以pamam为间隔臂的仿生免疫吸附剂及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂，具有如下Gel-PAMAM-AA的化学结构：其中，Gel代表含羟基的亲水载体；AA代表氨基酸；n＝0，1，2或3；PAMAM为聚酰胺-胺型树枝状高分子，所述亲水载体为琼脂糖、纤维素或聚乙烯醇，所述氨基酸为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。本发明还提供了上述仿生免疫吸附剂的制备方法。本发明以树枝状的大分子PAMAM为间隔臂，使载体外表面具有更多的活性位点，便于偶联更多的配基，还调整了三唑环的位置和方向，使其离树状PAMAM更远，更利于目标物质的吸附，对IgG具有特异性吸附，且成本低，工艺简单，反应条件温和。
【专利说明】以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医疗器械，提供了一种血液净化用仿生免疫吸附剂的制备方法， 特别是可用于血液灌流的免疫吸附剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 免疫吸附疗法是近二十年来发展起来的一种新技术，用于治疗一些传统方法难以 奏效的疾病。目前临床上应用免疫吸附能通过特异性的清除自身抗体治疗多种自身免疫性 疾病。如以蛋白A，G等为配基的蛋白类免疫吸附剂对免疫球蛋白（IgG)有很好的生物特异 性亲和力，含有这类生物特异性配基的免疫吸附剂已证明能去除自身抗体并治疗各种自身 免疫性疾病，因而在生物纯化及临床上得到了广泛应用。然而，蛋白类配基存在一些无法忽 视的缺陷：蛋白质难以经受苛刻的灭菌过程并且较易从载体上脱落，这些脱落的配基会引 起安全问题；蛋白类免疫吸附剂高昂的价格给患者造成了沉重的经济负担；蛋白质配基难 以进行化学官能团的修饰，因而不能以最合适的角度偶联在载体上。为了解决这些问题，一 批能选择性地结合IgG的仿蛋白质类的小分子配基得到了广泛的研宄和发展。例如，氨基 酸、多肽、染料、金属离子等这类具有高度物理化学稳定性和低廉价格的小分子，能作为蛋 白质配基的替代品用于吸附IgG。在这些仿生配基中，氨基酸由于其无毒，价廉和对IgG的 高选择性已代替蛋白质用于亲和色谱方面。有报道证明氨基酸能高效地从人血浆或血清中 分呙出IgG。
[0003] 在常用的免疫吸附剂的制备方法中，配基通过氨基、羟基、羧基、醛基等反应基团 偶联于载体上。但是，当配基上存在过多的化学官能团或者存在其它能参与偶联反应的基 团时，载体与配基用于偶联反应的官能团间的选择性会减低，从而使配基的亲和力受到影 响。因此，增加载体与配基在偶联反应时的选择性就显得尤为重要。如果一对官能团彼此 间有很高的反应选择性并且它们对其它基团是惰性的，那么这样的官能团对就能大大提高 免疫吸附剂的制备效率。而萱氣基和块基正是这样的官能团对，>者的Huisgen1，3_偶极 环加成反应是点击化学反应里应用最广泛的。Cu(I)-催化的叠氮基和炔基的环加成反应具 有高选择性，且对很多其它的化学官能团是惰性的，并在很广的反应条件下（溶剂、温度、 PH等）都能保持稳定。这些特征使得点击化学在生物藕联方面显示出独特的优势，例如亲 和色谱试剂的制备。专利CN201210152387. 3中，通过分别制备了叠氮化的载体和炔化的配 基，并且将二者通过点击反应偶联后制备了免疫吸附剂。其中，要制备叠氮化的载体，需将 其先环氧化后再通过活化基团进行叠氮化，但该制备方法存在局限性，如叠氮化琼脂糖的 叠氮基含量影响后续通过点击反应固载上的配基量，而叠氮基含量则直接受限于环氧基含 量。通过专利（申请号 ：01103114.X)报道的环氧氯丙烷活化法所得到的活化载体，其环氧 值约为60ymol/mL。而在尝试了多种环氧活化的优化方法后，发现活化载体的环氧值难以 有明显的提高，配基固载量也难以进一步提高。因此，本发明采用了一种新的活化载体和吸 附剂的制备方法，以提高载体的活性位点数，增加吸附剂的配基固载量，从而有效地提高吸 附剂的吸附性能。
【发明内容】
[0004]本发明的第一目的是提供一种安全、成本低廉，性能稳定可靠的以PAMM为间隔 臂的仿生免疫吸附剂。本发明的第二目的在于提供以PAMM为间隔臂的仿生免疫吸附剂的 制备方法。本发明的第三目的在于提供该类以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂在IgG分 离中的应用。
[0005]本发明以琼脂糖、纤维素和聚乙烯醇等含羟基的亲水凝胶球为载体，氨基酸为仿 生配基，采用点击化学设计和制备一种以聚酰胺-胺树枝状高分子物质（PAMM)为间隔臂 的免疫吸附剂，对IgG具有高选择性，且成本低廉，性能稳定可靠，效果与蛋白A吸附材料相 当。以树枝状聚合物为间隔臂可克服线形间隔臂的缺点并增大载体对配基的固载量。聚酰 胺-胺树状高分子既具有树状大分子的共性，又有自身特色：PAMM是以乙二胺为核心，通 过Michael加成和酰胺化缩合反应来进行的，整个反应的产率非常高；在凝胶载体上连接 PAMM型树枝状大分子，充分利用其大量活性位点的优势进行配基的固定化，偶联这种树枝 状间隔臂后的载体比偶联线形间隔臂的载体的外表面具有更多的活性位点，更易于配基的 键合，大大提高配基固载效率，增加免疫吸附剂的吸附能力。琼脂糖、纤维素和聚乙烯醇等 载体具有良好的化学稳定性和机械强度，对蛋白质呈化学隋性，其亲水性和血液相容性也 比较好，容易活化并在比较温和、简单的条件下可进行配基的固载反应。
[0006]本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0007]一种以PAMM为间隔臂的仿生免疫吸附剂，具有如下Gel-PAMM-AA的化学结构：
[0008]
【权利要求】
1. 一种以PAMM为间隔臂的仿生免疫吸附剂，具有如下Gel-PAMM-AA的化学结构：
其中，Gel代表含羟基的亲水载体;AA代表氨基酸；n = 0，l，2或3 ;PAMAM为聚酰胺-胺 型树枝状高分子，所述亲水载体为琼脂糖、纤维素或聚乙烯醇，所述氨基酸为L-组氨酸、苯 丙氨酸或色氨酸。
2. -种如权利要求1所述的以PAMM为间隔臂的仿生免疫吸附剂的制备方法，其特征 在于，采用下述方案制备而成： (1)炔化载体的制备
其中，（2)和⑶的顺序可以任意，⑴可以在（2)、（3)和⑷之前或之后。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，（1)的具体过程为： 向载体的水溶液中加入3-卤代丙炔和环状冠醚类相转移催化剂，每克载体中加入 3-卤代丙炔3?15mmol和环状冠醚类相转移催化剂0. 2?I. Ommol，20?60°C反应6? 60h后，水洗，抽干；其中，所述3-卤代丙炔为炔丙溴、炔丙氯或炔丙碘。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述环状冠醚类相转移催化剂为 18-冠醚-6、15-冠醚-5、环糊精中的一种或多种。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，（2)的具体过程为： 在温度为-10?l〇°C条件下，向丙烯酸Ci?(：4烷基酯的醇溶液中滴加3-叠氮基丙胺， 丙烯酸Cf C 4烧基酯与3-叠氮基丙胺的摩尔比为5?15 :1，保温反应0. 5?3h后，升 温至20?50°C反应12?50h，将反应产物进行减压蒸馏，得G 0. 5PAMAM ;-10?10°C下， 向乙二胺的醇溶液中滴加GO. 5PAMAM，乙二胺与GO. 5PAMAM的摩尔比为10?30 :1，保温反 应0. 5?3h后，升温至20?50°C反应12?50h，将反应产物进行减压蒸馏得第一代产物 GL OPAMAM ； 在温度为-10?l〇°C条件下，向丙烯酸(^?(：4烷基酯的醇溶液中滴加61.(^4嫩11，丙烯 酸Ci?C 4烷基酯与GL OPAMAM的摩尔比为10?30 :1，保温反应0. 5?3h后，升温至20? 60°C反应15?60h，将反应产物进行减压蒸馏，得GL 5PAMAM ;-10?10°C下，向乙二胺的 醇溶液中滴加GL 5PAMAM，乙二胺与GL 5PAMAM的摩尔比为30?50 :1，保温反应0. 5?3h 后，升温至20?60°C反应15?60h，将反应产物进行减压蒸馏得第二代产物G2. OPAMM ; 在温度为-1〇?1〇°〇条件下，向丙烯酸(：1?(：4烷基酯的醇溶液中滴加62.0?4嫩11，丙烯 酸Ci?C 4烷基酯与G2. OPAMAM的摩尔比为30?50 :1，保温反应0. 5?3h后，升温至20? 70°C反应18?66h，将反应产物进行减压蒸馏，得G 2. 5PAMAM ; - 10?10°C下，向乙二胺的 醇溶液中滴加G2. 5PAMAM，乙二胺与G2. 5PAMAM的摩尔比为70?90 :1，保温反应0. 5?3h 后，升温至20?70°C反应18?66h，将反应产物进行减压蒸馏得第三代产物G3. OPAMAM ; 在温度为-1〇?1〇°〇条件下，向丙烯酸(：1?(：4烷基酯的醇溶液中滴加63.0?4嫩11，丙烯 酸Ci?C 4烷基酯与G3. OPAMAM的摩尔比为70?90 :1，保温反应0. 5?3h后，升温至20? 80°C反应24?72h，将反应产物进行减压蒸馏，得G3. 5PAMAM ;-10?10°C下，向乙二胺的甲 醇溶液中滴加G3. 5PAMAM，乙二胺与G3. 5PAMAM的摩尔比为150?170 :1，保温反应0. 5? 3h后，升温至20?80 °C反应24?72h，将反应产物进行减压蒸馏得第四代产物G4. 0PAMAM。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸C ^ C 4烧基酯为丙烯酸 甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯或丙烯酸叔 丁酯。
7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，（3)的具体过程为： 将氨基酸置于甲醇溶液中，加入三甲基氯硅烷，所述三甲基氯硅烷与氨基酸的摩尔比 为1?3 :1，回流至溶液澄清后旋蒸干燥；所述氨基酸置于甲醇溶液中，每Immol氨基酸中 甲醇加入量为1?3ml。
8. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，（4)的具体过程为： 将氨基酸甲酯盐酸盐溶于水中，每Immol氨基酸甲酯盐酸盐加入水〇. 25?4ml，并加入 三乙胺及第一?第四代PAMAM产物中任意一种的水溶液，氨基酸甲酯盐酸盐、三乙胺与第 一?第四代PAMAM产物的摩尔比为1?10 :1?10 :1 ;磁力搅拌下20?90°C反应24?96h， 透析并冷冻干燥得氨基酸修饰的PAMM产物，表示为PAMM-AA ;所述第一?第四代PAMM 产物为 GL OPAMAM、G2. OPAMAM、G3. OPAMAM 和 G4. 0PAMAM。
9. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，（5)的具体过程为： 将氨基酸修饰的PAMAM产物溶于水后，加入炔化载体，每克炔化载体加入1?IOmmol 氨基酸修饰的PAMAM产物，然后依次加入硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂，硫酸铜、抗坏血酸 钠与氨基酸修饰的PAMAM产物的摩尔比为0.01?0.05 :0.02?0. 1 :1，并于20?90°C反 应24?96h，洗涤抽干得目标产物Gel-PAMAM-AA。
10.权利要求1所述的以PAMM为间隔臂的仿生免疫吸附剂在IgG分离中的应用。
【文档编号】B01J20/30GK104492395SQ201410719674
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】董凡, 胡小艳 申请人:珠海健帆生物科技股份有限公司