一种利用异养微生物去除硫化氢的方法与流程

文档序号:17656580发布日期:2019-05-15 22:03阅读:1224来源:国知局

本发明涉及一种生物去除硫化物的方法,尤其涉及一种利用异养微生物去除硫化物(H2S、HS-或/和S2-)的方法。



背景技术:

硫化氢是有刺激性气味的有毒气体,是工业生产过程中(如污水处理厂,畜牧业以及堆肥厂等)广泛存在的主要废气成分。目前,硫化氢有害气体的去除方法主要分为物理法,化学法和生物法,其中生物方法去除硫化氢相较于化学法和物理法有着不可替代的优势,应用前景较为广泛。

在生物去除硫化氢的过程中微生物对硫化氢的氧化吸收起到至关重要的作用。目前对于好氧的硫化氢生物去除反应器中微生物的接种方法主要有驯养法和人工接种法。驯养法是指在通入含有硫化氢的气体之前先在装置中加入营养液使装置中的微生物自然生长,然后通入含有硫化氢的气体使部分能够起到硫化氢去除作用的微生物起作用,通过如此长时间的驯化,能够去除硫化氢的微生物会得到富集,而不能去除硫化氢的微生物会被淘汰,可以看出这种方法对微生物的选择具有盲目性。人工接种法又分两种,一种是接种具有硫化氢去除能力的活性污泥,这种方法实际上与上述驯养法具有同样的盲目性;另一种是接种能够去除硫化氢的纯培养微生物,主要指早期发现的可以利用硫化氢作为电子供体生成能量供自身生长的化能自养和光能自养微生物,也就是通常指的是硫杆菌属(Thiobacillus),硫化叶菌属(Sulfolobus),或绿硫细菌(Chlorobium)。然而,此类自养细菌相较于异养细菌生长缓慢,难以形成较大生物量,并且其生长通常需要偏酸性的环境,而酸性条件却不利于硫化氢的吸收和氧化。经检索,利用异养微生物在有氧条件下去除硫化氢的方法还未见报到。



技术实现要素:

针对现有技术中驯养法的盲目性问题以及自养细菌去除硫化氢应用的局限,本发明的目的是提供一种利用异养微生物去除硫化氢(H2S、HS-或/和S2-)的方法。

本发明所述利用异养微生物去除硫化物的方法,是在去除硫化物的装置中加入生长稳定期的异养微生物,在设定反应体系下进行好氧反应,实现对装置反应体系中的H2S、HS-或/和S2-去除;

其特征在于:

所述异养微生物是指其基因组中含有硫醌氧化还原酶(sulfide:quinone oxidoreductase,sqr)基因和硫双加氧酶(persulfid dioxygenase,pdo)基因的一类异养微生物;

所述反应体系是:浓度为50±5mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES:4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)缓冲液,或是在中性pH值下有缓冲能力且对所述异养微生物无害的缓冲液;其中该反应体系中还加有浓度为10μM~1000μM的硫化钠,且该反应体系中含有的异养微生物细菌浊度OD600nm=0.5~10;

所述好氧反应条件是:温度10℃~40℃,pH 6~9,200±50r.p.m.震荡;

所述装置反应体系中的H2S、HS-或/和S2-去除后,根据所用异养微生物菌株的不同其产物是硫脘硫和硫代硫酸盐,或硫酸盐。即:是利用异养微生物将硫化氢氧化后转化成硫代硫酸盐和硫脘硫,或者完全的氧化成硫酸盐。

上述利用异养微生物去除硫化氢的方法中:所述异养微生物优选是氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)621H、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、罗尔斯通氏菌(Cupriavidus necator)JMP134、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416。

进一步的,所述异养微生物的培养方法是:在特定培养基中30±2℃、200±10r.p.m.震荡培养24±4小时至细菌生长周期达到稳定期;

其中:所述特定培养基配方是:工业发酵用葡萄糖30g/L,工业发酵用玉米浆干粉15g/L。

上述利用异养微生物去除硫化氢的方法中,所述反应体系优选是:浓度为50mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液,其中该反应体系中还加有浓度为20μM~800μM的硫化钠,且该反应体系中含有的异养微生物细菌浊度OD600nm=1~8。

上述利用异养微生物去除硫化氢的方法中,所述好氧反应条件优选是:温度20℃~37℃,pH 7~8,120±20r.p.m.震荡。

上述利用异养微生物去除硫化氢的方法中,所述恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、罗尔斯通氏菌(Cupriavidus necator)JMP134、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416菌株在好氧反应体系中氧化硫化氢的能力随着外源添加硫化氢、多硫化物或单质硫的诱导而增强。

本发明申请人发现了一系列的含有硫化氢氧化系统的异养微生物可以高效迅速的氧化外源硫化氢,视细菌不同,其产物为硫脘硫和硫代硫酸盐或者为硫酸盐。实验证实这些异养微生物相较于自养微生物具有生长迅速,生物量大,培养方便经济的特点。且其单位干重氧化速率与之前报道的自养细菌氧化硫化物速率相当。基于此,本发明提供了一种利用异养微生物去除硫化氢的方法,该方法很好的解决了现有技术中硫化氢去除的不足,在工业生产中具有很大的应用潜力。

综上,本发明与现有技术相比具有如下优点:

1.本发明根据细菌基因组信息寻找含有氧化硫化氢关键酶基因的异养细菌是有目的的筛选过程,筛选出的异养细菌具有非常高效的氧化外源硫化氢的能力,相比于已报道的自养细菌[Immobilized-Cell and Sulfur-Settling Free-Cell Recycle Reactors.Biotechnology Progress,1991.7(6):p.495-500.],其中氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)621H的氧化能力更高,而其他菌氧化能力与之相当(图2)。

2.本发明筛选出的一系列异养细菌可以根据菌株的不同控制硫化物的氧化产物为硫代硫酸盐和硫脘硫,或者为硫酸盐。

3.本发明筛选出的异养细菌其氧化硫化氢的能力具有诱导效应。即当外源存在硫化氢时,诱导其氧化硫化氢相关基因更多的表达使其氧化硫化物的能力得到增强。

4.异养细菌生长迅速,培养方便,培养成本低。

5.本发明筛选出的细菌具有相当高的耐受性,在外源硫化氢浓度达到1mM时,仍然能够高效去除。

附图说明

图1.氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)621H、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、罗尔斯通氏菌(Cupriavidus pinatubonensis)JMP134、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416五株细菌具有明显的氧化外源硫化氢能力。

图2.氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)621H、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、罗尔斯通氏菌(Cupriavidus pinatubonensis)JMP134、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416五株细菌氧化外源硫化氢速率。(单位细胞干重,单位时间内氧化外源硫化氢的量。)

图3.硫化氢,多硫化物和单质硫对罗尔斯通氏菌(Cupriavidus pinatubonensis)JMP134(A)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(B)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 2541(C)、或恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16(D)氧化硫化氢的诱导效应。

图4.氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)621H、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、罗尔斯通氏菌(Cupriavidus pinatubonensis)JMP134、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416五株细菌氧化硫化氢的终产物。

具体实施方式

下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是,这些实施例仅仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。

氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)621H、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection),罗尔斯通氏菌(Cupriavidus pinatubonensis)JMP134购自通派(上海)生物科技有限公司。

异养微生物的培养基配方:工业发酵用葡萄糖,30g/L;工业发酵用玉米浆干粉,15g/L。

HEPES缓冲液组成为(1升双蒸水):4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES:4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)13g,二乙烯三胺五乙酸(DTPA:diethylenetriaminepentaacetic acid)0.02g,NaOH调节pH至7.4。

硫化氢的检测方法为:取1ml样品,加入80ul混合双氨试剂,混合后于室温放置20min,测量OD670nm下的吸光度,如果吸光度超过1,将样品用去离子水稀释后再测量。混合双氨试剂的配方如下表1:

表1:根据硫化氢的预计浓度选择两种不同的配方。

多硫化物的制备:13mg硫粉和70mg硫化钠加入到预先用氩气除氧的蒸馏水中,密封,pH值用盐酸调整至9.3。

丙酮硫的制备:将过量硫粉加入丙酮中,震荡充分溶解,饱和溶液约含20mM硫。

硫脘硫的检测方法为:加0.55ml 1%硼酸至1.5ml EP管中,在沸水中加热1min,加入0.25ml样品,加入0.2ml 0.1M氰化钾加热1min.室温下冷却,加入0.1ml硝酸铁试剂,立刻混合,如果有细胞,则离心去除,测量OD460nm,空白对照采用去离子水。

亚硫酸盐,硫酸盐和硫代硫酸盐采用离子色谱(ICS-1100system;Dionex)检测,具体条件为:流动相流速:1ml/min,柱温:30℃,抑制器类型:ASRS_4mm,抑制器电流:55mA,压力范围:200-3000psi.KOH=20mM,亚硫酸盐,硫酸盐和硫代硫酸盐的出峰时间分别为7.4分钟,7.9分钟,25.7分钟。

实施例1:五株异养细菌氧化硫化氢速率研究。

将五株异养细菌(氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)621H、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、罗尔斯通氏菌(Cupriavidus necator)JMP134、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416)在30摄氏度200rpm震荡培养培养20小时以上,细菌浊度大于OD600nm=4时,离心收集细胞,并用纯水清洗一遍,然后将处理好的异养菌细胞溶解于pH=7.4的、含有50μM二乙烯三胺五乙酸(DTPA:diethylenetriaminepentaacetic acid)的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES:4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)缓冲液中,并调节细菌浊度为OD600=2。应用时,也可将培养好的菌液直接或稀释后用来处理硫化物。

将10mL调节后的异养菌细胞悬液加入到50mL离心管中,随即加入新鲜配制的终浓度为200μM硫化钠起始反应,整个反应条件为30℃轻微震荡(100±10r.p.m.),并在10分钟,30分钟,60分钟三个时间点取样测定体系中硫化氢的剩余浓度。

反应完成后再次离心收集细胞,在纯水中清洗三次,去除上清,然后转移入冷冻干燥机中冷冻干燥12小时以上,测定细胞干重。通过硫化氢浓度的变化速度和细胞干重计算出每株细菌单位细胞干重,单位时间氧化外源硫化氢的速率。

经以上方法检测,上述五株带有硫化氢氧化系统的异养细菌均具有明显的高效氧化外源硫化氢的能力,详见图1。

经计算,它们氧化外源硫化氢的速率在6至50μmol·min-1·g(细胞干重)-1之间,详见图2。

实施例2:硫化氢的诱导效应研究。

将罗尔斯通氏菌(Cupriavidus pinatubonensis)JMP134、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 2541、或恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16菌按实施例1中方法培养到对数生长前期时(OD600=0.5),在培养基中额外添加终浓度为20μM Na2S、多硫化物或丙酮硫,继续培养诱导1小时,然后按实施例1中方法收集菌体,测定硫化氢氧化速率,并与未经诱导的对照组比较,结果显示硫化氢、多硫化物以及丙酮硫都可以诱导细菌而使其氧化硫化氢的能力增强,详见图3。

实施例3:硫化氢氧化产物研究。

按照实施例1中的条件,将五株异养细菌(氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)621H、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)S16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、罗尔斯通氏菌(Cupriavidus necator)JMP134、或洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416)培养20小时以上,当细菌浊度大于OD600=4时,离心收集细胞,并用纯水清洗一遍,然后将处理后细胞溶解于pH=7.4的、含有50μM二乙烯三胺五乙酸(DTPA:diethylenetriaminepentaacetic acid)的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES:4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)缓冲液中,并调节细菌浊度OD600=8。

将10mL调节后的异养菌细胞悬液加入到50mL离心管中,随即加入新鲜配制的终浓度为800μM硫化钠起始反应,整个反应条件为30℃轻微震荡(100r.p.m.),并在30分钟,60分钟,120分钟三个时间点取样测定体系中硫化氢的剩余浓度,同时测试硫脘硫,亚硫酸盐,硫酸盐和硫代硫酸盐的产生情况。

结果显示在六小时内C.necator JMP134将硫化氢氧化成了硫酸盐,而恶臭假单孢菌(P.putida)S16、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1、洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)ATCC 25416和氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)621H氧化硫化氢的最终产物是硫脘硫和硫代硫酸盐(见图4)。

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