领域
本文提供了测定板及其用途。具体来说，本文提供了用于进行生物和化学测定并检测测定结果的测定板。
背景
当今一项有力的且广泛使用的诊断技术，酶联免疫吸附测定(elisa)，需要提高灵敏度并减少测定次数。当今elisa主要的检测原理是以紫外可见光吸收、化学发光、和荧光检测为基础。传统elisa的缺点是：(1)测试时间长(3-6小时+隔夜涂层)，这使得在应对应当在15-30分钟内获取结果的紧急护理时(诸如心脏病发作、感染性休克、创伤性脑损伤等)elisa几乎毫无用处；(2)样本和试剂消耗量大(每个传感器孔50-100μl)，这对客户显著增加了成本(每次测试～$200)；以及(3)检测极限不足，通常量级在10-100pg/ml，这使得在低浓度下测量许多临床上重要的生物标记是不可能的。所有这些缺点阻碍了elisa在需要快速、低成本、高灵敏度测试痕量分析物的各种应用中的采用。
概要
本文提供了测定板及其用途。具体来说，本文提供了用于进行生物和化学测定并检测测定结果的测定板。
例如，在一些实施方式中，本公开内容提供了一种光流控阵列板(optofluidicarrayplate)，包括：多个孔(well)，其中各孔包括液体入口；光学上清晰的检测通道，包括多个微柱；以及液体出口。在一些实施方式中，入口与所述检测通道偏移。在一些实施方式中，检测通道包括多个曲线(例如，对称的、u形的曲线)。在一些实施方式中，入口是漏斗。在一些实施方式中，出口是喷嘴。在一些实施方式中，阵列板的底部表面包括反射层(例如，金属层)。在一些实施方式中，阵列板包括96孔或由96孔组成，然而也特别地考虑了其它尺寸(如，2、4、6、24、96、384或1536孔)。
另外的实施方式提供了一种系统，包括：a)如本文所述的阵列板；以及b)配置为附接至阵列板底部的底板或底膜(如，具有模切洞(diecuthole)的粘附膜)，其中底板包括与各孔相对应的多个底开式流体出口。在一些实施方式中，阵列板和底板密闭地密封。在一些实施方式中，该系统还包括液体输送泵。在一些实施方式中，该系统还包括多个测定试剂(例如，缓冲液、核酸引物、核酸探针、抗体或检测试剂)。在一些实施方式中，该系统还包括检测组件(例如，酶标仪(platereader)或分光光度计)。
另一些实施方式提供了进行测定的方法，包括：a)将疑似包括分析物的样本与如本文所述的系统接触；以及用所述系统进行检测测定。在一些实施方式中，分析物是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，测定是免疫测定(如，elisa)、核酸扩增测定、或核酸杂交测定。在一些实施方式中，该方法检测所述样本中所述分析物的存在。
本文描述了另外的实施方式。
附图说明
附图有助于对本技术的各种非限制性实施方式的理解。
图1a示出了嵌有微柱阵列的光流控多孔板的俯视图；图1b示出了其仰视图；图1c示出了其正视图；图1d示出了其后视图；图1e示出了其左侧正视图；以及图1f示出了其右侧正视图。
图2a示出了嵌有微柱阵列的光流控多孔板的分解立体视图；图2b示出了其立体视图；以及图2c示出了具有其隐藏线的立体视图。
图3a示出了部分a的等轴侧视图；以及图3b示出了其仰视图。
图4a示出了部分b的等轴侧视图；以及图4b示出了其仰视图。
图5a示出了嵌有微柱阵列的光流控模块；以及图5b示出了嵌有微柱阵列的光流控通道的细节。
图6a显示了完全组装的嵌有微柱阵列的光流控多孔板以俯视立体视角描绘的3d图像；以及图6b显示了其以仰视立体视角描绘的3d图像。
图7示出了制成的(a)部分a、(b)部分b、以及(c)模切粘附膜的照片。
图8示出了3x3孔的显微镜图像(0.008inx0.008in通道)(a)光流控模块、以及(b)微柱(箭头)阵列布局。
图9示出了制成的部分a的照片(0.018inx0.022in通道)，清晰且透明的光流控孔板的(a)正面、以及(b)背面视图。
图10示出了制成的部分a的照片(0.018inx0.022in通道)，黑色且不透明的光流控孔板的(a)正面、以及(b)背面视图。
图11示出了3x3孔的光流控模块的显微镜图像(0.018inx0.022in通道)以及微柱(箭头)阵列布局。
图12示出了3d打印的孔板适配器(黑色)的照片。
图13示出了三个不同孔板的运行间(run-to-run)变异的比较；(1)传统的96孔板、(2)optimisertm孔板、以及(3)本公开内容的实施方式的光流控孔板。
图14示出了三个不同孔板的孔间(well-to-well)变异的比较；(1)传统的96孔板、(2)optimisertm孔板、以及(3)本公开内容的实施方式的光流控孔板。
图15示出了具有不同通道尺寸的0.5μm罗丹明6g(rhodamine6g)的荧光强度的比较。
图16示出了(a)使用清晰且透明的孔板的荧光、(b)使用清晰且透明的孔板的化学发光、以及(c)使用黑色且不透明的孔板的化学发光的串扰分析。
图17示出了使用本公开内容的实施方式的清晰且透明的光流控孔板(0.008inx0.008in通道)的荧光检测方法和统计分析的缓冲液中的il-6的标准曲线；(a)来自各浓度的三个数据点与四参数逻辑(4-pl)曲线拟合、(b)三个孔的标准偏差的平均值、(c)变异系数、以及(d)各il-6浓度的p值。
图18示出了使用本公开内容的实施方式的清晰且透明的光流控孔板(0.018inx0.022in通道)的荧光检测方法和统计分析的缓冲液中的il-6的标准曲线；(a)来自各浓度的三个数据点与四参数逻辑(4-pl)曲线拟合、(b)三个孔的标准偏差的平均值、(c)变异系数、以及(d)各il-6浓度的p值。
图19示出了使用本公开内容的实施方式的清晰且透明的光流控孔板(0.018inx0.022in通道)的荧光检测方法和统计分析的血清中的il-6的标准曲线；(a)来自各浓度的三个数据点与四参数逻辑(4-pl)曲线拟合、(b)三个孔的标准偏差的平均值、(c)变异系数、以及(d)各il-6浓度的p值。
图20示出了使用本公开内容的实施方式的黑色且不透明的光流控孔板(0.018inx0.022in通道)的化学发光检测方法和统计分析的缓冲液中的il-6的标准曲线；(a)来自各浓度的三个数据点与四参数逻辑(4-pl)曲线拟合、(b)三个孔的标准偏差的平均值、(c)变异系数、以及(d)各il-6浓度的p值。
图21示出了使用本公开内容的实施方式的黑色且不透明的光流控孔板(0.018inx0.022in通道)的化学发光检测方法和统计分析的血清中的il-6的标准曲线；(a)来自各浓度的三个数据点与四参数逻辑(4-pl)曲线拟合、(b)三个孔的标准偏差的平均值、(c)变异系数、以及(d)各il-6浓度的p值。
图22示出了传统96孔板与光流控孔板(0.018inx0.022in通道)的比较；(a)使用荧光检测方法利用传统96孔板和清晰且透明的光流控孔板的缓冲液中的il-6的标准曲线、(b)使用荧光检测方法利用传统96孔板和清晰且透明的光流控孔板的血清中的il-6的标准曲线、(c)使用化学发光检测方法利用传统96孔板(康宁tm96孔清底黑色聚苯乙烯微孔板(corningtm96-wellclearbottomblackpolystyrenemicroplate))、以及黑色且不透明的光流控孔板的缓冲液中的il-6的标准曲线、以及(d)使用化学发光检测方法利用传统96孔板(康宁tm96孔清底黑色聚苯乙烯微孔板(corningtm96-wellclearbottomblackpolystyrenemicroplate))、以及黑色且不透明的光流控孔板的血清中的il-6的标准曲线。
定义
为有助于对本公开内容的理解，以下对若干术语和短语进行定义，或者可能在本公开内容的其它地方对术语进行定义：
术语“样本”使用其最广泛的意义。一方面，它意指包括样品或培养物。另一方面，它意指包括生物样本和环境样本。
生物样本可以是动物(包括人类)的流体、固体(例如，粪便)或组织，还有液体和固体食物以及饲料产品和成分，诸如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品以及废弃物。生物样本可以从各种家庭的家畜、还有凶猛的或野生的动物，包括但不限于，这样的动物如有蹄类动物、熊、鱼类、兔类、啮齿类动物等等或其组合中获得。
环境样本包括环境材料诸如地表物质、土壤、水和工业样本，还有从食物和乳制品加工仪器、装置、装备、器皿、一次性的和非一次性的物品或其组合获得的样本。这些实例不应解释为限制可适用于本公开内容的样本类型。
如本文中所用的，术语“体外”指的是人工环境和发生在人工环境中的过程或反应。体外环境可以由试管和/或细胞培养组成，但不限于试管和/或细胞培养。术语“体内”指的是自然环境(例如，动物或细胞)和发生在自然环境中的过程或反应。
术语“测试化合物”和“候选化合物”指的是作为用于治疗或预防疾病(disease)、病态(illness)、不适(sickness)或身体机能紊乱的候选物的任何化学实体、药品(pharmaceutical)、药物(drug)等等。测试化合物包括已知的和潜在的治疗性化合物。测试化合物可以通过使用本公开内容的筛选方法、设备、和/或系统进行筛选被确定治疗性。在本公开内容的某些实施方式中，测试化合物可以包括反义的、sirna和/或shrna化合物。
术语“球体(spheroid)”指的是细胞和/或细胞集落的群集(clusters)或聚集(aggregates)。球体可以由各种细胞类型，例如，原代细胞、细胞系、肿瘤细胞、干细胞等等而形成。球体可以具有球体状的或不规则的形状。球体可以包含细胞的异质群体、细胞类型、不同状态的细胞，诸如增殖细胞、休眠细胞以及坏死细胞。
详细描述
关于可共享共同的特性和特征的几种实施方式提供以下描述。可以理解的是，一种实施方式的一个或多个特征可以与其它实施方式的一个或多个特征组合。此外，任一实施方式的单一特征或特征组合可以构成额外的实施方式。
在本说明书中，词语“包括”应以其“开放的”含义来理解，即是，“包括”的意义，因此不限制于其“封闭的”含义，即是“仅由…组成”的意义。在词语“包括(comprise)”、“包括(comprised)”和“包括(comprises)”出现的地方，相应的意义应归属于相应的词语。
在详细描述中使用的主题标目仅用于便于读者参考而被包括，并且不应当被用于限制在整个公开内容或权利要求中所发现的主旨。主题标目不应当被用于解释权利要求或权利要求限制的范围。
本文提供了测定板及其用途。具体来说，本文提供了用于进行生物和化学测定并检测测定结果的测定板。在一些实施方式中，该板包括多个(例如，96)光流控模块，这些光流控模块符合标准96孔或其它尺寸的板的尺寸。因此，利用市场中任何可购得的标准酶标仪，该板可用于测量荧光、发光、拉曼散射、表面增强拉曼散射以及吸收。本公开内容不限制于96光流控孔板。在一些实施方式中，设计基于客户要求诸如光流控模块的期望数量及其位置、以及单个光流控模块的尺寸而定制。此外，在一些实施方式中，反射层涂覆在板的外表面上以提高光学检测效率。
本文所述的板提供了超越现有技术的显著优点。例如，远离检测区放置入口避免了对光学测量的潜在干扰并避免了留在入口内的任何残余液体的潜在干扰。这显著地减少了测量变异性并提高了信号强度(见实验部分)。此外，对称的通道允许光学检测位置中具有大的容差而没有信号变异。检测通道内包括柱体增加了表面体积比和/或质量输送率，以提高分析物捕获效率和被捕获分析物的总数。这减少了总体测定时间并增加了信号强度。此外，各柱体可作为光学波导工作以将光引导至光检测器，其进一步增加了信号强度。出口喷嘴和可选泵的添加增进了流体通道内的流动，这减少了测定时间和测量变异。测定板底部包括任选的反射层，将光反射回检测器并增加信号。
图1-12中示出了示例性板。虽然显示在附图中的这些板采用了96孔配置，但是也考虑其它配置。该板具有两个部分，顶部，部分a和底部，部分b。它们附接到一起并利用粘附膜或胶或使用超声波塑料焊接技术或其它适当的方法密闭地密封。可替代地，部分b可以替换为带有模切洞的粘附膜。在顶部部分a中，96个光流控模块被布置和定位在8x12格式阵列中，以利用市场可购的标准酶标仪读取。各模块具有流体入口和光流控通道回路。96个底开式流体出口位于部分b的底部或冲切粘附膜中。微构造的柱体系统地布置在连接至入口和出口的光流控通道回路中。在一些实施方式中，该板的占位(footprint)、高度、底部和外部凸缘依据ansi(美国国家标准学会)/slas(实验室自动化和筛选协会)96孔板标准调整。在测量期间，试剂和样本从入口添加，然后流通(flowthrough)回路通道，并且最终通过毛细作用方法或压差从出口排放。不用调节标准微型酶标仪就可以在通道回路的中心检测到光学信号。
各光流控模块的尺寸可以按比例或者大于或者小于本公开内容中的光流控模块的尺寸。在一些实施方式中，任选的反射层在检测的相对侧上覆盖在板的表面上(如，以提高光学检测效率)。
这一设计的优点是：(1)它与标准酶标仪完全兼容；(2)微构造的柱体增加了表面体积比和/或质量输送率，其提高了分析物捕获效率和被捕获分析物的总数，并且提高了灵敏度；(3)流通设计简化了样本(溶液)添加和排出来减少测试时间；(4)部分发射光沿微构造柱体的纵向方向被引导和积聚，这加强了信号采集并且因此提高了灵敏度；以及(5)(任选的)在板的外表面使用反射覆层或反光镜可以进一步增加采集效率。
ⅰ.板
图1a-f示出了嵌有微柱阵列的光流控多孔板。虽然在一些实施方式中，板显示为标准的圆形孔，但是特别地考虑了其它形状和尺寸的孔(例如，比ansi标准大或小的孔或方形的或抽象形状的孔)。该附图示出了(1)嵌有与漏斗形孔附接的微柱阵列的光流控模块，部分a，以及(2)排放洞或具有模切洞的粘附膜，部分b。光流控出口34(图3中)，与排放洞44精准对齐(图4中)。板的占位、高度、底部和外部凸缘、以及孔定位尺寸分别依据ansi(美国国家标准学会)/slas(实验室自动化和筛选协会)1-2004、2-2004、3-2004、和4-2004调整。这样，板与任何标准酶标仪兼容。板的基座占位长度和宽度的外部尺寸分别为5.0299和3.3654英寸。板的高度为0.565英寸。该板具有周边裙座42、上表面38和附接至嵌有微柱阵列的光流控通道36的漏斗形孔32的阵列(图3中)。检测区56布置在12行8列的标准微型酶标仪激发和收集位置中。相邻检测区的中心相距0.3542英寸。以本公开内容中描述的类似方式，光流控96孔板可采用于任何定制数目的孔格式。在一些实施方式中，部分a和部分b通过注射制模形成并由塑料制成(例如，聚苯乙烯、pmma(聚(甲基丙烯酸甲酯))。在一些实施方式中，它们利用粘附膜或胶或使用超声波塑料焊接技术或其它适合的方法结合并密闭地密封。
虽然入口32在一些实施方式中显示为漏斗形，但是特别地考虑了其它形状。入口可以是如图5a中所示的漏斗形、圆柱形、三角形、倒漏斗形或其它构型。可以使用允许试剂、样本等等进入孔的任何构型。
图2a、图2b和图2c示出了本公开内容的分解立体视图、立体视图和具有隐藏线的立体视图。部分a和部分b如图2a中所示堆叠和对齐，并且然后如图2b中所示结合在一起。可以在图2c中看到96个单个光流控模块22的阵列。
图3a是部分a的等轴侧视图，以及图3b是其仰视图。光流控模块的阵列以12行8列布置。相邻模块的中心相距0.3542英寸。各模块具有漏斗形孔32，其具有0.118英寸的深度、在进口处0.118英寸的直径、以及在出口处0.039英寸的直径，该出口位于靠近微通道36的进口。微通道不限于具体的尺寸和形状。在一些实施方式中，该通道是环形的、椭圆形的、方形的或其它形状并且直径为约0.001-0.1英寸。虽然在一些实施方式中，微通道布置为一系列(例如，至少1、2、3、4、5、10、50或更多)u形或s形的曲线，但是根据应用也特别地考虑了其它构型。嵌有微柱阵列的回路光流控通道36的另一末端具有直径0.02英寸的开口34。基于空间和阵列构型特别地考虑了其它尺寸。部分a顶层上的漏斗形孔32以容易的、方便的且有效率的方式将样本/试剂递送给相应的光流控通道36。
图4a是部分b的等轴侧视图并且图4b是其仰视图。裙座42的部分b与任何标准酶标仪相配。具有0.078英寸的高度、0.02英寸的内直径以及0.059英寸的外直径的圆柱形管44布置在12行8列中。它们与部分a的流体出口开口对齐。
图5a是嵌有微柱阵列的光流控模块22的细节示意图。样本和试剂可以从漏斗形孔32流动通过嵌有微柱阵列的回路光流控通道36。使用毛细作用方法或压差，那些流体可以从开口34和圆柱形管44或具有模切洞的粘附膜中排出。光学信号可以在光流控回路56的中心处获得，该光流控回路位于标准微型酶标仪的光学激发和收集位置处。图5b是嵌有微柱阵列的光流控通道在回路光流控通道36的区段52处的细节。光流控通道36的深度和宽度是0.008英寸和0.008英寸。相邻两个通道之间有0.008英寸的厚壁。在通道36中，具有0.002英寸直径和0.008英寸高度(与通道34的深度相同)的微柱54相隔0.003英寸定位。通道的深度和宽度、柱体的高度和直径、以及柱体分配(参见例如，实施例)的期望范围基于制造可行性和用途而调节。
示出了多个柱体54。本公开内容不限于柱体的数量、尺寸或形状。在一些实施方式中，各通道36具有从10-1000个(例如，20-750、50-500或50-250个柱体54)。在一些实施方式中，柱体54是圆柱形的、棱柱的、矩形的、梯形的或其它形状)。虽然在一些实施方式中，柱体54的直径约为0.002到0.004英寸并且高度约为0.0002到0.008英寸，但是特别地考虑了其它尺寸。在一些实施方式中，通过为测定试剂(例如，抗体或核酸)提供额外的结合位置，柱体有助于增加测定的灵敏度。
图6a和6b分别显示了完全组装的嵌有微柱阵列的光流控多孔板以俯视立体视角和仰视立体视角的视觉外观。
在一些实施方式中，本公开内容提供了包括装置(例如，包括测定板)，单独使用或与用于进行测定的试剂(例如，核酸引物和探针、抗体、检测试剂、缓冲液、测试化合物、对照等等)组合使用的系统和/或试剂盒。在一些实施方式中，系统和试剂盒包括用于高通量分析(例如，样本处理和分析(例如，酶标仪)设备)的机器人。在一些实施方式中，系统还包括检测部件(例如，酶标仪和分光光度计)。
ⅱ.用途
本公开内容的某些实施方式的测定板装置使用在各种各样的应用中(例如，诊断、筛选和研究应用)。在一些实施方式中，进行测定以确定在样本(例如，生物样本)中分析物的存在。可以在测定板中进行各种各样的核酸和氨基酸检测测定。示例性的测定如下文所述。
在一些实施方式中，试剂(例如，捕获核酸或抗体)通过样本入口添加。然后试剂粘附到微柱和通道壁。接着，样本(例如，疑似包含分析物的测试样本)经由入口添加。过量的试剂经由出口移除。测定一旦完成，酶标仪或分光仪用来使通过孔的通道结果中的测定可视化。在一些实施方式中，计算机系统和/或计算机软件用于通过使用界面(例如，计算机屏幕、平板电脑、智能手机等等)向使用者确定和报告测定结果(例如，测试样本中分析物的存在)。在一些实施方式中，这些结果用于研究、诊断中或确定行动处理方案。
免疫测定的例示性的非限制性的实例包括，但不限于：免疫沉淀反应；蛋白质印记；elisa；免疫组织化学；免疫细胞化学；免疫色谱法；流式细胞术；以及免疫pcr。使用本领域普通技术人员已知的各种技术可检测地标记的多克隆或单克隆抗体(例如，比色法、荧光、化学发光或放射性标记)适用于免疫测定中。
免疫沉淀反应是使用特异于抗原的抗体使该抗原从溶液中沉淀出来的技术。通过靶向特定蛋白质或认为存在于复合物中的蛋白质，该过程可用于鉴定细胞提取物中蛋白质或蛋白质复合物的存在。通过最初从细菌中分离出来的不可溶的抗体结合蛋白质，诸如蛋白质a和蛋白质g，该复合物从溶液中被带出。该抗体也可以偶联到易于从溶液中分离出来的琼脂糖珠。清洗之后，可以使用质谱仪、蛋白质印记或任何数量的其它方法分析沉淀物以鉴定复合物中的成分。
蛋白质印记，或免疫印迹，是在组织匀浆或提取物的给定样本中检测蛋白质的方法。它使用凝胶电泳通过质量分离变性蛋白质。然后该蛋白质被转移出凝胶并被转移至膜上，通常为聚二氟乙烯或硝化纤维素，其中它们使用目标蛋白质的特异性抗体进行探测。结果，研究者可以检查给定样本中蛋白质的量并比较几个组之间的水平。
elisa，是酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay)的简称，是检测样本中抗体或抗原存在的生物化学技术。它使用最少两个抗体，其中一个特异于抗原而其另一个与酶偶联。第二抗体会引起显色底物或荧光底物产生信号。elisa的变体包括夹心elisa、竞争性elisa以及elispot。因为可以进行elisa来评估样本中抗原的存在或抗体的存在，所以它是用于确定血清抗体浓度和用于检测抗原存在的有用的工具。
免疫组织化学和免疫细胞化学是指经由组织或细胞中的抗原结合至它们各自抗体的原理，分别在组织切片或细胞中定位蛋白质的过程。通过利用产色标记或荧光标记对抗体进行标记可以实现可视化。颜色标记的典型实例包括，但不限于，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)。荧光团标记的典型实例包括，但不限于，异硫氰酸荧光素(fitc)或藻红蛋白(pe)。
流式细胞术是用于计算、检查和任选地分选悬浮在流体流中的微观粒子或细胞的技术。它允许对流经光学/电子检测设备的单个细胞的物理和/或化学特性同时进行多参数的分析。单频或单色的光束(例如，激光)被引导到流体动力学上聚焦的流体流上。多个检测器瞄向该流穿过该光束的点；一个与光束一致(前向散射或fsc)并且几个与它垂直(侧向散射(ssc)以及一个或多个荧光检测器)。穿过光线的每个悬浮粒子将光以某种方式散射，并且粒子中的荧光化学物质可以被激发成低于光源频率的发射光。散射光和荧光的组合由检测器获取，并且通过分析每个检测器中亮度上的波动，每个荧光发射峰值一个，可以推断关于每个单个粒子的物理和化学结构的各种事实。fsc与细胞体积相关并且ssc与粒子的密度或内部复杂性相关(例如，核的形状、细胞质颗粒的量和类型或膜粗糙度)。
免疫聚合酶链式反应(ipcr)利用核酸扩增技术以增加基于抗体的免疫测定中的信号生成。因为不存在与pcr等价的蛋白质，即是，蛋白质不能以与pcr期间核酸复制相同的方式被复制，所以提高检测灵敏度的唯一途径是通过信号扩增。靶蛋白与直接或间接缀合到寡核苷酸的抗体相结合。未结合抗体被洗掉而余留的结合抗体具有其被扩增的寡核苷酸。经由使用标准核酸检测法(包括实时方法)检测扩增的寡核苷酸而实现蛋白质检测。
可以在本文所述的测定板中进行的示例性核酸检测方法包括，但不限于，测序测定、扩增测定和杂交测定。
核酸测序技术的例示性非限制性实例包括，但不限于，链终止子(sanger)测序法和染料终止子测序法、或高通量测序法。本公开内容不旨在限制测序的任何特定方法。本领域普通技术人员将认识到，因为rna在细胞中较不稳定且在实验上更易于核酸酶攻击，所以在测序之前rna通常被逆转录为dna。
在一些实施方式中，测序是由pacificbiosciences(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美国专利no.7,170,050；美国专利no.7,302,146；美国专利no.7,313,308；美国专利no.7,476,503；其所有通过引用并入)开发的实时的单分子测序系统，利用直径50-100nm的反应孔并且包括约20仄普托公升(10x10-21l)的反应体积。测序反应使用固定化模板、修饰的phi29dna聚合酶以及高局部浓度的用荧光标记的dntp进行。高局部浓度和连续反应条件允许使用激光激发、光学波导和ccd照相机借由氟石信号检测实时地捕获掺入事件。
可以使用很多其它的dna测序技术，包括荧光基测序方法(参见，例如，birren等人,genomeanalysis:analyzingdna,1,coldspringharbor,n.y.；其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方式中，利用了本领域知晓的自动化测序技术。在一些实施方式中，dna测序通过平行寡核苷酸延伸得以实现(参见，例如，macevicz等人的美国专利no.5,750,341和macevicz等人的美国专利no.6,306,597，两者的全部内容通过引用并入本文)。测序技术额外的实例包括church聚合酶克隆技术(churchpolonytechnology)(mitra等人,2003,analyticalbiochemistry320,55-65；shendure等人,2005science309,1728-1732；美国专利no.6,432,360,美国专利no.6,485,944,美国专利no.6,511,803；其全部内容通过引用并入本文)、454微滴焦磷酸测序技术(picotiterpyrosequencingtechnology)(margulies等人,2005nature437,376-380；us20050130173；其全部内容通过引用并入本文)、solexa单碱基附加技术(singlebaseadditiontechnology)(bennett等人,2005,pharmacogenomics,6,373-382；美国专利no.6,787,308；美国专利no.6,833,246；其全部内容通过引用并入本文)、lynx大规模平行签名测序技术(massivelyparallelsignaturesequencingtechnology)(brenner等人(2000).nat.biotechnol.18:630-634；美国专利no.5,695,934；美国专利no.5,714,330；其全部内容通过引用并入本文)以及adessipcr菌落技术(pcrcolonytechnology)(adessi等人(2000).nucleicacidres.28,e87；wo00018957；其全部内容通过引用并入本文)。
已经出现了被称为“下一代测序”技术的一组方法作为对sanger测序法和染料终止子测序法的替代(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；每个的全部内容通过引用并入本文)。下一代测序(ngs)方法共享大规模平行的、高通量策略的共同特征，怀着与老式测序方法相比更低成本的目标。ngs方法可以被广泛地分为需要模板扩增的一类和不需要模板扩增的一类。需要扩增的方法包括由roche商业化为454技术平台(例如，gs20和gsflx)的焦磷酸测序、由illumina商业化的solexa平台以及由appliedbiosystems商业化的受支持寡核苷酸连接及检测(supportedoligonucleotideligationanddetection)(solid)平台。非扩增途径，也称为单分子测序，是以由helicosbiosciences商业化的heliscope平台、以及分别由visigen、oxfordnanoporetechnologiesltd.和pacificbiosciences商业化的新兴平台为例。
在焦磷酸测序(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美国专利no.6,210,891；美国专利no.6,258,568；每个的全部内容通过引用并入本文)中，模板dna被片段化、末端修复、连接到接头，并且通过用与接头互补的珠载寡核苷酸捕获单个模板分子在原位克隆扩增。载有单个模板类型的各磁珠被划分到油包水的微泡中，并且使用被称为乳化pcr的技术将该模板克隆扩增。乳化在扩增后瓦解并且磁珠沉淀到微滴板在测序反应期间用作流动池(flowcell)的单个的孔中。在测序酶和冷光报告物诸如荧光素酶存在的情况下，四种dntp试剂中的每个有序的、反复的引入流动池中。假如将一种适当的dntp添加到测序引物的3’末端，所导致的atp的产生会在孔内引发一阵发光，使用ccd照相机将其记录下来。可以实现读取长度大于或等于400碱基，并且可以实现1x106的序列读取，导致高达5亿碱基对(mb)的序列。
在solexa/illumina平台(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美国专利no.6,833,246；美国专利no.7,115,400；美国专利no.6,969,488；每个的全部内容通过引用并入本文)中，测序数据以较短长度读取的形式产生。在该方法中，单链片段化dna被末端修复以生成5’-磷酸化钝端，随后通过klenow介导将单个a碱基添加到片段的3’末端。a的添加促进了t突出端接头寡核苷酸的添加，该t突出端接头寡核苷酸随后被用来捕获镶有寡核苷酸锚的流动池表面上的模板接头分子。该锚用作pcr引物，但是由于模板的长度并且其邻近其它附近的锚寡核苷酸，所以通过pcr延伸会导致分子“拱悬”以与邻近的锚寡核苷酸杂交，从而在流动池表面上形成桥结构。这些dna环变性并裂解。然后用可逆的染料终止子对正向链进行测序。掺入的核苷酸的序列通过检测掺入后荧光来确定，其中在dntp添加的下一个周期之前去除每个荧光团和嵌段。序列读取长度范围从36个核苷酸到超过50个核苷酸，每次分析运行总输出超过10亿个核苷酸对。
使用solid技术测序核酸分子(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美国专利no.5,912,148；美国专利no.6,130,073；每个的全部内容通过引用并入本文)也包括模板的片段化、与寡核苷酸接头的连接、与磁珠的附接以及借由乳化pcr的克隆扩增。在此之后，珠载模板固定在玻璃流动池的衍生表面上，并且互补到接头寡核苷酸的引物被退火。然而，不是将该引物用于3’延伸，而是用于提供5’磷酸基来连接包含两个探针特异性碱基、随后是6个简并碱基和四个荧光标记之一的询问探针。在solid系统中，询问探针具有位于各探针的3’末端的两个碱基，以及位于5’末端的四个荧光团之一的16种可能的组合。荧光颜色以及由此各探针的身份对应于指定的颜色空间编码方案。多轮(通常7轮)的探针退火、连接和荧光检测之后是变性，然后使用相对于初始引物偏移一个碱基的引物进行第二轮测序。以这种方式，模板序列可以计算重建，并且模板碱基被询问两次，导致准确度提高。序列读取长度平均为35个核苷酸，每次测序运行总输出超过40亿个碱基。
在某些实施方式中，采用了纳米孔测序(参见，例如，astier等人,jamchemsoc.2006feb8；128(5):1705-10,通过引用并入本文)。纳米孔测序背后的理论与纳米孔浸入导电流体并在其上施加电势(电压)时所发生的事情有关：在这些条件下，可以观察到由于离子通过纳米孔的传导引起的轻微电流，并且电流量对于纳米孔的尺寸非常敏感。如果dna分子穿过(或dna分子的部分穿过)纳米孔，这可以对通过纳米孔的电流的量级产生变化，由此允许确定dna分子的序列。
在某些实施方式中，采用了helicosbiosciences的heliscope(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等人,naturerev.microbiol.,7:287-296；美国专利no.7,169,560；美国专利no.7,282,337；美国专利no.7,482,120；美国专利no.7,501,245；美国专利no.6,818,395；美国专利no.6,911,345；美国专利no.7,501,245；每个的全部内容通过引用并入本文)。模板dna在3’末端被片段化和聚腺苷酸化，最后的腺苷载有荧光标记。变性的聚腺苷酸化的模板片段在流动池的表面上连接到多聚(dt)寡核苷酸。捕获的模板分子的初始物理位置由ccd照相机记录，然后标记被裂解并洗掉。测序通过聚合酶的添加和荧光标记的dntp试剂的连续添加得以实现。掺入事件导致对应于dntp的荧光信号，并且在每轮dntp添加之前信号被ccd照相机捕获。序列读取长度范围从25-50个核苷酸，每次分析运行总输出超过10亿个核苷酸对。
在某些实施方式中，采用了离子激流技术(iontorrenttechnology，lifetechnologies)对净化的靶核酸序列进行测序。离子激流技术是以检测dna聚合期间释放的氢离子为基础的dna测序方法(参见，例如，science327(5970):1190(2010)；美国专利申请公布nos.20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073和20100137143，出于所有目的其全部内容通过引入并入)。微孔包含待测序的模板dna链。在微孔层之下有高灵敏度的isfet离子传感器。所有层都被包含在cmos半导体芯片内，类似于使用在电子工业中的那些。当dntp掺入到生长中的互补链中时氢离子被释放，其触发了高灵敏度的离子传感器。如果均聚物重复出现在模板序列中，则多个dntp分子将被掺入到单循环中。这导致了相应数量的释放氢以及成比例地较高的电信号。该技术与其它测序技术不同在于不使用修饰的核苷酸或光学器件。离子激流测序器的每碱基准确度对于50个碱基读取是～99.6％，每次运行生成～100mb。读取长度是100个碱基对。对于长度中5个重复的均聚物重复的精确度是～98％。离子半导体测序的优点是快速的测序速度和低廉的预付成本和操作成本。
可以适用于本公开内容的另一示例性核酸测序途径由stratosgenomics,inc.开发并且涉及xpandomers的使用。该测序过程通常包括提供由模板引导的合成产生的子链。该子链一般包括偶联在序列中的多个子单元，该序列对应于靶核酸全部的或部分的连续核苷酸序列，其中单个子单元包括系链(tether)、至少一个探针或核碱基残基、以及至少一个可选择性裂解的键。可选择性裂解的键被裂解以产生长度长于子链多个子单元的xpandomer。xpandomer通常包括系链和报告元件用于解析序列中的基因信息，该序列对应于靶核酸全部的或部分的连续核苷酸序列。然后检测到xpandomer的报告元件。与基于xpandomer的途径有关的额外细节描述在，例如，美国专利公告no.20090035777中。
其它新兴的单分子测序方法包括使用visigen平台通过合成实时测序(voelkerding等人,clinicalchem.,55:641-658,2009；美国专利no.7,329,492；美国专利申请序列no.11/671956；美国专利申请序列号no.11/781166；每个的全部内容通过引用并入本文)，其中使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子使固定的、引发的dna模板经受链延伸，导致核苷酸添加之后可检测荧光共振能量转移(fret)。
核酸杂交技术的例示性的非限制性的实例包括，但不限于，原位杂交(ish)、微阵列以及southern或northern印迹法。原位杂交(ish)是杂交的一种类型，使用标记的互补dna或rna链作为探针以在组织的部分或切片中，或者，如果组织足够小，在整个组织(全胚胎ish)中定位特定dna或rna序列。dnaish可用于确定染色体的结构。rnaish用于在组织切片或全胚胎内测量和定位mrnas和其它转录物。样本细胞和组织通常被处理以固定靶转录物并增加探针的通路。探针在升高的温度下与靶序列杂交，然后过量的探针被洗掉。使用放射自显影技术、荧光显微镜或免疫组织化学将利用放射性、荧光或抗原标记的碱基标记的探针在组织中定位和定量。ish也可以使用放射性或其它非放射性标记标记的两个或更多个探针以同时检测两个或更多个转录物。
核酸扩增技术的例示性的非限制性的实例包括，但不限于，聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)以及基于核酸序列的扩增(nasba)。本领域的普通技术人员将认识到某些扩增技术(例如，pcr)要求rna在扩增之前逆转录成dna(例如，rt-pcr)，而其它扩增技术直接扩增rna(例如，tma和nasba)。
扩增产物可以通过使用各种自杂交探针被实时地检测到，其中的大部分具有茎环结构。根据探针是处于自杂交状态还是处于通过与靶序列的杂交而改变的状态，标记这些自杂交探针使得它们差别地发射可检测信号。通过非限制性实例，“分子火炬(moleculartorches)”是自杂交探针的一种类型，包括自我互补的不同区域(被称为“靶结合结构域”和“靶闭合结构域”)，这些不同区域通过连接区域(例如，非核苷酸连接子)连接并且在预定的杂交测定条件下相互杂交。在优选的实施方式中，分子火炬包括靶结合结构域中长度为1至约20个碱基的单链碱基区，并且可用于在链置换条件下与出现在扩增反应中的靶序列杂交。在链置换条件下，分子火炬的两个互补区(可以是全部地或部分地互补的)的杂交是有利的，除非在靶序列存在的情况下，靶序列将与出现在靶结合结构域中的单链区结合并且置换靶闭合结构域的全部或一部分。分子火炬的靶结合结构域和靶闭合结构域包括定位的可检测的标记或一对相互作用的标记(例如，发光/淬灭剂)，从而在分子火炬自杂交时而不是在分子火炬与靶序列杂交时产生不同的信号，由此允许在非杂交分子火炬存在的情况下在测试样本中检测探针：靶双链体。分子火炬和各种类型的相互作用的标记对，包括荧光共振转移(fret)标记，被公开在，例如美国专利nos.6,534,274和5,776,782中，其中每个的全部内容通过引用并入本文。
也可以检测两个分子之间的相互作用，例如，使用荧光共振能量转移(fret)(参见，例如，lakowicz等人,美国专利no.5,631,169；stavrianopoulos等人,美国专利no.4,968,103；其中每个通过引用并入本文)。选择荧光团标记从而使第一供体分子的发射荧光能量将被第二‘受体分子’上的荧光标记吸收，其反过来由于所吸收的能量能够发出荧光。
可替换地，‘供体’蛋白质分子可以简单地利用色氨酸残基的自然荧光能量。选择发射不同波长光的标记，使得‘受体’分子标记可以不同于‘供体’的标记。由于这些标记之间的能量转移的效率与分子间相距的距离有关，因此可以评估分子之间的空间关系。在分子间发生结合的情况下，‘受体’分子标记的荧光发射应该是最大化的。通过本领域熟知的标准荧光检测手段(例如，使用荧光计)，可以方便地测量fret结合事件。
具有自我互补的检测探针的另一个实例是“分子信标”。分子信标包括具有靶互补序列的核酸分子、在扩增反应中出现靶序列缺失的情况下在使探针保持闭合构象的亲和对(或核酸臂)、以及在探针处于闭合构象时相互作用的标记对。靶序列和靶互补序列的杂交将亲和对的成员分离，从而将探针转换为开放构象。由于标记对的相互作用减小，转换成开放构象是可检测的，该标记对可以是，例如，荧光团和淬灭剂(例如，dabcyl和edans)。分子信标被公开在，例如，美国专利nos.5,925,517和6,150,097中，其全部内容通过引用并入本文。
其它的自杂交探针为本领域普通技术人员所熟知。通过非限制性实例，具有相互作用标记的探针结合对，诸如公开在美国专利no.5,928,862中的那些(其全部内容通过引用并入本文)可以被调整以用于本公开内容的实施方式的方法中。用于检测单核苷酸多态性(snps)的探针系统也可以使用在本发明中。额外的检测系统包括“分子开关”，如在美国公布no.20050042638中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。其它探针，诸如包括插入染料和/或荧光染料的那些，对于本公开内容的实施方式的扩增产品方法的检测也是有用的。参见，例如，美国专利no.5,814,447(其全部内容通过引用并入本文)。
实验部分
为论证并进一步说明本公开内容的某些优选实施方式和方面，提供了以下实施例并且这些实施例不应解释为限制其范围。
实施例1
光流控孔板制造(具有0.002in直径微柱阵列的0.008in宽x0.008in深的通道)
通过使用聚苯乙烯材料利用注射制模制造嵌有部分a(图7a)的3x3(3行3列)孔布局和部分b(图7b)的微柱阵列的光流控多孔板。可替代地，具有9个模切洞(图7c)的单侧的粘附膜被用作部分b以用于进一步的实验。图8a和b分别展示了光流控模块的总布局以及部分a的通道内的微柱阵列。
光学性能研究：光学检测的变异
为评估光学信号检测变异，本公开内容性能的光流控孔板针对传统96孔和optimisertm孔板进行比较(图13和14)。
elisa研究
用光流控孔板对溶解在缓冲溶液中的各种浓度的人类il-6进行了测试(图17)。更多细节见于elisa方案部分。
实施例2
光流控孔板制造(具有0.004in直径微柱阵列的0.018in宽x0.022in深的通道)
通过使用聚苯乙烯材料利用注射制模制造嵌有微柱阵列的部分a的3x3(3行3列)孔布局的光流控多孔板(如图9a的正面图像中和图9b的背面图像中所示的清晰且透明的孔板，以及如图10a的正面图像中和图10b的背面图像中所示的黑色且不透明的孔板)。具有9个模切洞(图7c)的单侧的粘附膜被用作具有光流控孔板那些部分a的部分b以用于进一步的实验。图11展示了部分a通道内的微柱阵列。为了与用3x3孔板的标准多标记酶标仪相配，使用了如图12中所示的3d打印的孔板适配器。
光学性能研究：取决于通道尺寸
为了评估本公开内容的光流控孔板的光学性能，使用如在材料和方法部分中所述的溶解在甲醇中的罗丹明6g(r6g)研究了七种不同的通道尺寸(图15)。此外，分析了清晰且透明的、以及黑色且不透明的聚苯乙烯光流控孔板的光学串扰(图16)。
elisa研究
通过以下两种检测方法用光流控孔板测试了溶解在缓冲溶液以及血清中的各种浓度的人类il-6：1.用清晰且透明的孔板进行荧光检测；以及2.用黑色且不透明的孔板进行化学发光检测。更多细节见于elisa方案部分。使用r&dsystems的传统elisa方案作为基准，用在光流控孔板中的使用的相同的人类il-6浓度测试了传统的96孔板(图18-22)。
用于光学性能研究的材料和方法
将罗丹明6g(r6g)粉末(sigma-aldrich#252433)彻底地溶解在99.8％的甲醇(sigma-aldrich#322415)中以构建1mm浓度。然后，将溶液依次稀释以制成期望的浓度。将这些溶液以期望的量装填进孔或通道中。将100μl的r6g溶液用在传统的96孔板中。10μl和3μl的r6g溶液用在optimisertm孔板和光流控孔板中。
使用标准多标记酶标仪(perkinelmer
对于依赖于荧光强度研究的通道尺寸，将0.5μm的r6g溶液用于7种不同的通道尺寸；(1)0.008in宽x0.008in深，(2)0.012in宽x0.012in深，(3)0.014in宽x0.014in深，(4)0.016in宽x0.016in深，(5)0.018in宽x0.018in深，(6)0.018in宽x0.020in深，以及(7)0.018in宽x0.022in深。
用于光流控孔板表面修饰的材料和方法
光流控孔板由聚苯乙烯制成，其具有疏水的表面性质，使试剂不能流过微米尺寸的通道。因此，利用以下的表面修饰方法对孔板进行预处理以形成通道的亲水表面。
1.用超声波清洗器(gemoro型号：10qth)中的99.8％的甲醇(sigma-aldrich#322415)将板清洗15分钟。
2.在超声波清洗器中用超纯水将板清洗5分钟。
3.用100ml96％的硫酸(sigma-aldrich#7664-93-9)与5gnochromix(sigma#328693)的混合物处理板60分钟。
4.重复步骤“2”。
5.在超声波清洗器中用1mg/ml的氢氧化钠(fisherchemicalcas1310-73-2)清洗板30分钟。
6.重复步骤“2”。
7.用0.2mg/ml的聚乙烯亚胺溶液(sigma-aldrich#181978-5g)板30分钟。
8.用超纯水清洗板5分钟。
9.用1％的戊二醛溶液(fisherchemicalcas注册号1：111-30-8，cas注册号2：7732-18-5)孵育板15分钟。
10.重复步骤“8”。
11.将板风干。
疏水表面改变成亲水表面的表面修饰方法可以用任何其它完善的技术诸如等离子体法和辐射法替代。
光流控孔板的试剂准备和elisa方案
人类il-6duosetelisa试剂盒(dy206)、elisa板包被缓冲液(dy006)、清洗缓冲液(wa126)和试剂稀释剂(dy995)购买自r&dsystems。根据试剂盒用户手册中描述的程序制备这些试剂。首先，用超纯水稀释储备的清洗缓冲液和试剂稀释剂以获得1x工作溶液。然后，通过用pbs(r&dsystems#dy006)稀释制备12μg/ml的捕获抗体工作溶液。通过用1x试剂稀释剂稀释制备0.4μg/ml的检测抗体工作溶液。通过添加1x试剂稀释剂作为缓冲介质和血清将人类il-6标准稀释至期望浓度。在施用前，通过用40μl的1x试剂稀释剂稀释1μl来自dy206试剂盒的sav-hrp储备溶液制备辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(sav-hrp)工作溶液。将1x试剂稀释剂(pbs中1％bsa)用作封闭溶液。
在elisa方案的最后一步使用quantaredtm增强型化学荧光hrp底物试剂盒(thermoscientific#15159)以开发荧光。在施用前，通过在室温下将来自试剂盒的2μlquantared10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(adhp)浓缩物、100μl增强子溶液和100μl稳定的过氧化物溶液混合来制备用于荧光检测的工作底物溶液。在化学发光检测的情形中，就在光学检测步骤之前，将来自supersignaltmelisafemto底物试剂盒的等量的supersignalelisafemto鲁米诺/增强子和supersignalelisafemto稳定的过氧化物在室温下混合。在制备试剂之后，使用以下程序用于il-6检测。
1.对于0.008inx0.008in孔板用10μl的12μg/ml捕获抗体溶液10μl孵育板10分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl的4μg/ml捕获抗体溶液孵育60分钟)。
2对于0.008inx0.008in孔板用10μl的1x清洗缓冲液清洗板5分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl的1x清洗缓冲液1分钟)。
3.对于0.008inx0.008in孔板用10μl的封闭缓冲液(pbs中1％bsa)孵育板10分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl的封闭缓冲液孵育29分钟)。
4.对于0.008inx0.008in孔板用10μl包含标准分析物、il-6的溶液(1x试剂稀释剂或血清)填充板，并且孵育10分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl标准分析物、il-6，并且孵育15分钟)。
5.对于0.008inx0.008in孔板用10μl1x清洗缓冲液清洗板5分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl1x清洗缓冲液清洗1分钟)。
6.对于0.008inx0.008in孔板用10μl的0.4μg/ml检测抗体溶液孵育板5分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl的0.1μg/ml检测抗体溶液孵育15分钟)。
7.对于0.008inx0.008in孔板用10μl的1x清洗缓冲液清洗板5分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl的1x清洗缓冲液清洗1分钟)。
8.对于0.008inx0.008in孔板用10μl的1xsav-hrp溶液填充板并且孵育5分钟(对于0.018inx0.022in孔板用10μl的1.5xsav-hrp溶液孵育5分钟)。
9.对于0.008inx0.008in孔板用10μl的1x清洗缓冲液清洗板5分钟(对于0.018inx0.022in孔板用20μl的1x清洗缓冲液清洗1分钟)。
10.重复步骤9。
11.为了荧光检测，用3μl的quantaredtm的工作底物溶液和仍保持在清晰且透明的0.008inx0.008in孔板中的溶液填充板(8μl的quantaredtm的工作底物溶液和仍保持在清晰且透明的0.018inx0.022in孔板中的溶液)。
12.步骤10之后5分钟，使用标准多标记酶标仪(perkinelmer
在化学发光检测的情形中，用下面的步骤11(a)和12(a)替代上述步骤11和12。
11(a).用8μl的supersignaltmelisafemto的工作底物溶液和仍保持在黑色且不透明的0.018inx0.022in孔板中的溶液填充板。
12(b).步骤10之后1分钟，使用标准多标记酶标仪(perkinelmer
注意：在本公开内容中报告的所有测量都是在室温下进行的并且利用毛细管作用力将溶液排出。
结果计算
将数据绘图并计算来自各il-6浓度一式三份样本(3个孔)的平均值、标准偏差、变异系数(cvs)和统计学p值。将四参数逻辑(4-pl)用作曲线拟合。基于测量的次数、数据组自由度、学生的t值和测得的标准偏差的数量计算各浓度不同置信水平下的边际误差。通过将边际误差与空白(0pg/ml的il-6)和各浓度之间的平均误差进行对比对置信水平(％)分类。
结果和结论：光学性能
为评估光学检测准确度，将荧光染料罗丹明6g(r6g)溶液用作模型分析物。图13展示了来自三种不同孔类型的3个孔各自的运行间变异，(1)传统96孔板，(2)optimisertm孔板，以及(3)本公开内容的实施方式的光流控孔板。(“运行间”意指板中同一个孔通过酶标仪读取并取出，然后再次推入并由读取器读取。对于每个孔，重复上述程序3次。)传统96孔板和光流控孔板的变异系数(cvs)相似且小于5％，而optimisertm孔板的cvs在3μl的r6g中从～15％到35％(图13a)并且在10μl的r6g中从～15％到50％(图13b)。实际上，孔的运行间荧光读数除了酶标仪系统变异不应当具有任何变异。因此，96孔板的cvs来自读取器变异。所以，结论是本公开内容的实施方式的光流控孔板不引入任何额外的变异，因为96孔和光流控板的cvs是近似的。另一方面，发现optimisertm孔板的cvs是另两种孔板cvs的3到10倍。这样，额外cvs的来源是来自板本身。此外，使用10μlr6g比在optimisertm孔板情形中使用3μlr6g引入了更多的变化，这可能是由于在入口中更多的r6g残留物，该入口定位在光学激发和检测路径中。本公开内容的实施方式的板的设计完全消除了这个问题。
图14展示了来自三种不同孔类型的3次运行各自的孔间变异。传统96孔板和光流控孔板的最大cvs是～5％。optimisertm孔板在3μlr6g中的最大cvs是～20％(图14a)并且在10μlr6g中是～100％(图14b)。此外，在optimisertm孔板情形中使用10μlr6g的更多的变异是由于与使用3μlr6g相比在入口中更多的r6g残留物。而且，为了信号一致性，optimisertm孔板螺旋结构的对称通道尺寸需要精确的检测位置。相反，本公开内容的实施方式的光流控孔板中具有微流控通道的u形转弯特征的对称通道尺寸接受了光学检测位置的大的容差而没有信号变异。
图15展示了7个不同尺寸通道的相同浓度(0.5μm)的罗丹明6g(r6g)的荧光强度。该荧光强度随着更大的通道尺寸而增加归因于更高的光学检测深度。0.018inx0.022in通道产生的强度比0.008inx0.008in通道产生的强度高过三倍。
如图16a中所示，在使用清晰且透明的光流控孔板的荧光检测中没有观察到串扰(在所有孔中小于0.25％)。然而，在使用相同的透明孔板的化学发光检测中观察到显著的串扰(在邻近的孔中约10％串扰)(图16b)。相反，在用黑色且不透明光流控孔板的化学发光检测的情形中没有发现串扰(在所有的孔中小于0.08％)(图16c)。
结果和结论：elisa
表面修饰是在elisa之前重要的步骤以将通道的疏水表面改变为亲水表面，其允许试剂流动。对于0.008inx0.008in通道，固定捕获的抗体以及封闭光流控孔板需要25分钟(对于0.018inx0.022in通道90分钟)而传统96孔板需要过夜。包括底物孵育的光流控孔板的总测定时间是45分钟或更短，而根据来自#dy006试剂盒的用户手册传统96孔板需要约300分钟。本文所述的板比传统孔板快超过6倍。此外，光流控孔板仅需要10μl的分析物样本，这是传统elisa中使用的分析物样本的十分之一。此外，如表1中所示，光流控孔板比传统孔板消耗更少的试剂(捕获抗体、检测抗体、sav-hrp和quantaredtm)。
表1：使用光流控孔板和传统96孔板的il-6elisa的比较(0.008inx0.008in通道和0.018inx0.022in通道)
重对数尺度中的il-6实验结果与四参数逻辑(4-pl)的模拟曲线非常吻合。在0.008inx0.008in通道光流控孔板的三点绘图图17a和均值绘图图17b二者中，重对数尺度中在75pg/ml和2400pg/ml之间观察到线性投影。在图17c中，除0、37.5和600pg/ml之外的所有变异系数小于10％。如图17d中所示，只有关于9.37pg/ml和18.75pg/ml的空白(0pg/ml)的两个p值高于截止p值(0.05)。因此，这两个浓度不能与空白在统计学上区分。关于邻近的较低浓度9.37pg/ml、18.75pg/ml和75pg/ml的三个p值高于截止p值。这表明，这些浓度不能与邻近的较低浓度在统计学上区分(图13b)。发现37.5pg/ml以及更高浓度的置信水平高于95％(表2)。总之，在用具有0.008inx0.008in通道的光流控孔板的该il-6elisa中，达到了37.5pg/ml的检测极限和37.5pg/ml与9600pg/ml之间的检测范围。
在0.018inx0.022in通道的情形中，在用缓冲液和血清两者以及用荧光检测方法(图18a、b和图19a、b)和化学发光检测方法(图20a、b和图21a、b)两者的il-6中，重对数尺度中，线性投影进一步延伸到9.37pg/ml和4800pg/ml之间。发现大多数变异系数小于10％(图18c、图19c、图20c和图21c)。
0.018inx0.022in通道的光流控孔板的p值比0.008inx0.008in通道明显改善。关于0.018inx0.022in通道的邻近较低连接或空白(0pg/ml)的所有p值都小于0.05(图18d、图19d、图20d和图21d)。这是显著差异并且在9.37pg/ml和9600pg/ml之间的浓度的il-6与空白(0pg/ml)和邻近浓度(例如，9.37pg/ml与18.75pg/ml)是可区分的。
此外，除了化学发光检测缓冲液中的9.37pg/ml(＞90％置信水平)，使用荧光方法或化学发光方法的缓冲液或血清中的所有其它浓度展示了高于95％的置信水平(见表2)。
总的来说，使用0.018inx0.022in通道的荧光检测方法和化学发光检测方法的缓冲液或血清中的检测极限小于9.37pg/ml。当保持与四参数逻辑(4-pl)曲线吻合的9600pg/ml的最高检测极限时，0.018inx0.022in通道的线性检测范围增加到最低达9.37pg/ml且最高达4800pg/ml。0.018inx0.022in通道的统计学p值和置信水平更优于0.008inx0.008in通道。
图22示出了在缓冲液和血清中使用il-6的传统96孔板(约300分钟测定时间)与光流控孔板(45分钟或更短测定时间)的基准分析。在缓冲液(图22a)和血清(图22b)两者中使用荧光检测方法，传统96孔板的最高检测极限是1200pg/ml而光流控孔板是9600pg/ml。如图22c和d所示，在化学发光检测方法的情形中，96孔板和光流控孔板两者都具有相似的趋势。然而，在缓冲液(图22c)和血清(图22d)两者中，96孔板的最高极限接近于4800pg/ml的il-6。另一方面，在缓冲液(图22c)和血清(图22d)两者中，光流控孔板能够检测到9600pg/ml的il-6。
表2：各浓度置信水平(％)的分类
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