分子诊断平台的制作方法

分子诊断平台的制作方法
【专利摘要】一种混合微滴的方法，所述方法包括：在表面上提供微滴，使所述微滴形成具有底部区域和两个端部的第一“U”形状，且同时合并所述端部并使所述微滴在所述底部区域处分离，以形成与所述第一“U”形状实质上相反的第二“U”形状。
【专利说明】分子诊断平台
[0001]I资助信息
[0002]本发明在国家卫生研究院授予的A1065169下以政府支持完成。美国政府具有本发明的某些权利。
[0003]2相关申请
[0004]本专利申请涉及且要求2011年5月2日提交的标题为“Molecular DiagnosticsPlatform that uses Digital Microfluidics and Multiplexed Bead Detection，，的美国临时专利申请号61/481，508的优先权，所述临时专利申请的整个公开内容通过引用并入本文。
[0005]3 背景
[0006]微滴执行机构通常包括配置为形成用于进行微滴操作的表面或间隙的一个或多个基板。一个或多个基板建立用于进行微滴操作的微滴操作表面或间隙，且还可以包括布置成进行微滴操作的电极。微滴操作基板或在基板之间的间隙可以被涂覆或填充有不与形成微滴的液体混合的填充流体。
[0007]微滴执行机构被用在各种应用中，包括分子诊断分析比如基于核酸的分析和免疫分析。在一个实例中，使用基于核酸的测试比如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)分析来识别呼吸道病毒。由于单个样品可包括待评估的多种分析物，存在对在微滴执行机构上用于使分子诊断分析多重化的改进方法的需要。
[0008]4 定义
[0009]如本文所使用的，以下术语具有所指示的意义。
[0010]关于一个或多个电极的“激活”意指影响在有微滴的情况下导致微滴操作的一个或多个电极的电气状态的变化。
[0011]关于微滴执行机构上的珠子(bead)，“珠子”意指能够与微滴执行机构上或在微滴执行机构附近的微滴相互作用的任何珠子或颗粒。珠子可以具有各种形状中的任一种，比如球形、大体球形、蛋形、圆盘形、立方体及其它三维形状。珠子可能例如能够在微滴执行机构上的微滴中被运输，或否则以允许微滴执行机构上的微滴接触微滴执行机构上的珠子和/或接触脱离微滴执行机构的珠子的方式关于微滴执行机构被配置。珠子可以使用各种材料——包括例如树脂和聚合物——制成。珠子可以是任何合适的尺寸，包括例如微珠、微粒、纳米珠和毫微粒。在一些情况下，珠子是磁性响应的；在其它情况下，珠子不是显著磁性响应的。对于磁性响应的珠子，磁性响应材料可以构成实质上整个珠子或仅构成珠子的一种组分。除了别的以外，珠子的剩余部分还可以包括聚合材料、涂层和允许分析试剂的附着的部分。合适的磁性响应珠子的实例包括流式细胞仪微珠、聚苯乙烯微粒和毫微粒、官能化的聚苯乙烯微粒和毫微粒、涂覆的聚苯乙烯微粒和毫微粒、二氧化硅微珠、荧光微球和纳米球、官能化的荧光微球和纳米球、涂覆的荧光微球和纳米球、染色的微粒和毫微粒、磁性微粒和毫微粒、超顺磁性微粒和毫微粒(例如，可从加利福尼亚州Carlsbad的Invitrogen公司得到的DYNABEADS?颗粒)、突光微粒和毫微粒、涂覆的磁性微粒和毫微粒、铁磁性的微粒和毫微粒、涂覆的铁磁性微粒和毫微粒及在2005 年 11 月 24 日公布的标题为 “Multiplex flow assays preferably with magneticparticles as solid phase”的美国专利公布号20050260686、2003年7月17日公布的标题为 “Encapsulation of discrete quanta of fluorescent particles，，的美国专利公布号 20030132538、2005 年 6 月 2 日公布的标题为 “Multiplexed Analysis of ClinicalSpecimens Apparatus and Method” 的美国专利公布号 20050118574、2005 年 12 月 15 日公布的标题为“Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods ofUsing Same”的美国专利公布号20050277197、2006年7月20日公布的标题为“MagneticMicrospheres for use in Fluorescence-based Applications，，的美国专利公布号20060159962中所描述的那些；所述专利公布的全部公开内容通过引用并入本文，为了它们的涉及珠子及磁性响应材料和珠子的教导。珠子可以与生物分子(配体)预先连接。配体可以为例如抗体、蛋白质或抗原、DNA/RNA探针或具有对期望目标的亲和力的任何其它分子。用于固定磁性响应珠子和/或非磁性响应珠子和/或使用珠子进行微滴操作试验的微滴执行机构技术的实例在下列专利申请中被描述:2006年12月15日提交的标题为“Droplet-Based Particle Sorting”的美国专利申请号 11/639，566 ；2008 年 3 月 25 日提交的标题为 “Multiplexing Bead Detection in a Single Droplet” 的美国专利申请号61/039，183 ;2008 年 4 月 25 日提交的标题为 “Droplet Actuator Devices and DropletOperations Using Beads”的美国专利申请号61/047，789 ;2008年8月5日提交的标题为“Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads” 的美国专利申请号61/086，183 ;2008 年 2 月 11 日提交的标题为 “Droplet Actuator Devices and MethodsEmploying Magnetic Beads”的国际专利申请号 PCT/US2008/053545 ;2008 年 3 月 24 日提交的标题为“Bead-based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation，，的国际专利申请号PCT/US2008/058018 ;2008年3月23日提交的标题为“Bead Sorting on aDroplet Actuator”的国际专利申请号PCT/US2008/058047 ;及2006年12月11日提交的标题为“Droplet-based Biochemistry”的国际专利申请号PCT/US2006/047486,所述专利申请全部个公开内容通过引用并入本文。在使本发明的多重化方面中可以采用珠子的特征。具有适合于多重化的特征的珠子以及检测并分析从此类珠子发射的信号的方法的实例可以在以下专利申请中找到:2008年12月11日公布的标题为“Systems and Methodsfor Multiplex Analysis of PCR in Real Time” 的美国专利申请号 20080305481 ;2008年 6 月 26 日公布的标题为 “Methods and Systems for Dynamic Range Expansion，，的美国专利公布号20080151240 ;2007年9月6日公布的标题为“Methods, Products, andKits for Identifying an Analyte in a Sample” 的美国专利公布号 20070207513 ；2007年 3 月 22 日公布的标题为 “Methods and Systems for Image Data Processing” 的美国专利公布号 20070064990 ；2006 年 7 月 20 日公布的标题为 “Magnetic Microspheres foruse in Fluorescence-based Applications” 的美国专利公布号 20060159962 ;2005 年
12月 15 日公布的标题为 “Microparticles with Multiple Fluorescent Signals andMethods of Using Same”的美国专利公布号20050277197 ;及2005年6月2日公布的标题为“Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method”的美国专利公布号 20050118574。
[0012]“微滴”意指在微滴执行机构上的液体的体积。通常，微滴至少部分地被填充流体限制。例如，微滴可以被填充流体完全包围或可以被填充流体和微滴执行机构的一个或多个表面限制。作为另一实例，微滴可以被填充流体、微滴执行机构的一个或多个表面及大气限制。作为又一实例，微滴可以被填充流体和大气限制。例如，微滴可以是含水的或非水的，或可以是包括含水组分和非水组分的混合物或乳液。微滴可以采用各种形状；非限制性实例包括大体圆盘形、蛞蝓形、切去顶端的球体、椭圆体、球形、部分压缩的球体、半球形、卵形、圆柱形、此类形状的组合及在微滴操作比如合并或分离期间形成的或作为此类形状与微滴执行机构的一个或多个表面接触的结果而形成的各种形状。对于可能受到使用本发明的方法的微滴操作的微滴流体的实例，参见2006年12月11日提交的标题为“Droplet-Based Biochemistry”的国际专利申请号PCT/US06/47486。在各种实施方式中，微滴可以包括生物样品，比如全血、淋巴液、血清、血浆、汗、眼泪、唾液、痰、脑脊液、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、渗出液、分泌液、脓囊液、胆汁、尿、胃液、肠液、排泄物样品、包含单个或多个细胞的液体、包含细胞器的液体、流态化的组织、流态化的有机体、包含多细胞化有机体的液体、生物拭样和生物废液。而且，微滴可以包括试齐IJ，比如水、去离子水、盐溶液、酸性溶液、碱性溶液、洗涤剂溶液和/或缓冲液。微滴内容物的其它实例包括试剂，比如用于生化试验比如核酸扩增试验、基于亲和力的分析试验、酶分析试验、定序试验和/或用于分析生物流体的试验的试剂。
[0013]“微滴执行机构”意指用于操纵微滴的装置。对于微滴执行机构的实例，参见Pamula 等人于 2005 年 6 月 28 日发布的标题为 “Apparatus for Manipulating Dropletsby Electrowetting-Based Techniques” 的美国专利 6，911，132 ； Pamu I a 等人于 2006年 I 月 30 日发布的标题为 “Apparatuses and Methods for Manipulating Dropletson a Printed Circuit Board” 的美国专利申请号 11/343，284 ;Pollack 等人于 2006年12月11日提交的标题为“Droplet-Based Biochemistry”的国际专利申请号PCT/US2006/047486 ;Shenderov 于 2004 年 8 月 10 日发布的标题为“Electrostatic Actuatorsfor Microfluidics and Methods for Using Same” 的美国专利 6，773，566 及于 2000 年
I月 24 日发布的标题为 “Actuators for Microfluidics Without Moving Parts” 的美国专利6，565，727 ；Kim等人于2003年I月27日提交的标题为“Electrowetting-drivenMicropumping”的美国专利申请号10/343, 261 ;2006年I月23日提交的标题为“Methodand Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from aNozzle”的美国专利申请号ll/275，668、2009年5月14日提交的标题为“Method for UsingMagnetic Particles in Droplet Microfluidics” 的美国专利申请号 12/465, 935 ；2009年 4 月 30 日提交的标题为 “Method and apparatus for real-time feedback controlof electrical manipulation of droplets on chip，，的美国专利申请号 12/513，157 ;Velev 于 2009 年 6 月 16 日发布的标题为 “Droplet Transportation Devices andMethods Having a Fluid Surface” 的美国专利 7，547，380 ;Sterling 等人于 2007 年 I月 16 日发布的标题为 “Method，Apparatus and Article for Microfluidic Control viaElectrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like，，的美国专利7，163,612 ;Becker和Gascoyne等人于2010年I月5日发布的标题为“Methodand Apparatus for Programmable fluidic Processing” 的美国专利号 7，641，779 和于2005 年 12 月 20 日发布的标题为“Method and Apparatus for Programmable fluidicProcessing”的美国专利号6，977，033 ;Decre等人于2008年2月12日提出的标题为“System for Manipulation of a Body of Fluid” 的美国专利 7，328，979 ;Yamakawa等人于2006年2月23日公布的标题为“Chemical Analysis Apparatus”的美国专利公布号 20060039823 ;Wu 于 2008 年 12 月 31 日公布的标题为 “Digital MicrofluidicsBased Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes，，的国际专利公布号W0/2009/003184 ;Fouillet 等人于 2009 年 7 月 30 日公布的标题为“Electrode AddressingMethod”的美国专利公布号20090192044 ;Fouillet等人于2006年5月30日发布的标题为“Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line byElectrostatic Forces”的美国专利 7, 052, 244 ；Marchand 等人于 2008 年 5 月 29 日公布的标题为“Droplet Microreactor”的美国专利公布号20080124252 ；Adachi等人于2009年12月31日公布的标题为“Liquid Transfer Device”的美国专利公布号0090321262 ；Roux等人于 2005 年 8 月 18 日公布的标题为 “Device for Controlling the Displacement ofa Drop Between two or Several Solid Substrates” 的美国专利公布号 20050179746 ；Dhindsa等人的“Virtual Electrowetting Channels:Electronic Liquid Transport withContinuous Channel Functionality，，(Lab Chip, 10:832 - 836 (2010));上述专利的公开内容及其优选权文件通过弓I用并入本文。某些微滴执行机构将包括底部基板、与基板相关联的微滴操作电极、在基板和/或形成微滴操作表面的电极顶上的一个或多个电介质和/或疏水层，以及可选地，从微滴操作表面分隔开一间隙的顶部基板。在一些情况下，底部基板和顶部基板可以被形成为一个整体部件。一个或多个参考电极可以被设置在顶部基板和/或底部基板上和/或在间隙中。在各种实施方式中，微滴通过微滴执行机构的操纵可以是电极介导的，例如，电湿润介导的或双向电泳介导的或库伦力介导的。控制可用在本发明的微滴执行机构中的流体流的其它方法的实例包括引起流体动力射流压力的装置，比如基于下列原理的装置:机械原理(例如，外部注射器泵、气动膜泵、振动膜泵、真空装置、离心力、压电/超声波泵及声力);电气或磁性原理(例如，电渗流、电动泵、铁磁流体塞、电流体动力泵、使用磁力的吸引或排斥及磁流体动力泵)；热力学原理(例如，气泡产生/相变引起的体积膨胀)；其它类型的表面湿润原理(例如，电湿润和光电湿润以及以化学方法、用热的方法、在结构上和放射性地引起的表面张力梯度);重力；表面张力(例如，毛细管作用);静电力(例如，电渗流)；离心流(基板被布置在紧凑的圆盘上且旋转)；磁力(例如，振荡离子引起流动);磁流体动力；及真空或压力差。在某些实施方式中，在本发明的微滴执行机构中可以采用前述技术中的两种或更多种的组合。
[0014]“微滴操作”意指在微滴执行机构上的微滴的任何操纵。例如，微滴操作可以包括:将微滴装入到微滴执行机构中；分配来自源微滴的一个或多个微滴；使微滴分离、分开或分成两个或更多个微滴；将微滴从一个位置运输到任何方向上的另一位置；将两个或更多个微滴合并或组合成单个微滴；稀释微滴；混合微滴；搅动微滴；使微滴变形；将微滴保持在合适的位置；培养微滴；加热微滴；蒸发微滴；冷却微滴；处理掉微滴；将微滴运送出微滴执行机构；本文所描述的其它微滴操作；和/或前述操作的任何组合。术语“合并(merge)”、“合并(merging)”、“组合(combine)”、“组合(combining)”及类似词语用于描述从两个或更多个微滴产生一个微滴。应理解，当关于两个或更多个微滴使用这样的术语时，可以使用足以导致两个或更多个微滴组合成一个微滴的微滴操作的任何组合。例如，“合并微滴A和微滴B”可以通过运送微滴A以接触静止的微滴B、运送微滴B以接触静止的微滴A或运送微滴A和B以彼此接触来实现。术语“分离”、“分开”和“分成”并非用来暗示关于因而得到的微滴的体积(即，因而得到的微滴的体积可以是相同的或不同的)或因而得到的微滴的数目(因而得到的微滴的数目可以为2个、3个、4个、5个或更多个)的任何特定结果。术语“混合”是指导致微滴内的一种或多种组分的较均匀的分布的微滴操作。“装入”微滴操作的实例包括微量透析装入、压力辅助装入、机器人装入、被动装入及移液管装入。微滴操作可以是电极介导的。在一些情况下，通过使用表面上的亲水和/或疏水区域和/或通过物理障碍物来进一步便于微滴操作。对于微滴操作的实例，参见上文在“微滴执行机构”的定义下引用的专利和专利申请。
[0015]“填充流体”意指与微滴执行机构的微滴操作基板相关的流体，所述流体与微滴不能充分混合，以使微滴相受到电极介导的微滴操作。例如，填充流体可以为低粘度的油比如硅油。填充流体的其它实例在下列申请中被提供:2006年12月11日提交的标题为“Droplet-Based Biochemistry” 的国际专利申请号 PCT/US2006/047486、2008 年 8 月 8 日提交的标题为 “Use of additives for enhancing droplet actuation” 的国际专利申请PCT/US2008/072604、2007 年 5 月 17 日提交的标题为“Electrowetting Devices”的美国专利公布号20080283414，所述专利的全部公开内容通过引用并入本文。填充流体可以填充微滴执行机构的整个间隙或可以涂覆微滴执行机构的一个或多个表面。填充流体可以是导电的或不导电的。
[0016]关于磁性响应珠子的“固定”意指珠子实质上被限制在微滴执行机构上的微滴中或填充流体中的实质上的合适位置中。例如，在一个实施方式中，固定的珠子可以被充分限制在合适的位置中，以允许在微滴上致执行分离操作，产生具有实质上所有珠子的一个微滴和实质上没有珠子的一个微滴。
[0017]“磁性响应”意指响应于磁场。“磁性响应珠子”包括磁性响应材料或由磁性响应材料组成。磁性响应材料的实例包括顺磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料及变磁性材料。合适的顺磁性材料的实例包括铁、镍和钴以及金属氧化物，比如Fe304、BaFe12O19^ CoO, NiO,Mn2O3、Cr2O3 和 CoMnP。`
[0018]如在本文用于指微滴和/或微滴内的磁性响应珠子的“运送到磁体的磁场中”、“朝着磁体运送”及类似短语用来指运送到实质上能够吸引微滴中的磁性响应珠子的磁场的区域中。类似地,如在本文用于指微滴和/或微滴内的磁性响应珠子的“远离磁体或磁场运送”、“运送出磁体的磁场”及类似短语用来指远离实质上能够吸引微滴中的磁性响应珠子的磁场的区域运送，不管微滴或磁性响应珠子是否完全从磁场中移除。将认识到，在本文所描述的此类情况中的任一种情况下，微滴可以朝着或远离磁场的期望区域被运送，和/或磁场的期望区域可以朝着或远离微滴被移动。对电极、微滴或磁性响应珠子在磁场或类似物“内”或“中”的提及用来描述以下情况:其中电极以允许电极将微滴运送到磁场的期望区域中和/或远离磁场的期望区域运送微滴的方式被定位，或微滴或磁性响应珠子被定位在磁场的期望区域中，在每一种情况下，其中在期望区域中的磁场能够实质上吸引微滴中的任何磁性响应珠子。类似地，对电极、微滴或磁性响应珠子在磁场或类似物的“外部”或“远离”磁场或类似物的提及用来描述以下的情况:其中电极以允许电极远离磁场的某一区域运送微滴的方式被定位，或微滴或磁性响应珠子被定位成远离磁场的某一区域，在每一种情况下，其中在这样的区域中的磁场实质上不能吸弓I微滴中的任何磁性响应珠子。
[0019]关于冲洗珠子的“冲洗”意指减少与珠子接触或暴露于珠子的一种或多种物质的量和/或浓度，所述物质来自与珠子接触的微滴。物质的量和/或浓度的减少可以是部分的，实质上全部的或甚至全部的。物质可以是各种物质中的任一种；实例包括用于进一步分析的目标物质和不想要的物质，比如样品的组分、污染物和/或过量的试剂。在一些实施方式中，冲洗操作以与磁性响应珠子接触的起始微滴开始，其中微滴包括物质的初始量和初始浓度。可以使用各种微滴操作来进行冲洗操作。冲洗操作可以产生包括磁性响应珠子的微滴，其中微滴具有物质的总量和/或浓度，所述物质的总量和/或浓度小于物质的初始量和/或浓度。合适的冲洗技术的实例在Pamula等人的于2008年10月21日被授权的标题为 “Droplet-Based Surface Modification and Washing” 的美国专利 7，439，014 中被描述，所述专利的整个公开内容通过弓I用并入本文。
[0020]在整个说明书中关于微滴执行机构的部件的相对位置例如微滴执行机构的顶部基板和底部基板的相对位置使用术语“上部”、“底部”、“上方”、“下方”和“在....上”。将认识到，微滴执行机构是功能性的，而不管其在空间中的方向。
[0021]当以任何形式的液体(例如，微滴或连续主体，不管是移动的还是静止的)被描述为在电极、阵列、基质或表面“上”、“处”或“上方”时，这样的液体可以直接接触电极/阵列/基质/表面，或可以接触在液体和电极/阵列/基质/表面之间插入的一个或多个层或膜。
[0022]当微滴被描述成在微滴执行机构“上”或“装在微滴执行机构上”时，应理解，微滴以便于使用微滴执行机构的方式布置在微滴执行机构上，以在微滴上进行一个或多个微滴操作，微滴以便于感测微滴的属性或来自微滴的信号的方式被布置在微滴执行机构上，和/或微滴在微滴执行机构上受到微滴操作。
[0023]5附图简述
[0024]图1示出采样-反馈数字微流体分子诊断平台的实例的透视图；
[0025]图2示出适合于单个生物样品中的一个或多个病原体的采样-反馈多重检测的微滴执行机构的另一实例的透视图；
[0026]图3示出用于xTAG珠子的多重检测的成像系统的透视图；
[0027]图4示出用于生物样品中的呼吸道病毒的采样-反馈检测的试验的实例的流程图；
[0028]图5示出图1的微滴执行机构的顶视图且示出适合用于执行图4的呼吸道病毒检测试验的微滴执行机构架构的实例；
[0029]图6显示在工作台上和在微滴执行机构上执行的xTAG RVP分析的比较的条形图；以及
[0030]图7A和图7B示出微滴执行机构的实例的一部分的侧视图且示出使用在单个微滴中的多种类型的珠子使免疫分析多重化的过程。
[0031]6 描述
[0032]本发明提供使用数字微流体和用于多重分子测试的珠子技术的分子诊断平台。更具体地，通过结合检测系统使用微滴执行机构，可使用在单个样品微滴中的多种类型的珠子(编码的珠子)来使采样-反馈分子分析多重化。微滴执行机构装置使用大的输入样品体积(例如，约I毫升UL))且提供来自单个样品的多种目标分析物(例如，核酸)的快速捕获和浓缩，用于在同一微滴执行机构上的随后的分子诊断分析(例如，RT-PCR)。本发明的微滴执行机构是便宜的和使用简单的一次性装置，其在各种临床背景——包括医院实验室和在床边监护——提供高质量的测试。
[0033]在一个实施方式中，本发明的分子诊断平台和方法在小于约60分钟或小于约30分钟或小于约20分钟内提供在单个生物样品(例如，鼻咽样品)中的呼吸道病毒的多重检测。
[0034]在另一实施方式中，本发明的分子诊断平台和方法提供并行地执行的高流通量分子诊断，即，多个不同测试(例如，xMAP珠子阵列面板)。
[0035]在又一实施方式中，本发明提供在微滴执行机构中使用包含多种类型的珠子的单个微滴进行多重免疫分析的方法。
[0036]6.1多重分子诊断平台
[0037]本发明的分子诊断平台包括数字微流体液体处理技术和基于珠子的分析物捕获技术，其用于多重分子分析(例如，核酸测试、免疫分析)。分子诊断平台使用用于基于珠子的区别和在生物样品中的一种或多种分析物的检测的成像技术。
[0038]6.1.1数字微流体
[0039]通过微滴的表面张力(电湿润)的电控制，数字微流体技术在离散的微滴上进行微滴操作。微滴可以被夹在两个基板一分隔开间隙的底部基板和顶部基板一之间。例如，底部基板可以是具有电力地可寻址的电极的布置的印刷电路板(PCB)。例如，顶部基板可以是具有由例如导电油墨或铟锡氧化物制成的参考电极平面的注射成型的塑料顶部基板。底部基板和顶部基板可以被涂覆有疏水材料。围绕微滴的空间(例如，在底部基板和顶部基板之间的间隙)可以填充有不相混的惰性流体比如硅油，以防止微滴的挥发且便于它们在装置内的运输。在电压被施加到底部基板上的控制电极时形成的电场减小微滴和电极之间的界面张力。这个效应可用于使用通过激活沿着连续电极的任何路径在底部基板上的控制电极的模式而建立的表面能量梯度来运输微滴。通过改变电压激活的模式，可以影响其它微滴操作；实例包括微滴的合并、分离、混合和分配。
[0040]图1示出采样-反馈数字微流体分子诊断平台100的实例的透视图。分子诊断平台100可以包括与成像系统112组合的微滴执行机构110。在一个实施方式中,微滴执行机构110被配置为用于单个样品的合并的样品制备和核酸测试。微滴执行机构110可以包括分隔开一间隙的底部基板114和顶部基板116。例如，底部基板114可以由PCB、塑料、硅或其它实质上不导电的或绝缘的基板形成。例如，顶部基板116可以由模塑材料比如注射成型的塑料形成，或可以由PCB、塑料、硅形成，或甚至由导电基板形成。分配储器可以被合并至IJ顶部基板116中。例如，储器可以被配置为用于制备并分配样品流体(例如，ImL鼻咽拭样洗脱物)的样品分配储器118和一个或多个试剂分配储器120，S卩，用于分配不同的试剂流体的试剂分配储器120a至120f。样品分配储器118包括用于装入样品流体的样品输入口122和用于装入样品制备试剂(例如，溶解缓冲液、核酸捕获珠子)的试剂输入口 124。样品分配储器118可以具有足够的尺寸，以包含大体积例如约1.5mL的流体。样品分配储器118和试剂分配储器120与分配电极对齐，且通过微滴操作电极(例如，电湿润电极)的布置例如路径或阵列而相互连接。微滴操作是在间隙内的这些电极顶部上进行的。参考图5较详细地描述分配电极和微滴操作电极的布置。检测窗口 126被包括在顶部基板116中。检测窗口 126可以被配置成将来自间隙内的信号传输到传感器和/或将来自外部源的电磁能量传输到间隙中。合适的透明度可以改变。窗口可以被形成为引导和/或过滤光，例如作为排除某些波长的透镜或过滤器。在操作中，检测窗口 126可以位于成像系统112附近。参考图3描述成像系统112的实例。
[0041]图2示出适合于单个生物样品中的一个或多个病原体的采样-反馈多重检测的微滴执行机构200的另一实例的透视图。微滴执行机构200可以包括在其至少一个或多个区域中分隔开一间隙的底部基板210和底部基板212。例如，底部基板210可以是PCB或其它合适的基板。底部基板210可以包括微滴操作电极241 (例如，电湿润电极)的布置。微滴操作在微滴操作表面上在微滴操作电极214的顶部上进行。电接触件216的布置被设置在底部基板210上，用于电气地控制微滴执行机构200的电极241或其它部件，比如传感器、加热器、电磁体、二极管等。例如，顶部基板212可以由模塑材料比如注射成型的塑料或其它合适的材料形成。分配储器218可以被合并到顶部基板212中。例如，分配储器218可以被配置为用于分配样品流体(例如，ImL鼻咽拭样洗脱物)的样品分配储器218和一个或多个试剂分配储器220，即，用于分配不同的试剂流体的试剂分配储器220a至220g。样品分配储器218和试剂分配储器220与分配电极对齐，且通过微滴操作电极214的布置例如路径或阵列而相互连接。
[0042]6.1.2基于珠子的分析物捕获
[0043]使用在单个样品微滴中的多种类型的分析物捕获珠子(编码的珠子)可使采样反馈分子分析多重化。每一种类型的分析物捕获珠子具有用于容易地区分开一种类型的珠子和另一种类型的珠子的识别特征。例如，各种类型的分析物捕获珠子可以按照颜色、荧光、尺寸、密度、表面性质、对磁场的响应性、放射性及其任何组合来区分。分析物捕获珠子可以被涂覆有对特定生物分析(例如，核酸测试、免疫分析)特定的试剂(例如，寡核苷酸序列、抗体、多肽、受体)。在优选的实施方式中，分析物捕获珠子是磁性响应捕获珠子。
[0044]参考图7，较详细地描述使在包含不同类型的珠子的单个微滴中的免疫分析多重化的实例。
[0045]6.1.2.1呼吸道病毒的检测
[0046]急性的呼吸道感染是世界范围内急性疾病的主要起因且依然是婴儿和幼儿死亡率的最重要起因。目前，存在几种市场上可购买得到的基于PCR的多重呼吸道病毒面板分析，然而它们中的大多数被分类为CLIA高复杂性，仅在某些实验室可利用，且可能花费多于一天来获得结果。获得结果的时间对于可治疗的患者是关键的，因为抗病毒药物仅在感染的前24小时内有效。通过帮助控制流行病感染，这些病原体的快速且准确的识别不仅对于单独患者的治疗而且对于公共健康都是关键的。此外，由于不断出现呼吸道病毒的新变体，现在，实验室面临着检测多达20种可引起急性呼吸道疾病的不同病毒的挑战。这些呼吸道病毒中的一些具有非常特定的治疗物，比如用于流感的奥塞米韦或扎那米韦、用于鼻病毒的普来可那立和用于呼吸道合胞病毒(RSV)的预防药帕利珠单抗。感染控制实践在病毒之间也显著不同，且一些是可向公共卫生机构报告的。
[0047]本发明的装置和方法以足够的灵敏性和特异性提供多种临床上相关的病毒的床边监护检测，以指导治疗和感染控制程序。[0048]在一个实施方式中，颜色编码的珠子(例如，改变荧光染料的量)可以被涂覆有寡核苷酸序列，用于捕获特定的目标DNA序列(核酸捕获珠子)。在优选的实施方式中，颜色编码的珠子是磁性响应珠子。可以组合任何数目的不同核酸捕获珠子，用于单个样品微滴中的不同目标序列的多重核酸测试。适合于用在数字微流体核酸测试流体中的磁性响应核酸捕获珠子的一个实例是xMAP珠子微阵列(Luminex)。xMAP珠子(例如，磁性响应的MagPlex?珠子)通过改变两种荧光染料(例如，红色和红外的)的量被内部地颜色编码且被涂覆有对特定生物分析特定的试剂(例如，标记的寡核苷酸序列)。连接到报道分子的第三荧光团(例如，藻红蛋白)用于量化在珠子表面处的生物分子相互作用。
[0049]在一个实例中，在磁性响应的MagPlex?珠子上的多重Luminex xTAG呼吸道病毒面板(RVP)可适合于用在微滴执行机构上。可以使用xTAG RVP分析来同时检测19种呼吸道病毒类型或亚型，包括RSV A&B，4种冠状病毒(NL63、229E、0C43、HKU1)、SARS、非特异性流感A和H1、H3、H5亚型、流感B、副流感病毒1/2/3/4、腺病毒偏肺病毒、鼻病毒/肠病毒。分析还包括两个对照，MS-2卩遼菌体内部对照和Lambdaphage阳性对照。
[0050]本发明的分子诊断平台的两个实例的规范显示在表1中。在一个实例中，平台I使用单样品一次性微滴执行机构，用于使用xTAG RVP分析来进行呼吸道病毒的合并的样品制备和多重检测。在另一实例中，平台II使用随机接近高流通量微滴执行机构，用于在单个一次性微滴执行机构上的高达12种不同的分子诊断面板(例如，xTAG面板)的完整的样品制备(一个或多个样品)和多重分析。
【权利要求】
1.一种混合微滴的方法，所述方法包括: (a)在表面上提供微滴； (b)使所述微滴形成为具有底部区域和两个端部的第一“U”形状； (c)同时合并所述端部并使所述微滴在所述底部区域处分离，以形成实质上与所述第一 “U”形状相反的第二 “U”形状。
2.如权利要求1所述的方法，包括重复步骤(b)和(c)一次或多次。
3.如权利要求1及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述形成步骤包括使用通过电极介导的微滴操作来操纵所述微滴。
4.如权利要求3及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述微滴操作是电湿润介导的。
5.如权利要求1及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述微滴包括珠子。
6.如权利要求1及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述微滴包括样品。
7.如权利要求1及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述提供步骤包括合并样品微滴和试剂微滴，以在所述表面上产生所述微滴。
8.如权利要求1及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述微滴位于所述表面上且被夹在两个基板之间。
9.一种微滴执行机构，包括: (a)第一基板，其具有平坦表面`； (b)第二基板，其与所述第一基板分开，以形成微滴操作间隙； (C)开口，其在所述第二基板中，形成从所述微滴执行机构的外部位置到所述微滴操作间隙内的流体路径； (d)干燥的试剂小球，其具有平坦表面，位于所述第一基板上且与所述开口对齐，其中所述干燥的试剂小球的所述平坦表面邻接所述第一基板的所述平坦表面。
10.如权利要求9及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，还包括在所述干燥的试剂小球下方的电极。
11.如权利要求10及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述电极具有实质上类似于所述干燥的试剂小球的所述平坦表面的形状的形状。
12.如权利要求9及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述干燥的试剂小球具有选自由以下项组成的组的形状:实质上圆锥形；具有圆形点的实质上圆锥形；实质上圆柱形；具有圆形端部的实质上圆柱形；实质上半球形；实质上卵形；前述形状中的任一种的几何部分。
13.如权利要求9及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述开口具有中心轴，所述干燥的试剂小球具有中心轴，且所述干燥的试剂小球的所述中心轴与所述开口的所述中心轴实质上对齐。
14.如权利要求9及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述干燥的试剂小球具有大于所述微滴操作间隙的高度的高度。
15.—种在微滴执行机构上提供试剂的方法,所述方法包括: (a)提供权利要求9及后面的权利要求中的任一项的微滴执行机构；以及 (b)使液体通过所述开口流动而接触所述干燥的试剂小球，从而将所述干燥的试剂小球溶解在所述液体中，以提供试剂微滴。
16.如权利要求15及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述液体包括样品O
17.如权利要求15及后面的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述液体包括缓冲液。
18.—种微滴执行机构,包括: (a)一个或多个基板，其被布置成形成微滴操作间隙； (b)与一个或两个基板相关联的电极的布置，所述电极包括: (i)电极的中心路径； (?)侧电极，其被布置在电极的所述中心路径的任一侧上。
19.如权利要求18及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中每一个中心电极与一对侧电极对齐。
20.如权利要求18及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中每组两个中心电极与单对侧电极对齐。
21.如权利要求18及 后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中每组三个中心电极与单对侧电极对齐。
22.如权利要求18及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述电极包括电湿润电极。
23.如权利要求18及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，还包括相邻于一个或多个所述中心电极或插入到一个或多个所述中心电极中的分配电极的布置。
24.如权利要求23及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述分配电极的布置位于具有过渡和间隙高度的所述微滴操作间隙的区域中，其中所述间隙高度在远离所述中心电极的方向上减少。
25.如权利要求23及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述分配电极的布置位于相邻于微滴操作电极的路径处，使得所述分配电极被布置成将微滴分配到微滴操作电极的所述路径上。
26.如权利要求23及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述中心电极沿着X轴布置，且其中每一个中心电极沿着所述X轴的长度实质上等于每一个中心电极的侧电极沿着所述X轴的长度。
27.如权利要求26及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中每一个中心电极沿着Y轴的长度实质上等于每一个中心电极的侧电极沿着所述Y轴的长度。
28.如权利要求26及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中每一个中心电极沿着Y轴的长度至少是每一个中心电极的侧电极沿着所述Y轴的长度的两倍。
29.如权利要求26及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中每一个中心电极沿着Y轴的长度至少是每一个中心电极的侧电极沿着所述Y轴的长度的三倍。
30.一种使成形为实现混合的微滴变形的方法，所述方法包括: (a)提供权利要求18及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构； (b)激活中心电极和不在所激活的中心电极的侧面的一个或多个侧电极。
31.如权利要求30及后面的权利要求中的任一项所述的方法，包括激活两个或更多个中心电极和不在所激活的中心电极的侧面的一个或多个侧电极。
32.—种微滴执行机构,包括: (a)一个或多个基板，其被布置成形成微滴操作间隙，所述微滴操作间隙包括间隙高度过渡的区域，在该间隙高度过渡的区域中所述微滴操作间隙的间隙高度从第一间隙高度过渡到第二间隙高度； (b)电极，其与布置成进行微滴操作的所述一个或多个基板相关联，所述电极包括横穿所述间隙高度过渡的区域的过渡电极。
33.如权利要求32及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述电极包括电湿润电极。
34.如权利要求32及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中: (a)所述过渡电极的侧面是具有第一覆盖区的第一组电极和具有第二覆盖区的第二组电极； (b)所述第一覆盖区大于所述第二覆盖区； (c)所述第一组电极被布置在较大间隙高度的区域中； (d)所述第二组电极被布置在较小间隙高度的区域中。
35.如权利要求32及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述过渡电极具有在所述第一覆盖区和所述第二覆盖区中间的覆盖区。
36.如权利要求32及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述过渡电极包括嵌入电极，其中所述嵌入电极被嵌入到所述过渡电极中。
37.如权利要求36及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述嵌入电极横穿所述过渡区域的至少一部分。
38.如权利要求36及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述嵌入电极不过渡所述过渡区域的任何部分。
39.如权利要求32及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，包括与单个间隙高度过渡相关联的多个过渡电极。
40.如权利要求32及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，包括与多个间隙高度过渡相关联的多个过渡电极。
41.一种微滴执行机构,包括: (a)微滴操作表面； (b)与所述微滴操作表面相关联的电极的布置，所述电极包括: (i)分配电极，其具有第一覆盖区； (?)具有第二覆盖区的电极的路径，所述第二覆盖区小于所述第一覆盖区，其中电极的所述路径的至少一个电极被嵌入到所述分配电极中；以及 (iii) 一组侧电极，其在电极的所述路径的两个或更多个电极的侧面。
42.如权利要求41及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述侧电极在电极的所述路径的三个或更多个电极的侧面。
43.如权利要求41及后面的权利要求中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述分配电极是两个或更多个分配电极的布置之一。
44.如权利要求43中的任一项所述的微滴执行机构，其中所述微滴操作表面被设置在微滴操作间隙中， 且两个或更多个分配电极的所述布置与通过基板的开口相关联，形成从所述微滴执行机构的外部位置到所述微滴操作间隙内的流体路径。
【文档编号】B01F3/08GK103562729SQ201280021808
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月1日 优先权日:2011年5月2日
【发明者】多诺万·博尔特, 卡丽·格雷厄姆, 瓦姆西·帕姆拉, 迈克尔·波来克, 拉玛克里什那·西斯塔, 维吉·斯里尼瓦桑 申请人:先进流体逻辑公司