]所述流体Fp F2通过进口 420、430被引导到微流体通道4中。此外，在公共歧管44的末端处具有用于两个流体Fp F2的一公共出口 45。微流体通道4的大致形状为Y形。
[0151]注意到，进口 420、430可与图2中的进口孔21相匹配，且出口 45可与图2中的出口孔22相匹配。在图2中，微流体通道4设计成使通过单个孔口 21进入并通过单个孔口22离开的仅单一流体循环。
[0152]图5 (b)是流体Fp F2在微流体通道4的不同支管中流动的简图。特别是，注意至IJ，在公共歧管44中，流体Fp F2相互并排按层流方式流动。当流动为层流时，流体不会水力地混合。
[0153]如已知的，如果在该公共歧管504中流动的雷诺数小于临界雷诺数，则可以认为该流动是分等级(层，level)的，可以由流体力学手册容易地确定该临界雷诺数。
[0154]雷诺数是由关系式Re=(V.Dh)/ v定义的无量纲数，其中V是公共歧管44中的流体速度，Dh是公共歧管44的水力直径，并且V是流体的流动粘度。水力直径取决于公共歧管的几何结构。
[0155]考虑到微流体通道的形状，临界雷诺数具有2300的量级。
[0156]考虑到流动的特性，提及一种“同向流动(co-flow)”型供应机构。
[0157]实际上，因为微流体通道40的尺寸为微米级，所以对于通常用于本发明设想的应用的流体和所述流体的流动速度来说，流动是分等级的。
[0158]所述流体FpF2用于在微流体装置I的微流体通道4中流动，两者都与微孔薄膜5接触，但不处于腔室8 (培养腔室)中。
[0159]在微流体通道4与设置在腔室8的底座6上的所述细胞之间输送可刺激活细胞的分子(包含在两种流体F1或者F2中的至少一种中)，然后通过穿过微孔薄膜5扩散到腔室8中来进行。
[0160]更确切地说，首先通过扩散穿过微孔薄膜5、然后扩散穿过腔室8、最后到达腔室8的底座6的上侧61 (即，活细胞所处的侧面61)来执行输送所述分子。
[0161]然而，使腔室中的浓度分布稳定需要花一定时间。特别是，在腔室8的底座6处，稳定时间tstab是h’ 2/D的量级，其中h’是腔室8的高度，并且D是用来刺激腔室8中的目标细胞的分子的扩散系数。应当注意到，为了避免过多的稳定时间，腔室的高度普遍限制到500 μ m0
[0162]图6 (a)到6 (c)显示了当假定为“同向流动”型流体供应时的扩散现象中的几个步骤。处于白色的流体&包含用于计划放置在腔室8的底座61上的活细胞的刺激分子。处于黑色的流体F1是中性的。在图6 (a)中，供应的流体到达微孔薄膜5处并且分子开始扩散到腔室8中。在图6 (b)，处于其中浓度分布为稳定阶段的过渡流态。在图6 (C)，浓度分布已经稳定了。
[0163]很清楚，扩散主要出现在腔室8 (培养腔室)的高度上，即，大致垂直于微流体通道4中的流体Fp F2的流动方向的方向，即使腔室8中的该扩散还出现在其他方向上。
[0164]图5 (c)以剖视图显示了在与微流体装置I的分界面41处发生的情况。
[0165]为此，利用如中性溶液的第一流体F1和如荧光溶液的第二流体F2进行实验。荧光溶液F2包含扩散系数类似于通常用于刺激活细胞的分子的扩散系数。在该情况中，所使用的荧光溶液可以是异硫氰酸荧光素，可以包含一种称为GFPuv (“绿色荧光蛋白质”)的荧光蛋白质或者可以包含一种与右旋糖酐-70MW-若丹明荧光分子有关的蛋白质。这是与若丹明B的荧光分子相联系的蛋白质右旋糖酐-70。
[0166]在微孔薄膜5上方，即在微流体装置I的微流体通道4中，图5 (C)中所示的荧光溶液的浓度分布处于雉堞形(此外，如图6 (c)中的)。实际上，该荧光溶液仅占据微流体通道4的一部分，所述通道4的其他部分被中性溶液占据。
[0167]为了确定在底座6的上侧61处获得的浓度分布，利用属于根据本发明的微流体系统的一光学机构18来观察微流体装置1，被刺激的活细胞可设置在该上侧61上。
[0168]在底座6的上侧61上获得的浓度分布具有“erf”型函数的典型曲线形式。通过中性溶液和荧光溶液扩散穿过微孔薄膜5，然后穿过腔室8来获得所述形式。[0169]利用“同向流动”型流体供应机构50，从而有可在腔室8的底座处获得非常特殊的浓度分布，并从而活细胞将被刺激。
[0170]图7 (a)到7 (C)中示出了微流体通道4的另一形式。
[0171]流体FpF2在两个支管42’、43’中被输送，所述支管都引入到具有三个出口的同一通道44’中，以形成三个管状旋管(非标准的(not referenced))。第一流体？1通过第一出口并被引至第一管状旋管，第二流体F2通过第二出口并被引至第二管状旋管，两个流体F1和F2的混合物最后通过通道44’的中央出口并被引至中央管状旋管。在蛇形管的出口处，流体在具有与根据本发明的微流体装置I的微孔薄膜5的分界面41’的公共歧管45’中结
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[0172]公共歧管45’的端部46’具有用于流体F1、F2的出口。
[0173]图7 (b)是流体FpF2在微流体通道4’的不同支管中流动的简图。不同的流体按层流方式在微流体通道4中流动。
[0174]然后，谈及“三重流动(tr1-flow)”型的流体供应机构。
[0175]图7 (C)以剖视图显示了在分界面41’处的流体特性。用于该目的的实验装置类似于以上所述的用于“同向流动”型的微流体通道4的装置。
[0176]图7 (C)特别显示了微流体通道4’中的浓度分布具有阶梯形状。还显示出，在底座6 (光学上透明的)的上侧61上所获得的浓度分布具有线性中心部分，其可以用于刺激某些目标细胞。
[0177]因此，利用“三重流动”型的该微流体通道4’，在被刺激的活细胞位于其上的覆盖物的中心处应用线性浓度分布。
[0178]根据本发明的微流体系统不限于使用仅根据如上所述的“同向流动”或者“三重流动”型设计的第一微流体通道4、4’。因此，可以依据希望应用在活细胞上的浓度分布来构想其他种类的第一微流体通道。
[0179]因此，根据本发明的微流体系统允许更为容易地控制可刺激例如活细胞的目标的分子的浓度分布。
[0180]因此，流体Fp F2中任何一个流量的变化不会引起应用于活细胞的分子的浓度分布的巨大变化。
[0181]一个理由是:活细胞未设置在微孔薄膜5上，而是设置在腔室8的底座6上。实际上，当将活细胞与薄膜5相对地设置时，穿过腔室8的扩散时间减弱了流体在微流体通道4中流动的可能扰动。
[0182]作为实例，图5 (c)和7 (c)显示了可应用于活细胞的不同的浓度分布。
[0183]根据本发明的微流体系统的设计还显现出了一动态特性，其允许很快地执行多次试验。
[0184]这通过如下所述的按动态方式执行的试验来演示。
[0185]对于所述试验,微孔薄膜5是具有400nm小孔的Whatman Cyclopore型薄膜。培养腔室具有200 μ m的高度h’和Imm的宽度。
[0186]使第一流体F1 (中性溶液)在微通道4中循环，然后使第二流体F2在前述通道4中循环，在该情况中，流体F2是由包含扩散系数与通常用于刺激活细胞的分子的扩散系数相匹配的荧光溶液形成。[0187]图8中示出了三种荧光溶液(荧光素、GFP和Dextran70MW)所获得的结果。
[0188]图8显示了利用例如定位在底座6后面的共焦显微镜的一光学机构所测得的作为时间函数的荧光溶液的标准亮度的变化。在底座6处利用显微镜进行的测量，在该情况中底座6处于玻璃载片中。
[0189]图8中所示三条曲线中每条的原点(t=0s)对应于第二流体F2的循环的起点。
[0190]可以看到，根据荧光溶液的特性，在该玻璃载片上建立浓度分布的时间在几十秒到几分钟之间。逻辑上，该溶液中包含的分子越大，则用于建立的时间越长。
[0191]通常，可看到，与在约为腔室8 (培养腔室)的高度h’的量级的距离上扩散的时间相对照，用于建立的时间比较短的，并且允许以稳定的浓度分布快速地进行实验。
[0192]因为微流体系统允许独立地进行活细胞的培养，所以通常可以在I到2小时之间的时间中快速地进行试验。然后，可以利用另一培养物传送到另一试验中。
[0193]这对于图1中所示的微流体系统是不可能的。实际上，在该情况中，在微流体系统内进行培养，使得进行一次试验需要几天的时间。
[0194]通常，微流体系统包括用于通过底座6对培养腔室8进行可视化的光学装置。当提供所述光学装置时，底座有利地是由光学透明材料制成的。因此，更容易跟踪设置在该底座6上的活细胞对被某些分子刺激的反应。
[0195]图9以局部剖 视图显示了根据本发明的微流体装置的一实施例。图9仅显示了微流体装置的上半部分，需要包括底座(例如可接收活细胞的培养物)和侧壁以在微孔薄膜5下面形成腔室的一组件，以便可以使用微流体装置100。
[0196]微流体装置100具有类似于参见图2描述的微流体装置I的特性，并且在该情况中，可以与“同向流动”或者“三重流动”型的微流体通道40 —起使用。
[0197]微流体通道40可以由如上所述的流体供应机构来供应。
[0198]然而，改进微流体通道的结构。实际上，在该实施例中，微流体通道40设置在多个等级处，这样的话，在该图9中所示的实例中为两等级401、402。每等级包括对应于形成在盖子20中的孔口 201、202的流体进口，具有一公共的流体出口 203。
[0199]使用一种在几个高度上包含微流体通道的微流体装置的优点是其允许应用更复杂的可刺激活细胞的分子的浓度分布。例如，可以设想在腔室8中使用凹形的、凸状的或者周期性的浓度分布，而仍然保持用于流体的有限数量的进口和出口。
[0200]此外，图10显示了利用包括在两等级上的通道4的一微流体装置所获得的模拟结果，以允许获得空间上的周期性的浓度分布。横坐标显示了腔室8的宽度，并且纵坐标显示了刺激分子的标准浓度。不同的实曲线显示了模拟的浓度分布随时间的变化直到稳定。虚曲线对应于由荧光素的流动所获得的实验数据。
[0201]特别是，为了实现周期性应用一给定的浓度分布，可以设想在微流体通道的第一等级40i (通过孔口 202)中利用“同向流动”型供应机构引入流体F1J2，然后例如利用“同向流动”型供应机构每隔一定时间通过孔口 201在第二等级402中引入其他流体F’ ^Fj20
[0202]因为所使用的制造工艺使得这是特别可能的，其允许在微孔薄膜5之上构造出任何形状的微流体通道。
[0203]很清楚，第一通道40可以具有超过两等级，这取决于希望应用的浓度分布的复杂度。[0204]图8中所示的制造结构是基于如上所述的工艺改编的。
[0205]因此，执行步骤(a)和(b)生产出图11 (a)中所示的结构200。用于该步骤中的衬底为附图标记20’，并且侧壁30〃在其底部处被微孔薄膜5封闭。
[0206]然后，利用类似于以上给出的步骤(a)到(C)的步骤生产图11 (b)中所示的结构200’。结构200’包括固定到设有三个孔口 201、202 (流体进口)和202 (或者流体的公共出口)的盖子3上的四个第一侧壁30、30〃’。在该情况中，在侧壁30的底部处未设置微孔薄膜，因为微流体通道40的等级40i必须与前述微流体通道40的第二等级402处于流体连通。
[0207]然后，将结构200和200’中的一个固定到另一个上，如图11 (C)中所示。可以通过光照或者加热来执行该固定，以便将侧壁30〃和30〃’固定到一起以形成侧壁30’。由此，该步骤允许形成微流体通道40的第二等级402。
[0208]最后，对于包括两个光致固化和/或热固化树脂的第二侧壁的组件执行类似于步骤(d)的一步骤，以在微孔薄膜下面形成腔室。为了该目的，执行如上参见图4 (a)到4 (C)所述的重复的工艺步骤(ei)到(e3)。
[0209]应当注意到，前述的装置1、100包括其中设置活细胞的腔室8(当粘附到微流体通道4上时自然地封闭)。该腔室8可包括培养凝胶，虽然有利地不会是所述情况。此外，该腔室可以由微流体通道来代替，因此有利地包括横向地设置的开口。在该后一种情况中，微流体装置则包括其中流体循环的微流体通道4、40和其中设置活细胞的另一微流体通道。
[0210]因此，根据本发明的微流体系统提供了多种可能性。
[0211]特别是，有可能应用一种用于刺激活细胞的、在所述活细胞处具有所需形状(以上给出的实例显示出“erf”函数形式的梯度或者装置1、100的腔室8的中心部分中直线形状的梯度)的分子浓度梯度。在腔室8中建立了浓度分布，将活细胞设置在远离微孔薄膜5的装置的底座上，且更准确地是与腔室8内的该薄膜5相反(可用一微流体通道来代替该腔室)。
[0212]因此，在流体供应机构处不进行该分布的应用。流体供应机构则是简单的并且仅供应流体，所述流体的流量可在应用于活细胞的浓度分布没有任何明显变化的情况下稍微变化。因此，更容易控制活细胞处的浓度分布，并且较少受微流体系统以外的潜在干扰的影响。
[0213]因此，在经过主要取决于腔室的高度和刺激分子的扩散系数的稳定时间之后，可在腔室8中，特别是可在该腔室的底部61处获得稳定的浓度分布。
[0214]根据本发明的微流体装置的制造工艺还允许使用由光学透明材料制成的底座，例如可以使用根据标准工艺在其上进行细胞培养的玻璃载片。因此，可以利用定位在玻璃载片后面的一光学可视化机构来容易地进行活细胞特性(生长等)的观测。
[0215]因为由光学透明材料制成的底座可以非常薄，所以可以在很高的空间清晰度下进行光学观察。例如，可以使用厚度为150 μ m的玻璃载片形成的底座来执行由例如光敏化局部显微术(PALM)或者受激发射减损显微术(STED)的技术所获得的高分辨率或者甚至超高分辨率的荧光显微术。
[0216]同时，该可视化机构允许了解应用于活细胞的刺激分子的浓度分布。因此，更容易获得所观测到的活细胞的特性与应用于被进行实验的活细胞的浓度分布之间的关系。[0217]最后，可以快速地进行多次试验。
[0218]本发明特别是可用于活细胞的培养、观测和研究的生物学领域中。特别是，可以确定神经细胞对某些分子的趋化性反应，例如以建立起神经网络。特别是，还可以测量癌细胞对用于化学疗法的分子的反应。还可以使用所述微流体系统来制造生物芯片。
[0219]本发明可用于其他应用领域，例如用于在美容术中确定某些分子的毒性阈值。
【权利要求】
1.一种用于控制可刺激例如由一组活细胞形成的目标的分子的浓度分布的微流体系统，所述系统包括: -微流体装置(1、100)，其包括至少一个微流体通道(4、40)，所述微流体通道至少具有: ο第一支管(42、42’ )，用于第一流体(F1),设有进口孔(21、201、420)，ο第二支管(43、43’)，用于包含可刺激所述目标的分子的第二流体(F2),设有进口孔(430)； ο公共歧管(44、45’)，用于所述流体(Fp F2),设有用于所述流体的出口孔(22、203、45)； -至少一个机构，连接到所述微流体通道(4、40)的进口孔，以用于为所述通道供应所述流体(F1 ；F2)； -至少一个腔室(8)或者另一微流体通道，具有用于接收所述目标的底座(6);以及-至少一个微孔薄膜(5)，设置在所述公共歧管(44、45’)的分界面(41、41’)处，以将所述腔室(8)或者另一微流体通道与所述微流体通道(4、40)分隔开， 所述微孔薄膜(5)远离所述底座(6)设置，以使得当所述供应机构向所述微流体通道(4、40)供应所述流体(FpF2)时，可刺激所述目标的分子在经过所述微孔薄膜(5、50)，通过所述腔室(8)或者另一微流体通道之后，然后扩散以便控制该腔室(8)或者该另一微流体通道中的浓度分布。
2.根据权利要求1所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道(4、40)包括由选自于以下物质的材料制成的盖子(2、20):玻璃或硅、非弹性体的光致交联聚合物、金属、电导体或者半导体的合金、陶瓷、石英、蓝宝石、弹性体。
3.根据前述权利要求中一项所述的系统，其特征在于，用于流体的所述至少一个进口孔(21、201、202 )和所述至少一个出口孔(22、203 )形成在所述盖子(2、20 )中。
4.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道(4、40)包括由光致固化和/或热固化的树脂制成的至少一个壁(3、30、30’)。
5.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，所述微孔薄膜(5)在所述微流体通道(4、40)的侧壁(3、30、30’ )上横向地延伸以封闭所述通道的底部。
6.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道(40)设置在几等级上，每个等级具有用于至少一种流体的至少一个进口孔(201、202 )。
7.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，所述腔室(8)的底座(6)或者所述另一微流体通道的底座(6)由光学透明材料制成。
8.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，所述腔室(8)或者所述另一微流体通道包括由光致固化和/或热固化的树脂制成的侧壁(7a、7b)。
9.根据前述权利要求所述的微流体系统，其特征在于，所述微孔薄膜(5)在所述腔室(8)的侧壁(7a、7b)或者所述另一微流体通道的侧壁(7a、7b)之间横向地延伸以封闭所述腔室或者所述另一微流体通道的顶部。
10.根据前述权利要求中一项所述的微流体通道，其特征在于，所述微孔薄膜(5)由选自于以下物质的材料制成:玻璃、聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、石英、硅、二氧化硅或者碳化硅。
11.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，所述微孔薄膜(5)包括密度在IO3到101°孔/cm2之间的小孔。
12.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，所述小孔具有在0.05 μ m到12 μ m之间的水力直径，优选在0.05 μ m到3 μ m之间的水力直径。
13.根据前述权利要求中一项所述的微流体系统，其特征在于，提供光学可视化机构(18)。
14.根据前述权利要求所述的微流体系统，其特征在于，所述光学可视化机构(18)使用光敏化局部显微 术技术或者受激发射减损显微术技术。
【文档编号】B01L3/00GK103732325SQ201280021743
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年3月2日 优先权日:2011年3月4日
【发明者】M·达昂, M·莫雷尔, J-C·加拉, V·施图德, D·巴尔托洛 申请人:国立科学研究中心, 巴黎高等师范学院, 皮埃尔-玛丽-居里大学(巴黎第六大学), Espci乔治·夏帕克基金, 波尔多第二大学