一种从海水中提取、纯化鳍藻毒素－1和扇贝毒素－2的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从海水中提取鳍藻毒素－1和扇贝毒素－2的方法，具体步骤如下：1）用孔经为48μm的聚酯网布缝制成吸附袋，在吸附袋内装入吸附树脂，密封，吸附；2）使用玻璃砂芯层析柱，先用去离子水洗去吸附树脂中的盐分；3）使用装有粒度为75～150μm的氧化铝填料的玻璃砂芯层析柱净化处理；4）使用装有反相C18硅胶的玻璃砂芯层析柱净化处理，得到含有鳍藻毒素－1和扇贝毒素－2的混合物。本发明的有益效果是:本发明可以同时制备鳍藻毒素－1和扇贝毒素－2两种物质，可以作为混合标准物质使用。不受采集的藻类和贝类数量的限制，可以从自然海区海水中大批量提取制备，方法简单、有效。
【专利说明】—种从海水中提取、纯化鳍藻毒素一 1和扇贝毒素一 2的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从海水中提取鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的方法。
【背景技术】
[0002]腹湾性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP)是由赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属的一些种类产生的脂溶性多环醚类生物活性物质。DSP引起食用者腹泻、呕吐，通常数日内症状消失，患者可自愈。DSP在我国沿海经常出现，也是世界各国监控的主要毒素种类之一。无论是毒素进行可靠的监测和分析，还是开发新的毒素监测分析技术，尤其是制备毒素快速检测试剂盒，都必须使用大量毒素标准品。
[0003]我国目前还没有鳍藻毒素一I (Dinophysistoxin — I,DTX — I)和扇贝毒素一2(Pectenotoxin 一 2, PTX 一 2)的制备技术。
[0004]国外，鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的制备通常有二种方法，一是从贝类组织中提取。但是由于贝类组织成份复杂，提取物中脂类杂质较多，净化纯化处理过程较复杂。另一种是从有毒藻类中提取。由于产生鳍藻毒素一I和扇贝毒素一 2的藻类在实验室条件下较难培养，一次培养的数量也受到限制，因此制备过程很困难。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供本发明建立了一种从自然海区海水中提取、分离及纯化制备鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的新技术方法，该技术可以从海水中大量采集鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2，不受采集数量的限制。由于采用专门的大孔吸附树脂，最初从海水中所提取的毒素杂质较少，进一步分离、净化时技术简单。
[0006]本发明采用如下技术方案:
[0007]一种从海水中提取鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的方法，具体步骤如下:
[0008]I)用孔径为48 μ m的聚酯网布缝制成吸附袋，在吸附袋内装入以非极性的聚苯乙烯-二乙烯基苯为基体的大孔吸附树脂，密封，将吸附袋挂在浮漂上，吸附袋位于海水表面以下0.5?Im处，浸泡7天后取出；
[0009]2)把吸附袋中的大孔吸附树脂每次IOg转入无标口 4F活塞有砂芯玻璃层析柱中，用50?70mL去离子水淋洗砂芯滤柱，洗去大孔吸附树脂中的盐分，把砂芯滤柱中水分正压吹干，然后再加入20mL甲醇洗脱，以每秒I滴的速度滤入50ml旋转蒸发瓶中；再加入20mL甲醇，重复提取，合并洗脱液于旋转蒸发瓶中；洗脱液于40°C水浴旋转减圧除去甲醇，至残余I?2mL水时，再加入5mL 二氯甲烷，然后离心，取出二氯甲烷层，再用5mL 二氯甲烷重复一次，合并二次的二氯甲烷，然后用氮气吹干，最后用1.0mL80%的甲醇溶解；按上述步骤，对吸附袋中的大孔吸附树脂重复进行多次操作，得到粗提物；
[0010]3)将IOg经650°C灼烧过的氧化铝(层析用，粒度75?150um)装入无标口 4F活塞有砂芯玻璃层析柱中，先以二氯甲烷/甲醇(体积比，5/5)浸润，待液体将尽流干时，加入上述粗提物10ml，再以20ml 二氯甲烷/甲醇(体积比，5/5)洗脱，收集洗脱液，洗脱液旋转蒸发浓缩后，以5ml80%甲醇溶解残渣；
[0011]4)用反相C18硅胶(粒径40?60 μ m)柱进一步净化处理经上述氧化铝柱处理后的甲醇溶解物；将IOg反相C18硅胶填料分别装入无标口 4F活塞有砂芯玻璃层析柱中，先加入10mll00%甲醇浸润，待柱中甲醇将尽流干时，再加入30ml上述氧化铝柱处理后的甲醇溶解物，用80%甲醇/水洗脱，收集洗脱液，浓缩后用2ml80%甲醇/水溶解残渣，得到含有鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的混合物质。
[0012]本发明的有益效果是:
[0013]本发明可以同时制备鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2两种物质，可以作为混合标准物质使用。不受采集的藻类和贝类数量的限制，可以从自然海区海水中大批量提取制备，方法简单、有效，特别是在分离、净化步骤中使用的分离柱及洗脱液，可以有效的提高分离、净化的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]本发明有如下附图:
[0015]图1鳍藻毒素一 I标准品的质谱图；
[0016]图2扇贝毒素一2标准品的制品图；
[0017]图3氧化铝柱处理后得到的鳍藻毒素一 I的质谱图；
[0018]图4氧化铝柱处理后得到的扇贝毒素一 2的质谱图；
[0019]图5C18硅胶柱净化处理后得到的鳍藻毒素一 I的质谱图；
[0020]图6C18硅胶柱净化处理后得到的扇贝毒素一 2的质谱图。
【具体实施方式】
[0021]一种从海水中提取制备鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的方法，具体步骤如下:
[0022]I)吸附:用孔径为48 μ m的聚酯网布缝制成吸附袋，边长为IOcmXlOcm的正方形袋，称取IOOg以非极性的聚苯乙烯-二乙烯基苯为基体的大孔吸附树脂(HP20，三菱化学株式会社)于吸附袋内，之后密封，并且在吸附袋的一角固定尼龙挂扣。把20只吸附袋，于6月份，挂在黄海灵山湾海区的浮漂上，于海水表面以下0.5?Im处，浸泡7天后取出；
[0023]2)把吸附袋中的大孔吸附树脂每次IOg转入无标口 4F活塞有砂芯玻璃层析柱(内径22mm，长度200mm-300mm，上海楚柏实验室设备有限公司)中，用50?70mL去离子水淋洗砂芯滤柱，洗去大孔吸附树脂中的盐分，把砂芯滤柱中水分正压吹干，然后再加入20mL甲醇洗脱，以每秒I滴的速度滤入50ml旋转蒸发瓶中；再加入20mL甲醇，重复提取，合并洗脱液于旋转蒸发瓶中；洗脱液于40°C水浴旋转减圧除去甲醇，至残余l_2mL水时，再加入5mL二氯甲烷，然后离心，取出二氯甲烷层，再用5mL 二氯甲烷重复一次，合并二次的二氯甲烷，然后用氮气吹干，最后用1.0mL80%的甲醇溶解；按上述步骤，对吸附袋中的大孔吸附树脂重复进行多次操作，得到粗提物；
[0024]3)将粗提物经氧化铝柱净化去除色素类杂质。将IOg经650°C灼烧过的氧化铝(层析用，粒度75?150 μ m，上海陆都化学试剂厂)装入无标口 4F活塞有砂芯玻璃层析柱(内径22mm，长度200mm-300mm，上海楚柏实验室设备有限公司)中，先以二氯甲烷/甲醇(体积比，5/5)浸润，待液体将尽流干时，加入上述粗提物10ml，再以20ml 二氯甲烷/甲醇(体积比，5/5)洗脱，收集洗脱液，洗脱液旋转蒸发浓缩后，以5ml80%甲醇溶解残渣。
[0025]重复上述净化操作，合并多次所得的甲醇溶解物；
[0026]本步骤的作用是利用氧化铝柱净化除去从海水中粗提毒素中的色素类杂质。
[0027]同时，取Iml经0.22 μ m滤膜过滤后，由高圧液相色谱一串联质谱仪(TSQ QuantumAccess,美国赛默飞世尔科技公司)分析。鳍藻毒素一 I质谱如图3所示，浓度为106.6ng/ml ;扇贝毒素一 2质谱如图4所示浓度为418.lng/ml。
[0028]4)用反相C18硅胶(粒径40?60 μ m)柱进一步净化处理经上述氧化铝柱处理后的甲醇溶解物。将IOg反相C18硅胶填料分别装入无标口 4F活塞有砂芯玻璃层析柱(内径22mm，长度200mm-300mm，上海楚柏实验室设备有限公司)中，先加入IOml甲醇浸润，待柱中甲醇将尽流干时，再加入30ml上述氧化铝柱处理后的甲醇溶解物，用80 %甲醇/水洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩后用2ml80%甲醇溶解，得到含有鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的混合物质。
[0029]本步骤的作用是利用C18硅胶柱分离净化去除各种非极性杂质。
[0030]同时，取Iml经0.22 μ m滤膜过滤后，由高圧液相色谱一串联质谱仪分析，鳍藻毒素一I质谱如图5所示，浓度为24.7ng/ml ;扇贝毒素一2质谱如图6所示，浓度为24.5ng/ml ο
[0031]由高圧液相色谱一串联质谱仪分析，浓度为200ng/ml的鳍藻毒素一 I标准品的质谱如图1所示，浓度为200ng/ml的扇贝毒素一 2标准品的质谱如图2所示。
【权利要求】
1.一种从海水中提取鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的方法，其特征在于具体步骤如下: 1)用孔经为48μ m的聚酯网布缝制成吸附袋，在吸附袋内装入大孔吸附树脂，密封，将吸附袋挂在设置于海上的浮漂上，吸附袋位于海水表面以下0.5?Im处，浸泡7天后取出； 2)使用玻璃砂芯层析柱，先用去离子水洗去吸附树脂中的盐分，再用甲醇洗脱，洗脱液在40°C水浴旋转减圧去除甲醇，之后加入二氯甲烷，离心，取出二氯甲烷层，利用氮气吹干，最后用80%的甲醇溶解； 3)取步骤2)制备的甲醇溶解液，使用装有粒度为75?150μ m的氧化铝填料的玻璃砂芯层析柱净化处理，洗脱液为二氯甲烷/甲醇(体积比为5/5)，收集洗脱液，洗脱液旋转蒸发浓缩后，以80%甲醇溶解残渣；所述氧化铝经过650°C灼烧； 4)取步骤3)得到的甲醇溶解液，使用装有反相C18硅胶的玻璃砂芯层析柱净化处理，洗脱液为80%甲醇，收集洗脱液，得到含有鳍藻毒素一 I和扇贝毒素一 2的混合物。
2.根据权利要求1所述的从海水中提取鳍藻毒素一I和扇贝毒素一 2的方法，其特征在于步骤I)中所述的大孔吸附树脂为以非极性的聚苯乙烯-二乙烯基苯为基体的大孔吸附树脂。
【文档编号】B01D15/00GK103623610SQ201310633780
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】李兆新, 郭萌萌, 吴海燕, 王英姿 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所