装填色谱柱的方法、用于在高压下使用的经装填色谱柱和其用途与流程

本发明涉及液体色谱柱领域。具体来说，本发明涉及装填这样的可以经受住尤其是高于1000巴的高操作压力的柱的方法。本发明还涉及以此方式装填的液体色谱柱和其用途。

背景技术：

液相色谱法(LC)，例如高效液相色谱法(HPLC)常规地用在分析色谱应用中，用于测定多种化学和生物样品中的分析物的质量和数量。在这些色谱技术中，通过将液体流动相中的样品输送通过柱中的固定相，从而由于每个组分的流动相和固定相之间不同的分配(即组分具有不同的分配系数)使得样品分离到其组分中来实现包括组分混合物 (也称为分析物)的样品的分离。固定相最常采用柱内装填的粒子床的形式。为了提供样品的高分辨率和通量，典型地至多600巴的高操作压力用于HPLC。

为了提供超高分辨率和/或超快速通量分析(其对于数据质量和分析成本很重要)，已发展超高效液相色谱(UHPLC)，利用低系统分散和超高系统操作压力(典型地大于 1000巴)的益处。UHPLC柱为UHPLC解决方案的至关重要的要素。为了充分利用UHPLC 仪器的能力以实现超高分辨率、超高通量分析，柱典型地装填有固定相介质，包括小粒子，通常小于2μm(例如1.5μm)。这些粒子可为完全多孔(即整体多孔)、表面多孔或无孔的，且粒子可经表面改性以用于具体应用。此类苛刻的操作条件(高压和/或高线速度)需要分离柱具有优异的床稳定性。

传统上，HPLC柱在使用一种或多种有机溶剂的方法中装填(本文中“溶剂装填”)。然而，存在本发明人所提到的与此方法相关的一些缺点。首先，本发明人已发现溶剂装填通常无法提供可在1300巴或更高压力下操作的HPLC柱，由此限制所述压力(例如 1500巴)在UHPLC中(例如在THERMOH UHPLC系统中)的使用。其次，大部分有机溶剂在一定程度上为毒性和/或可燃的，由此施加对操作人员的健康和安全隐患和对环境的污染。第三，有机溶剂的使用由于与制造方法和所需废弃物处理相关的成本而很昂贵。

技术实现要素：

根据第一方面，提供一种柱装填的方法，其包括使用水性溶液，优选地用于浆料制造和/或在液体压力下装填柱，其解决现有技术的以上缺点。与有机溶剂基装填方法相比，已发现水基方法能够得到在大于1000或大于1300巴的操作压力下改进的柱稳定性(耐用性)，改进的分离性能和改进的再现性。已发现水性装填方法提供相对于溶剂基方法改进的制造产率。举例来说，与溶剂基方法的50％相比，水性装填方法可提供90％产率。性能改进包括减少的峰拖尾和较高分离效率。这些益处伴随着装填方法中极大溶剂消耗降低(例如溶剂使用至多95-100％减少)。

根据第二方面，提供一种柱装填方法，其包括多个压力阶段装填方法。此外，已发现性能改进包括改进的柱耐用性、减少的峰拖尾和改进的分离效率。

本发明提供使用水基装填和/或多个压力阶段装填方法装填LC柱的方法，所述柱可经受用于HPLC的至多600巴以及用于UHPLC的至多1500巴的操作压力。本发明最优选地提供柱装填的方法，其包括使用水性溶液和多个压力阶段两个方面。

根据本发明的实施例，在第一方面中，提供一种装填色谱柱的方法，其包括：

将色谱介质粒子分散在水基浆料溶液中以形成浆料；

通过将所述浆料引入到色谱柱中来用所述色谱介质粒子填充所述柱；以及

施加压力以将所述色谱介质粒子装填在所述色谱柱中。

水基浆料溶液优选地为100重量％水、或至少90重量％、或至少95重量％、或至少99重量％水。所述水基浆料溶液可含有有机溶剂，其量以100重量份水计为不超过 100重量份、不超过50重量份、或不超过40重量份、或不超过30重量份、或不超过 20重量份、或不超过10重量份、或不超过5重量份、或不超过1重量份有机溶剂。

水基浆料溶液优选地以100重量份水计进一步包括：

0-50、或0-40、或0-30、或0-20、或0-10、或0-5、或0-1重量份表面活性剂；

0-50、或0-40、或0-30、或0-20、或0-10、或0-5、或0-1重量份电解质或盐(除离子型表面活性剂以外)；

0-100、或0-50、或0-30、或0-20或0-10或0-5或0-1重量份酸；

0-100、或0-50、或0-30、或0-20或0-10或0-5或0-1重量份碱。

所施加的压力优选地包括至少500巴、或至少800巴、或至少1000巴、或至少1300 巴、或至少1500巴、或至少2000巴的压力持续一段时间。

所述压力优选地以第一压力施加且大体上保持恒定持续第一时间段，且在所述第一时间段之后，以高于所述第一压力的第二压力施加且大体上保持恒定持续第二时间段。

根据本发明的实施例，在第二方面中，提供一种装填色谱柱的方法，其包括：将色谱介质粒子分散在浆料溶液中以形成浆料；通过将所述浆料引入到色谱柱中来用所述色谱介质粒子填充所述柱；以及施加压力以将所述色谱介质粒子装填在所述色谱柱中，其中所述压力以第一压力施加且大体上保持恒定持续第一时间段，且在所述第一时间段之后，以高于所述第一压力的第二压力施加且大体上保持恒定持续第二时间段。

所述第一压力优选地在100-1500巴范围内，或在100-1300巴范围内，或在100到 1000巴范围内，或在300到1000巴范围内，或在500到1000巴范围内；且所述第二压力优选地在1500到6000巴范围内，或在1500到5000巴范围内，或在1500到4000巴范围内，或在1500到3000巴范围内。所述第一压力优选地在100-1500巴范围内；且所述第二压力优选地在1500到4000巴范围内或在1500到4000巴范围内。

所述第一时间段优选地在0.1-100小时范围内或在0.2到50小时范围内，且所述第二时间段优选地在0.1-100小时范围内或在0.2到50小时范围内。

所述柱的内径优选地为10μm到5mm，或100μm到5mm；且所述柱的长度优选地为20mm到10,000mm或20mm-1,000mm。所述色谱介质粒子优选地具有1到5μm 的中值粒子直径且优选地为完全多孔或表面多孔的。

在另一个方面中，本发明提供一种用于在至少500巴、或至少1000巴、或至少1300 巴或至少1500巴的液体压力下操作的液相色谱柱，其中色谱介质粒子已从水基浆料溶液装填到所述柱中。柱的装填优选地根据本发明的第一方面。

在又另一个方面中，本发明提供一种用于在至少500巴、或至少1000巴、或至少 1300巴或至少1500巴的液体压力下操作的液相色谱柱，其中色谱介质粒子已在所施加的压力下从浆料溶液装填到所述柱中，所述施加的压力以第一压力大体上恒定持续第一时间段，且在所述第一时间段之后，以高于所述第一压力的第二压力保持大体上恒定持续第二时间段。柱的装填优选地根据本发明的第二方面。

附图说明

并入本文中且构成本说明书的部分的随附图式绘示本发明的目前优选实施例，且连同描述用以阐释本发明的特征。

图1示意性地展示用于实施装填方法的设备。

图2展示对装填有介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子的100×2.1mm 柱的柱装填稳健性测试的典型压力迹线。

图3展示在使用实例1和2的水基(色谱图a)和溶剂基装填方法(色谱图b)两者在2400巴下用介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的两个100×2.1mm 柱之间的柱性能比较。应注意，出于示出与色谱图b的峰形状相对差异的目的，色谱图 a在y轴上向下偏移。

图4a展示出在对使用水基装填方法在820巴(实例3)下用介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的50×2.1mm柱的稳健性测试之前和之后(分别为色谱图a和色谱图b)的柱性能结果。应注意，出于示出与色谱图b的峰形状相对差异的目的，色谱图b在y轴上向上偏移。

图4b展示出在对使用水基装填方法在2400巴(实例4)下用介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的50×2.1mm柱的稳健性测试之前和之后(分别为色谱图a和色谱图b)的柱性能结果。应注意，出于比较与色谱图a的峰形状可能的差异的目的，色谱图b在y轴上向上偏移。

图5展示在对实例1中使用2阶段水基装填方法在2400巴下用介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的100×2.1mm柱的稳健性测试之前和之后(分别为色谱图a和色谱图b)的柱性能结果。应注意，出于比较与色谱图b的峰形状可能的差异的目的，色谱图a在y轴上向下偏移。

图6展示在对使用2阶段水基装填方法在2400巴下用介质2(1.9μm多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的200×2.1mm柱(以上实例5)的稳健性测试之前和之后(分别为色谱图a和色谱图b)的柱性能结果。应注意，出于比较与色谱图a的峰形状可能的差异的目的，色谱图b在y轴上向上偏移。

图7a展示在对使用实例6的溶剂基装填方法在2400巴下用介质2(1.9μm多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的150×2.1mm柱的稳健性测试之前和之后(分别为色谱图a 和色谱图b)的柱性能结果。应注意，出于比较与色谱图a的峰形状可能的差异的目的，色谱图b在y轴上向上偏移。

图7b展示在对使用实例7的2阶段水基方法在2400巴下用介质2(1.9μm多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的150×2.1mm柱的稳健性测试之前和之后(分别为色谱图a 和色谱图b)的柱性能结果。应注意，出于比较与色谱图a的峰形状可能的差异的目的，色谱图b在y轴上向上偏移。

具体实施方式

现将更详细地描述本发明的各种优选的特征、实施例和实例。

本发明在第一方面中优选地包括将色谱介质粒子分散在含有至少50重量％水的浆料溶液中。使足以填充柱的色谱介质粒子的重量分散。浆料由此形成。浆料溶液优选地含有至少60重量％、或至少70重量％、或至少80重量％、更优选地至少90重量％、或至少95重量％或至少99重量％水。水优选地为去离子(D.I.)水。浆料溶液任选地但优选地包括一种或多种添加剂。添加剂可选自表面活性剂、电解质如盐、酸和/或碱。浆料溶液任选地可含有有机溶剂，以100重量份水计，优选地其量以重量计为不超过100重量份、不超过50重量份、或不超过40重量份、或不超过30重量份、或不超过20重量份、更优选地不超过10重量份、或不超过5重量份、或不超过1重量份有机溶剂。

在一些实施例中，浆料溶液可包括100重量％水。因此，将了解，术语溶液在此上下文中在其严格的意义上不仅用于意指含有一种或多种组分的水，而且在一些实施例中用于意指纯(100％)水。在某些优选实施例中，浆料溶液可包括：90-100重量％水和 0-10重量％溶剂。

除了水和任选的溶剂之外，浆料溶液可进一步包括(以100重量份水计)：

0-50、优选地0-40、更优选地0-30、最优选地0-20或0-10或0-5或0-1重量份表面活性剂；

0-50、优选地0-40、更优选地0-30、最优选地0-20或0-10或0-5或0-1重量份电解质或盐(除离子型表面活性剂以外)；

0-100、优选地0-50、更优选地0-30、最优选地0-20或0-10或0-5或0-1重量份酸；以及

0-100、优选地0-50、更优选地0-30、最优选地0-20或0-10或0-5或0-1重量份碱。

最优选地存在表面活性剂，例如0.1-50、优选地0.1-40、更优选地0.1-30、最优选地0.1-20或0.1-10或0.1-5或0.1-1重量份表面活性剂。

一种优选的浆料溶液和/或装填溶液，其组成包括：

至少90重量％水；以及以100重量份水计：

0-10重量份有机溶剂；

0-10重量份表面活性剂(尤其0.1-10重量份表面活性剂)；

0-10重量份电解质或盐；

0-10重量份酸；以及

0-10重量份碱。

另一种优选的浆料溶液和/或装填溶液，其组成包括：

至少95重量％水；以及以100重量份水计：

0-5重量份有机溶剂；

0-5重量份表面活性剂(尤其0.1-1重量份表面活性剂)；

0-5重量份电解质或盐；

0-5重量份酸；以及

0-5重量份碱。

溶剂为有机溶剂且类型不受特别限制。优选地，溶剂包括选自以下清单的一种或多种溶剂(但不限于这些)：甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、己烷、庚烷、环己烷等。

添加剂可为例如选自以下的任何一种或多种添加剂：酸、碱、表面活性剂、盐或这些物质的任何组合。

优选的酸包括：乙酸、甲酸、甲烷磺酸、硫酸、磷酸、硝酸和柠檬酸、三氟乙酸(TFA) 等。

优选的碱包括：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化四甲基铵、氢氧化四丁基铵、钠、碳酸钾等。

优选的表面活性剂包括：聚乙二醇(其可具有不同分子量)、癸基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、烷基乙氧基化物、Triton X-100(聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵。表面活性剂可为阴离子、阳离子、非离子和/或两性表面活性剂。

优选的盐包括NaCl、KCl、磷酸钠和/或磷酸钾、硫酸钠和/或硫酸钾、乙酸钠、甲酸钠等。

因此，可见本发明提供一种使用水基浆料溶液和装填溶液的柱装填方法。浆料溶液和装填溶液可各自独立地为：

纯水；

含有如所述的添加剂的水溶液；

水和溶剂的混合物，其中水含量为混合物的至少50重量％；或

水和溶剂的混合物，其中水含量为混合物的至少50重量％，另外含有如所述的添加剂。

本发明在第二方面(其优选地与第一方面组合)中优选地包括在第一压力下执行的第一装填阶段(或“第一装填”)，其后为在高于第一压力的第二压力下执行的第二装填阶段(或“第二装填”)。因此，本发明提供两阶段或至少两阶段装填方法。所述方法在一个实施例中参考图1示出。在压力下装填(例如第一装填阶段)之前，所述方法优选地包括将空柱体(2)(如HPLC或UHPLC柱)的一端(4)任选地经由适配器(8) 连接于装填储集器(6)，所述柱具有装配在另一端上以使介质保留在柱中的末端接头 (10)(优选地连同介质支撑物，如玻璃料一起)。此安排在本文中被称作装填台或第一装填台(其中使用两种或更多种所述安排)。柱优选地大体上垂直置放，其中末端接头 (10)在下部末端，且装填储集器(6)连接于上端(4)。所述方法优选地进一步包括将所制备的含有色谱介质粒子的浆料、优选地(而非必然)如本文中所述的浆料转移到装填储集器(6)中，随后注满溶液，例如另外的浆料溶液(例如单独溶液，大体上不具有色谱介质粒子)，其在本文中称为“装填溶液”或“推进溶液”。推进溶液可从另外的储集器(12)进料到装填储集器(6)中。来自装填储集器的浆料由此填充柱(2)。可替代地，浆料可在装填储集器中形成以用浆料转移方法分配。含有介质的浆料溶液和装填溶液均优选地为水基的，即含有至少50重量％水，且优选地前述量的水和其它组分。然而，两阶段的、或至少两阶段装填方法在溶剂基浆料柱装填的情况下也可为有益的。

接着，所述方法优选地通过以下方式进行：典型地借助于泵(14)向柱(2)和储集器(6)中的浆料施加压力以开始装填(即，第一装填阶段)。以此方式，浆料溶液经由柱泵送，且来自浆料的介质粒子通过柱(10)的另一端(即，引入浆料的末端的另一端)上的介质支撑物(如玻璃料)保留在柱中。压力优选地在第一装填阶段在压力斜变 (包括缓慢到快速压力斜变)的情况下施加。随着具有介质粒子的浆料装填到柱中，装填溶液接着向粒子施加另外的压力。压力优选地在斜变达到第一压力之后在第一压力下保持第一装填时间。第一压力优选地在100-1500巴范围内，或在100-1300巴范围内，更优选地在100到1000巴范围内，或在300到1000巴范围内，或在500到1000巴范围内。在一些实施例中，第一装填压力在600到900巴范围内或在700到900巴范围内。第一装填时间(施加第一压力的时间)优选地在0.1-100小时范围内，更优选地在0.2 到50小时范围内，最优选地在0.3到48小时范围内。

在第一装填阶段之后，尤其当装填储集器不可经受第二装填阶段的较高压力时，优选地柱从装填储集器断开连接，且移动到可施加较高压力的第二装填台，其中柱直接连接于用于第二阶段的泵和推进溶液来源。用于第二装填台的泵可与用于第一装填阶段的泵相同或不同。在柱移动到用于第二阶段的其它装填台之前，压力从柱解除。接着，柱可移动到其它装填台以用于进一步装填。然而，当装填储集器可经受较高压力，例如用于第二装填阶段的UHPLC压力时，第二压力可在第一阶段施加且优选地大体上不降低压力。

所述方法优选地通过以下方式进行：施加第二压力(当装填在一个台上执行时，优选地通过从第一压力增大达到第二压力)，且在第二压力下保持第二装填时间。第二压力优选地在200-6000巴范围内，更优选地在200到5000巴范围内，或在200到4000 巴范围内，最优选地在500到4000巴范围内或在500到3000巴范围内。在一些实施例中，第二压力优选地在1500-6000巴范围内，更优选地在1500到5000巴范围内，或在 1500到4000巴范围内，最优选地在1500到4000巴范围内或在1500到3000巴范围内。在一些实施例中，第二装填压力在2000到4000巴范围内或在2000到3000巴范围内。第二装填时间(施加第二压力的时间)优选地在0.1-100小时范围内，更优选地在0.2 到50小时范围内。优选地，第二装填压力大于柱使用时的最大操作压力。已发现第二阶段在使介质粒子的装填床稳定克服在UHPLC条件下重复使用方面起到显著作用。任选地，第三装填阶段等可在第三装填压力下执行，优选地在与先前(第二)阶段相比仍然较高压力下持续第三装填时间等。第三装填压力可例如在300-6000巴范围内，或在 500-5000巴范围内，或在500到4000巴范围内。装填步骤可在相同装填台或不同装填台上执行。装填方法(第一和第二阶段)可在室温或环境温度、至多约80℃下执行。

在装填之后，柱可在其第一接头的另一末端装有第二末端接头(优选地连同介质支撑物(如玻璃料)一起)且测试色谱性能。经装填柱优选地在使用之前经历洗涤。

利用本发明的方法制造的HPLC和UHPLC柱产品可在400到2000巴的压力下、优选地在大于1000、或大于1300、或大于1500巴的操作压力下操作。柱体典型地为管状，且可装填的典型柱内径可为10μm到5mm，或100μm到5mm，或1mm到5mm。可装填的典型柱长度可为20mm到10,000mm，或20mm-1,000mm，或20mm-500mm，或20mm-200mm，或50mm-150mm。优选地，柱尺寸可为x mm内径×y mm长度的任何组合，其中x＝0.05到10mm且y＝20到1000mm。柱体典型地为钢柱，通常为不锈钢。

色谱介质优选地为微粒介质，其中介质的粒子典型地且优选地大体上为球形但在一些实施例中形状可为不规则的。粒子优选地具有狭窄的大小分布。

介质粒子可为多孔(完全，即整体多孔)、表面多孔或无孔粒子。粒子可为二氧化硅和/或金属氧化物。粒子优选地选自以下各项中的任何一种或多种：二氧化硅、二氧化硅-有机混成物或有机聚合物粒子。

在某些实例中，粒子基本上为“单分散”或基本上“均分散”，这表明大部分粒子的粒度(例如，粒子的80％、90％或95％)在中值粒径(D50)以下或以上大体上(例如，不大于10％)没有变化。在示例性单分散粒子数中，90％的粒子的平均粒度在约0.9×D50和约1.1×D50之间。这有利于色谱应用。尽管优选单分散的粒子，具有更广粒度分布的粒子可以用于许多应用中。

色谱介质的粒子典型地为微米粒子，优选地中值粒子直径为0.1μm或更大。更优选地，粒子的直径为0.1到100μm、或0.1到50μm或0.1到20μm，或更优选地直径为 0.1到10μm、或0.1到5μm，或直径为0.1到3μm，或甚至更优选地直径为0.1到2μm，尤其直径为0.2到5μm、或0.2到3μm、或0.2到2μm、或0.5到5μm、或0.5到3μm、或0.5到2μm、或1到5μm、或1到3μm或最优选地1到2μm。

色谱介质的粒子可为多孔(包括完全多孔，即，整体多孔，或表面多孔)或无孔粒子。

当多孔粒子用作色谱介质时，粒子的孔可具有任何尺寸。平均孔径典型地按以埃 (10^-10m，)为单位的直径形式测量。使用BJH(Barrett Joyner-Halenda)方法从吸附数据中计算孔径分布(PSD)并且平均孔径(WBJH)被定义为PSD的最大值。在一个实例中，孔的平均尺寸或直径在约1与约之间，尤其在约50与约之间。在另一实例中，孔的平均直径在约10与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约10 与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约10与约之间，在约20与约之间，在约20与约之间，在约20与约之间，在约 20与约之间，在约20与约之间，在约20与约之间，在约30与约之间，在约30与约之间，在约30与约之间，在约30与约之间，在约30与约之间，在约30与约之间，在约40与约之间，在约40与约之间，在约40与约之间，在约40与约之间，在约40 与约之间，在约40与约之间，在约50与约之间，在约50与约之间，在约50与约之间，在约50与约之间，在约50与约之间，在约50与约之间，在约60与约之间，在约60与约之间，在约 60与约之间，在约60与约之间，在约60与约之间，在约60与约之间，在约70与约之间，在约70与约之间，在约70与约之间，在约70与约之间，在约70与约之间，在约70与约之间，在约80与约之间，在约80与约之间，在约80与约之间，在约 80与约之间，在约80与约之间，在约100与约之间，在约100与约之间，在约100与约之间，在约100与约之间，在约200与约之间或在约200与约之间。优选地，平均孔径直径在约30与约之间，更优选地在约80与约之间。最优选地，平均孔径直径在约80与约之间。

多孔微粒色谱介质的(BET)比表面积典型地在约0.1与约2,000m²/g之间，最典型地在约0.1与约1,000m²/g之间。举例来说，微粒材料的比表面积在约1与约1,000m²/g 之间，在约1与约800m²/g之间，在约1与约600m²/g之间，在约1与约500m²/g之间，在约1与约400m²/g之间，在约1与约200m²/g之间或在约1与约100m²/g之间。在另一实例中，材料的比表面积在约10与约1,000m²/g之间，在约10与约800m²/g之间，在约10与约600m²/g之间，在约10与约500m²/g之间，在约10与约400m²/g之间，在约10与约200m²/g之间或在约10与约100m²/g之间。在另一实例中，材料的比表面积在约50与约1,000m²/g之间，在约50与约800m²/g之间，在约50与约600m²/g 之间，在约50与约500m²/g之间，在约50与约400m²/g之间，在约50与约200m²/g 之间或在约50与约100m²/g之间。优选地，微粒材料的比表面积在约1与约500m²/g 之间或在约10与约500m²/g之间(尤其在约50与约500m²/g之间)。在另一实例中，所述比表面积更优选在约10与约100m²/g之间。

对于无孔粒子，比表面积优选地在约0.5与10m²/g之间。对于无孔粒子，中值粒子直径为优选地0.1到5μm，优选地0.1到2μm，更优选地0.1到2μm。

本发明的柱装填方法可应用于不同类型的微粒色谱介质，包括(但不限于)以下中的任一种：

反相介质(疏水性表面)

HILIC或正相介质(亲水性表面)

离子交换相介质(带电荷表面)

混合模式相介质(疏水性(或亲水性)与带电荷表面组合。

利用本发明制造的液相色谱柱优选地具有高稳健性以在高压和超高压下重复使用。柱效率(每米理论板数，N/m)优选地在稳健性测试之后变化小于10％，在所述稳健性测试中，向柱施加的压力在0巴持续2分钟与1500巴持续3分钟之间来回变化100次。峰拖尾因子优选地在稳健性测试之后变化(典型地增加)小于15％。反压优选地在稳健性测试之后变化(典型地增加)小于10％。

实例

通用程序

现在描述装填柱的示例性通用程序，其后为特定实例。这些对本发明的范围为非限制性的。

优选地，完全多孔或表面多孔微粒色谱介质用于装填。

步骤1：组装柱体，其中玻璃料(如0.2μm或0.5μm玻璃料)和末端接头在一端上，且另一端连接于适配器，所述适配器连接于与装填泵连接的柱装填储集器。柱垂直置放，其中末端接头在柱下端，且适配器和柱装填储集器在上端。装填泵可适合地为恒定压力或恒定流速泵。装填泵装备有含有装填或推进溶液的瓶子或储集器，所述装填或推进溶液可为水基的，或有机溶剂基的，如甲醇、异丙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、己烷、庚烷等，以及这些的任何两种或更多种的混合物。然而，根据本发明的方面，优选的是使用水基推进溶液，如以下中的一种：纯水；含有如表面活性剂、盐、酸和/ 或碱的添加剂的水溶液；水和溶剂的混合物(其中水为至少50重量％且优选地至少90 重量％)；或溶剂和含有如酸、碱、表面活性剂和/或盐的添加剂的水溶液的混合物(其中水为混合物的至少50重量％且优选地至少90重量％)。

步骤2：测量色谱介质粒子的适当量，即填充柱的量。粒子可为多孔、表面多孔或无孔的。粒子应选自纯二氧化硅、有机-二氧化硅混成物、金属-氧化物、有机聚合物类粒子。粒度应为0.5到10μm，优选地1到5μm，且最优选1到2μm。介质粒子可接着分散于浆料溶液中，直到获得均一分散的浆料。浆料溶液可为水基的，或有机溶剂基的，如甲醇、异丙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、己烷、庚烷等，以及这些的任何两种或更多种的混合物。然而，根据本文所述的方面，优选的是使用水基推进溶液，如以下中的一种：纯水；含有如表面活性剂、盐、酸和/或碱的添加剂的水溶液；水和溶剂的混合物(其中混合物为至少50重量％水且优选地至少90重量％水)；或溶剂和含有如酸、碱、表面活性剂和/或盐的添加剂的水溶液的混合物(其中混合物为至少50重量％水且优选地至少90重量％水)。

步骤3：将来自步骤2的所得浆料倾倒到装填储集器中，且空柱连接在装填储集器的底部处。粒子的浆料在此阶段(即，在施加泵送压力之前)利用重力下降到空柱中。装填储集器可接着用盖子封闭。

步骤4-第一装填阶段：推进所述推进溶液通过装填储集器和用装填泵装填的柱，所述装填泵经控制以施加所选第一压力，且使压力在所选压力下保持恒定持续特定时间段。为了形成良好装填的床，施加在100-1500巴范围内的所选压力。所选压力通过压力斜变(其可为突然或渐进的压力变化)达到，且接着保持所达到的所选压力持续在20 分钟到48小时范围内的时间段(优选地2到25小时，或5到10小时，例如约15小时)。

步骤5-第二装填阶段：施加第二较高压力以推进所述推进溶液通过装填储集器和用装填泵装填的柱。已发现这会进一步使柱中的装填床稳定。第二较高压力应在200-4000 巴范围内，且通过以下方式达到：使装填压力增加到较高压力，随后使压力在第二较高压力下保持恒定持续在20分钟到48小时范围内的特定时间段(优选地0.5到25小时且尤其0.5到5小时，或0.5到1小时)。

步骤6：释放压力，拆卸柱，且放置玻璃料和末端接头在柱的另一端上。

步骤7：在使用和/或测试之前用洗涤溶剂或溶液，例如用乙腈，且接着优选地用流动相洗涤装填柱。

在以下实例中，将两种类型的色谱介质装填到柱中：

介质1：1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18粒子；和

介质2：1.9μm完全多孔的二氧化硅类C18粒子。

实例1-使用水基装填方法将介质1装填到100×2.1mm柱中

使0.45g介质1粒子悬浮于20mL浆料溶液(0.5:0.5:99，十二烷基硫酸钠/乙醇/水，以重量比计)中。将所得浆料倾入到装填储集器中，所述装填储集器连接于下部末端装有第一玻璃料和末端接头的100×2.1mm柱坯。在闭合储集器盖子之后，压力在水作为推进溶液的情况下斜变到600-1000巴范围。在使装填压力在相同压力(800巴)下保持 2到24小时之后，使装填压力增加到1500-3000巴范围且在相同压力(2400巴)下保持 0.5到24小时。释放压力，且在柱上组装第二玻璃料和末端接头代替装填储集器。柱用 100％乙腈洗涤持续20个柱体积。测试柱性能，且测试结果示出在图3(色谱性能)的色谱图a中。还在柱经历稳健性测试之前和之后测试柱性能，其分别示出在图5(稳健性)的色谱图a和b中。

实例2-使用溶剂基装填方法将介质1装填到100×2.1mm柱中

使0.45g介质1粒子悬浮于20mL浆料溶液中(10:90，甲醇/氯仿，以重量比计)。将所得浆料倾入到装填储集器中，所述装填储集器连接于下部末端装有第一玻璃料和末端接头的100×2.1mm柱坯。在闭合储集器盖子之后，压力在甲醇作为推进溶液的情况下斜变到600-1000巴范围。在使装填压力在相同压力(800巴)下保持2到24小时之后，使装填压力增加到1500-3000巴范围且在相同压力(2400巴)下保持0.5到24小时。释放压力，且在柱上组装第二玻璃料和末端接头代替装填储集器。柱用100％乙腈洗涤持续20个柱体积。接着测试柱性能，且测试结果示出在图3的色谱图b中。

下文给出所进行的色谱评估(柱性能测试)和柱稳健性评估的详情。

实例3使用水基装填方法在820巴下将介质1装填到50×2.1mm柱中

使0.25g介质1粒子悬浮于20mL浆料溶液(0.25:0.25:95.5，十二烷基硫酸钠/乙醇 /水，以重量比计)中。将所得浆料倾入到连接于50×2.1mm柱坯的装填储集器中。在闭合储集器盖子之后，压力在水作为推进溶液的情况下斜变到600-1000巴范围。在使装填压力在相同压力(820巴)下保持2到24小时(在此实例中15小时)之后，释放压力，且在柱上组装玻璃料和末端接头代替装填储集器。柱用100％乙腈洗涤持续20个柱体积。还在柱经历稳健性测试之前和之后测试柱性能，其分别示出在图4a的色谱图a 和b中。

实例4使用水基装填方法在2400巴下将介质1装填到50×2.1mm柱中

使0.25g介质1粒子悬浮于20mL浆料溶液(0.25:0.25:99.5，十二烷基硫酸钠/乙醇 /水，以重量比计)中。将所得浆料倾入到连接于50×2.1mm柱坯的装填储集器中。在闭合储集器盖子之后，压力在水作为推进溶液的情况下斜变到600-1000巴范围。在使装填压力在相同压力(800巴)下保持2到24小时(在此实例中15小时)之后，装填压力增加到1500-3000巴范围且在相同压力(2400巴)下保持0.5到24小时(在此实例中 1小时)。接着，释放压力，且在柱上组装玻璃料和末端接头。柱用100％乙腈洗涤持续 20个柱体积。还在柱经历稳健性测试之前和之后测试柱性能，其分别示出在图4b的色谱图a和b中。

实例5-使用2阶段水基装填方法在2400巴下将介质2装填到200×2.1mm柱中

使0.60g介质2粒子悬浮于20mL浆料溶液(0.5:0.25:99.25，十二烷基硫酸钠/乙醇 /水，以重量比计)中。将所得浆料倾入到连接于200×2.1mm柱坯的装填储集器中。在闭合储集器盖子之后，压力在水作为推进溶液的情况下斜变到600-1000巴范围。在使装填压力在相同压力下保持2到24小时(15小时)之后，使装填压力增加到1500-3000 巴范围且在相同压力下保持0.5到24小时(1小时)。接着，释放压力，且在柱上组装玻璃料和末端接头。柱用100％乙腈洗涤持续20个柱体积。还在柱经历稳健性测试之前和之后测试柱性能，其分别示出在图6的色谱图a和b中。

实例6-使用2阶段溶剂基装填方法在2400巴下将介质2装填到150×2.1mm柱中

使0.42g介质2粒子悬浮于20mL浆料溶液中(10:90，甲醇/氯仿，以重量比计)。将所得浆料倾入到连接于150×2.1mm柱坯的装填储集器中。在闭合储集器盖子之后，压力在甲醇作为推进溶液的情况下斜变到600-1000巴范围。在使装填压力在相同压力下保持2到24小时之后，使装填压力增加到1500-3000巴范围且在相同压力下保持0.5到 24小时。接着，释放压力，且在柱上组装玻璃料和末端接头。柱用100％乙腈洗涤持续 20个柱体积。还在柱经历稳健性测试之前和之后测试柱性能，其分别示出在图7a的色谱图a和b中。

实例7-使用2阶段水基装填方法在2400巴下将介质2(1.9μm完全多孔的二氧化硅类C18)粒子装填到150×2.1mm柱中

使0.42g介质2粒子悬浮于20mL浆料溶液(0.5:0.25:97.25，十二烷基硫酸钠/乙醇 /水，以重量比计)中。将所得浆料倾入到连接于150×2.1mm柱坯的装填储集器中。在闭合储集器盖子之后，压力在水作为推进溶液的情况下斜变到600-1000巴范围。在使装填压力在相同压力下保持2到24小时之后，使装填压力增加到1500-3000巴范围且在相同压力下保持0.5到24小时。接着，释放压力，且在柱上组装玻璃料和末端接头。柱用 100％乙腈洗涤持续20个柱体积。还在柱经历稳健性测试之前和之后测试柱性能，其分别示出在图7b的色谱图a和b中。

色谱评估

柱性能测试

柱性能用中性疏水性探针(邻二甲苯)评估效率和峰拖尾因子。下文给出色谱条件：

柱：介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)

尺寸：2.1×50mm、2.1×100mm和2.1×150mm

流动相：MeCN/H2O＝50/50(v/v)

温度：30℃

流速：0.40mL/min

注射体积：1μL

检测：UV(254nm)

样品组成：

1.茶碱(0.008mg/mL

2.邻硝基苯胺(0.025mg/mL)

3.苯甲酸甲酯(0.18mg/mL)

4.苯乙醚(0.30mg/mL)

5.邻二甲苯(0.48mg/mL)

柱：介质2(1.9μm完全多孔的二氧化硅类C18)

尺寸：2.1×50mm、2.1×100mm、2.1×150mm和2.1×200mm

流动相：MeCN/H2O＝50/50(v/v)

温度：30℃

流速：0.50mL/min

注射体积：1μL

检测：UV(254nm)

样品组成：

1.茶碱(0.032mg/mL

2.邻硝基苯胺(0.10mg/mL)

3.苯甲酸甲酯(0.71mg/mL)

4.苯乙醚(01.2mg/mL)

5.邻二甲苯(1.92mg/mL)

相应介质的柱性能测试的结果示出在图3、4a、4b、5、6、7a和7b中。

柱装填稳健性评估(UHPLC条件模拟)

柱装填质量利用以下方法评估：

1.柱性能测试在新鲜装填的柱上进行，

2.在1500巴压力评定UHPLC仪器上，柱压力在0(保持2分钟)与1500巴(保持3分钟)之间来回变化100个周期。图2展示典型压力迹线。

3.重复柱性能测试。

稳健性测试的具体条件为：

柱：介质1(表面多孔的C18，1.5μm)

尺寸：2.1×100mm

流动相：50/50A:B

A：水

B：乙腈

温度：30℃

样品：无

注射体积：无

检测：压力(巴)

流速：每一周期0.675mL/min在1500巴下持续3分钟，

0mL/min在0巴下持续2分钟

(100个周期；10展示在图1中)

图2展示对装填有介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子的100×2.1mm 柱的柱装填稳健性测试的典型压力迹线。

图3展示在使用实例1和2的水基和溶剂基装填方法两者在2400巴下用介质1(1.5 μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的两个100×2.1mm柱之间的柱性能比较。明显的是，水性装填方法提供与其中可见显著拖尾的溶剂装填相比改进的装填质量。

图4a和4b展示出在对使用水基装填方法在820巴(以上实例3)和2400巴(以上实例4)下用介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的两个50×2.1mm 柱的稳健性测试之前和之后的柱性能结果。尽管两个柱最初均展现良好性能测试结果，但连续的稳健性测试揭露出，对比在低压下一步法装填的严重峰分离，在较高压力(2400 巴)下用合并步骤装填的柱获得优异的柱装填质量，且柱效率降低小于3％。

图5展示在对使用2阶段水基装填方法在2400巴下用介质1(1.5μm表面多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的100×2.1mm柱(以上实例1)的稳健性测试之前和之后的柱性能结果。在0与1500巴之间波动大量时间段后，柱性能保持良好(例如效率降低<10％)。

图6展示在对使用2阶段水基装填方法在2400巴下用介质2(1.9μm多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的200×2.1mm柱(以上实例5)的稳健性测试之前和之后的柱性能结果。在0与1500巴之间波动大量时间段后，柱性能保持良好。

图7a和7b展示在对使用2阶段溶剂基(图7a的色谱图a和b)和水基装填方法(图7b的色谱图a和b)在2400巴下用介质2(1.9μm多孔的二氧化硅类C18)粒子装填的两个150×2.1mm柱(分别为实例6和7)的稳健性测试之前和之后的柱性能结果。尽管两个柱最初均展现良好性能测试结果，但连续的稳健性测试揭露出，与用溶剂装填方法装填的柱(在稳健性测试之后效率损失35％)相比，用水性装填方法装填的柱获得优异的柱装填质量，且柱效率降低小于4％。

其它实验数据提供在以下表1中。

表1：

由以上描述可见，本发明可根据以下经编号条款提供：

一种装填色谱柱的方法，其包括：

将色谱介质粒子分散在水基浆料溶液中以形成浆料；

通过将所述浆料引入到色谱柱中来用所述色谱介质粒子填充所述柱；以及

施加压力以将所述色谱介质粒子装填在所述色谱柱中。

根据条款i所述的方法，其中所述水基浆料溶液为100重量％水、或至少90重量％、或至少95重量％、或至少99重量％水。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述水基浆料溶液含有有机溶剂，其量以100 重量份水计为不超过100重量份、不超过50重量份、或不超过40重量份、或不超过30 重量份、或不超过20重量份、或不超过10重量份、或不超过5重量份、或不超过1重量份有机溶剂。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述水基浆料溶液以100重量份水计进一步包括：

0-50、或0-40、或0-30、或0-20或0-10或0-5或0-1重量份表面活性剂；

0-50、或0-40、或0-30、或0-20或0-10或0-5或0-1重量份电解质或盐(除离子型表面活性剂以外)；

0-100、或0-50、或0-30、或0-20或0-10或0-5或0-1重量份酸；以及

0-100、或0-50、或0-30、或0-20或0-10或0-5或0-1重量份碱。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述施加的压力包括至少500巴、或至少800 巴、或至少1000巴、或至少1300巴、或至少1500巴、或至少2000巴的压力持续一段时间。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述压力以第一压力施加且大体上保持恒定持续第一时间段，且在所述第一时间段之后，以高于所述第一压力的第二压力施加且大体上保持恒定持续第二时间段。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述第一压力在100-1500巴范围内，或在 100-1300巴范围内，或在100到1000巴范围内，或在300到1000巴范围内，或在500 到1000巴范围内；且所述第二压力在1500到6000巴范围内，或在1500到5000巴范围内，或在1500到4000巴范围内，或在1500到3000巴范围内。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述第一压力在100-1500巴范围内；且所述第二压力在1500到4000巴范围内或在1500到4000巴范围内。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述第一时间段在0.1-100小时范围内或在0.2 到50小时范围内，且所述第二时间段在0.1-100小时范围内或在0.2到50小时范围内。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述柱的内径为10μm到5mm，或100μm到 5mm；且所述柱的长度为20mm到10,000mm或20mm-1,000mm。

根据任何前述条款所述的方法，其中所述色谱介质粒子具有1到5μm的中值粒子直径且为完全多孔或表面多孔的。

一种装填色谱柱的方法，其包括：

将色谱介质粒子分散在浆料溶液中以形成浆料；

通过将所述浆料引入到色谱柱中来用所述色谱介质粒子填充所述柱；以及

施加压力以将所述色谱介质粒子装填在所述色谱柱中，其中所述压力以第一压力施加且大体上保持恒定持续第一时间段，且在所述第一时间段之后，以高于所述第一压力的第二压力施加且大体上保持恒定持续第二时间段。

根据条款xii所述的方法，其中所述第一压力在100-1500巴范围内，或在100-1300 巴范围内，或在100到1000巴范围内，或在300到1000巴范围内，或在500到1000 巴范围内；且所述第二压力在1500到6000巴范围内，或在1500到5000巴范围内，或在1500到4000巴范围内，或在1500到3000巴范围内。

根据条款xii到xiii中任一项所述的方法，其中所述第一压力在100-1500巴范围内；且所述第二压力在1500到4000巴范围内或在1500到3000巴范围内。

根据条款xii到xiv中任一项所述的方法，其中所述第一时间段在0.1-100小时范围内且所述第二时间段在0.1-100小时范围内。

根据条款xii到xv中任一项所述的方法，其中所述柱的内径为10μm到5mm，或 100μm到5mm；且所述柱的长度为20mm到10,000mm或20mm-1,000mm。

根据条款xii到xvi中任一项所述的方法，其中所述色谱介质粒子具有1到5μm的中值粒子直径且为完全多孔或表面多孔的。

一种用于在至少500巴、或至少1000巴、或至少1300巴或至少1500巴的液体压力下操作的液相色谱柱，其中色谱介质粒子已从水基浆料溶液装填到所述柱中。

根据条款xviii所述的液相色谱柱，其中色谱介质粒子已在所施加的压力下从所述水基浆料溶液装填到所述柱中，所述施加的压力以第一压力大体上恒定持续第一时间段，且在所述第一时间段之后，以高于所述第一压力的第二压力保持大体上恒定持续第二时间段。

一种用于在至少500巴、或至少1000巴、或至少1300巴或至少1500巴的液体压力下操作的液相色谱柱，其中色谱介质粒子已在所施加的压力下从浆料溶液装填到所述柱中，所述施加的压力以第一压力大体上恒定持续第一时间段，且在所述第一时间段之后，以高于所述第一压力的第二压力保持大体上恒定持续第二时间段。

根据条款xviii到xx中任一项所述的液相色谱柱，其中在向所述柱施加的压力在0 巴持续2分钟与1500巴持续3分钟之间来回变化100次之后，柱效率(每米理论板数， N/m)变化小于10％。

根据条款xviii到xxi中任一项所述的液相色谱柱，其中在向所述柱施加的压力在0 巴持续2分钟与1500巴持续3分钟之间来回变化100次之后，峰拖尾因子变化(增加) 小于15％。

根据条款xviii到xxii中任一项所述的液相色谱柱，其中在向所述柱施加的压力在0 巴持续2分钟与1500巴持续3分钟之间来回变化100次之后，反压变化(增加)小于 10％。

如本文所使用(包括在权利要求书中)，除非上下文以其它方式指示，否则本文中的术语的单数形式将被解释为包括复数形式，且反之亦然。举例来说，除非上下文以其他方式指示，否则如“一个(a)”或“一个(an)”的单数引用意味着“一个或多个”。

遍及本说明书的描述和权利要求书，词“包含”、“包括”、“具有”和“含有”以及这些词的变化形式(例如“包含着(comprising)”和“包含了(comprises)”等) 意指“包括但不限于”，并且并不打算(并且并不)排除其他组分。

应了解，可以对本发明的上述实施例作出变化，但这些变化仍属于本发明的范围内。除非另外说明，否则本说明书中所揭示的每一特征都可被用于相同、等效或类似目的的替代性特征替换。因此，除非另外说明，否则所揭示的每个特征仅是一系列通用等效或类似特征的一个实例。

本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(“举例来说”、“如”、“例如(for example)”、“例如(e.g.)”和类似语言)的使用打算仅更好地说明本发明，且并不指示对本发明的范围的限制，除非另外主张。本说明书中的任何语言都不应该理解为指示实施本发明所必需的任何未主张要素。

本说明书中描述的任何步骤可按任何次序执行或同时执行，除非另外规定或上下文另外要求。

本说明书中所揭示的全部特征可以任何组合形式组合，但所述特征和/或步骤中的至少一些会互斥的组合除外。具体地说，本发明的优选的特征适用于本发明的所有方面且可以任何组合形式使用。同样，可单独地使用(不以组合形式)以非必需组合形式描述的特征。