一种利用高定向热解石墨为电极制备磷脂囊泡的方法与流程

本发明涉及一种磷脂囊泡的制备方法。

背景技术：

磷脂双层膜是组成生物膜的基质膜层结构，是研究生物膜特性的最佳模型，如用于研究生物膜的膜渗透压、膜曲度、膜张力与膜弹性以及膜与纳米粒子间的相互作用等。目前磷脂囊泡的制备方法主要有微流控法、挤压法、更改溶剂法、温和水化法，电形成法等，其中，导电玻璃是电形成法中常用的电极基底。现有电形成法中，由于使用的基底的表面粗糙度和平整性差，使得形成的磷脂囊泡的均一性较差，同一批次形成的磷脂囊泡直径差距为1～150μm。

技术实现要素：

本发明目的是解决现有电形成法制备的磷脂囊泡的均一性差的问题，提出一种利用高定向热解石墨为电极制备磷脂囊泡的方法。

本发明利用高定向热解石墨为电极制备磷脂囊泡的方法按照以下步骤进行：

一、制备磷脂溶液

将磷脂溶于乙醇中得到磷脂溶液；

二、制备负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极

将步骤一制备的磷脂溶液均匀涂覆在平面高定向热解石墨电极的一个表面上，然后进行真空干燥，得到负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极；

三、组装反应池

取两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极，将两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极平行放置，磷脂干膜相对放置，在两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极之间放置圆筒体，圆筒体的两端分别朝向磷脂干膜，在磷脂干膜与圆筒体的两个端面之间涂抹真空硅脂，两个磷脂干膜与圆筒体合围形成的密闭空间构成反应池，向反应池内注入反应介质溶液；

所述反应介质溶液为蔗糖溶液、葡萄糖溶液、葡聚糖溶液中的一种或两种以上任意比例的混合物；

四、磷脂囊泡的电形成制备

将步骤三中两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极分别连接信号发生器的正负极，开启信号发生器向两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极施加电场，进行磷脂囊泡的电形成制备，即完成。

本发明原理及有益效果为：

目前，还没有关于在电形成法中利用高定向热解石墨(hopg)为电极基底进行制备磷脂囊泡的报道。本发明填补了磷脂囊泡电形成方法中的电极应用中的空白，突破性的扩大了hopg的应用范围，且hopg的高度平整性使得该方法制备的磷脂囊泡尺寸具备优异的可控性和均一性。本发明将原子级别上平整的hopg为电极基底，并施加一定交流电场，利用电场诱导磷脂囊泡的形成，实现交变电场下磷脂囊泡在电场下的可控制备，该方法具有成本低、操作简单、形成速度快、制备周期短、反应条件温和、对环境污染小等优点，制备的磷脂囊泡能够为细胞生物学、生物化学、仿生学等领域中相关膜特性研究和应用提供可靠的磷脂膜模板；可以广泛应用于细胞生物学、生物化学、仿生膜等领域的相关生物膜特性和细胞膜模拟等研究和应用。

1、本发明制备磷脂囊泡过程中，磷脂干膜在交流电场的诱导下，产生电渗作用，促使磷脂干膜层剥离隆起，进一步弯曲形成球状的磷脂囊泡，通过调整信号发生器向负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极施加的电压，频率及施加电场时间便可以实现调节磷脂囊泡的形成速度，因此本发明方法具备可控性；

2、本发明制备磷脂囊泡过程中平面高定向热解石墨是经3200～3600℃热处理的高定向热解石墨，性能接近单晶石墨，内部层面间距0.3344～0.3359nm，晶格参数为0.246nm，相对于其它电极材料，表面具有原子级别的平整度，本发明制备磷脂囊泡过程中平面高定向热解石墨作为基底，有利于磷脂膜的均一隆起，进而形成均一的磷脂囊泡；本发明能够得到形态完整、直径较均一的磷脂囊泡，在同一个反应池得到的不同的磷脂囊泡的直径差最大为10μm；

3、本发明制备磷脂囊泡过程中利用交流电场能够快速诱导磷脂干膜的隆起和弯曲，进而形成球状的磷脂囊泡，因此本发明电形成法制备磷脂囊泡速度快，并且利用了高定向裂解石墨的导电性做电极，也能够提高磷脂囊泡的形成速度；

4、本发明重复制备磷脂囊泡过程中的反应介质溶液为蔗糖溶液、葡萄糖溶液或葡聚糖溶液；反应温度为室温，不需要高温条件和较大的空间条件，因此本发明反应条件温和，成本低；

5、本发明重复制备磷脂囊泡过程中作为基底的负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极能够重复使用；高定向裂解石墨具有片层结构，重复使用前用透明胶布粘撕表面即可剥离上层而露出新鲜且平整的石墨表面层，无需每次更换新基底，并且省去了清洗等步骤，操作简单，省料省时。同时本发明制备过程中采用的试剂及原料安全无毒，因此本发明方法不会对环境产生污染，降低了制备成本。

附图说明：

图1为本发明反应池的结构示意图，图1中，1为平面高定向热解石墨电极，2为磷脂干膜，3为圆筒体，4为信号发生器；

图2为实施例1制备的单个磷脂囊泡的明场显微镜照片；

图3为实施例1制备的多个磷脂囊泡的荧光显微镜照片。

具体实施方式：

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。

具体实施方式一：本实施方式利用高定向热解石墨为电极制备磷脂囊泡的方法按照以下步骤进行：

一、制备磷脂溶液

将磷脂溶于乙醇中得到磷脂溶液；

二、制备负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极

将步骤一制备的磷脂溶液均匀涂覆在平面高定向热解石墨电极的一个表面上，然后进行真空干燥，得到负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极；

三、组装反应池

取两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极，将两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极平行放置，磷脂干膜相对放置，在两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极之间放置圆筒体，圆筒体的两端分别朝向磷脂干膜，在磷脂干膜与圆筒体的两个端面之间涂抹真空硅脂，两个磷脂干膜与圆筒体合围形成的密闭空间构成反应池，向反应池内注入反应介质溶液；

所述反应介质溶液为蔗糖溶液、葡萄糖溶液、葡聚糖溶液中的一种或两种以上任意比例的混合物；

四、磷脂囊泡的电形成制备

将步骤三中两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极分别连接信号发生器的正负极，开启信号发生器向两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极施加电场，进行磷脂囊泡的电形成制备，即完成。

本实施方式具备以下有益效果：

1、本实施方式制备磷脂囊泡过程中，磷脂干膜在交流电场的诱导下，产生电渗作用，促使磷脂干膜层剥离隆起，进一步弯曲形成球状的磷脂囊泡，通过调整信号发生器向负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极施加的电压，频率及施加电场时间便可以实现调节磷脂囊泡的形成速度，因此本实施方式方法具备可控性；

2、本实施方式制备磷脂囊泡过程中平面高定向热解石墨是经3200～3600℃热处理的高定向热解石墨，性能接近单晶石墨，内部层面间距0.3344～0.3359nm，晶格参数为0.246nm，相对于其它电极材料，表面具有原子级别的平整度，本实施方式制备磷脂囊泡过程中平面高定向热解石墨作为基底，有利于磷脂膜的均一隆起，进而形成均一的磷脂囊泡；本实施方式能够得到形态完整、直径较均一的磷脂囊泡，在同一个反应池得到的不同的磷脂囊泡的直径差最大为10μm；

3、本实施方式制备磷脂囊泡过程中利用交流电场能够快速诱导磷脂干膜的隆起和弯曲，进而形成球状的磷脂囊泡，因此本实施方式电形成法制备磷脂囊泡速度快，并且利用了高定向裂解石墨的导电性做电极，也能够提高磷脂囊泡的形成速度；

4、本实施方式重复制备磷脂囊泡过程中的反应介质溶液为蔗糖溶液、葡萄糖溶液或葡聚糖溶液；反应温度为室温，不需要高温条件和较大的空间条件，因此本实施方式反应条件温和，成本低；

5、本实施方式重复制备磷脂囊泡过程中作为基底的负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极能够重复使用；高定向裂解石墨具有片层结构，重复使用前用透明胶布粘撕表面即可剥离上层而露出新鲜且平整的石墨表面层，无需每次更换新基底，并且省去了清洗等步骤，操作简单，省料省时。同时本实施方式制备过程中采用的试剂及原料安全无毒，因此本实施方式方法不会对环境产生污染，降低了制备成本。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述磷脂为二油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱或磷脂酰胆碱。其他步骤和参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一所述乙醇的质量浓度为99.95％。其他步骤和参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一所述磷脂溶液的浓度为0.5～10mg/ml。其他步骤和参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二所述磷脂溶液的涂覆量为2～10μl/cm²。其他步骤和参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二所述平面高定向热解石墨电极的厚度为0.8～1.2mm。其他步骤和参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二所述真空干燥的温度为23～26℃，干燥时间为2～3h。其他步骤和参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三所述圆筒体的高度为0.5～2mm，圆筒体的直径为0.8～1cm。其他步骤和参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三所述反应介质溶液的浓度为10～300mmol/l。其他步骤和参数与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四所述信号发生器的输出波形为正弦波，输出电压为1～6v交流电压，输出电压的频率为1～10⁴hz，施加电场时间为5～120min。其他步骤和参数与具体实施方式一至九之一相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：

1、一种利用高定向热解石墨为电极制备磷脂囊泡的方法，其特征在于：该方法按照以下步骤进行：

一、制备磷脂溶液

将磷脂溶于乙醇中得到磷脂溶液；

所述磷脂为二油酰基磷脂酰胆碱；

所述乙醇的质量浓度为99.95％；

所述磷脂溶液的浓度为5mg/ml；

二、制备负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极

将步骤一制备的磷脂溶液均匀涂覆在平面高定向热解石墨电极的一个表面上，然后进行真空干燥，得到负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极；

所述磷脂溶液的涂覆量为2μl/cm²；

所述平面高定向热解石墨电极的厚度为1mm；

所述真空干燥的温度为5℃，干燥时间为3h；

三、组装反应池

取两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极，将两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极平行放置，磷脂干膜相对放置，在两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极之间放置圆筒体，圆筒体的两端分别朝向磷脂干膜，在磷脂干膜与圆筒体的两个端面之间涂抹真空硅脂，两个磷脂干膜与圆筒体合围形成的密闭空间构成反应池，向反应池内注入反应介质溶液；

所述反应介质溶液为蔗糖溶液；

所述圆筒体的高度为2mm，圆筒体的直径为1cm；

所述反应介质溶液的浓度为100mmol/l；

四、磷脂囊泡的电形成制备

将步骤三中两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极分别连接信号发生器的正负极，开启信号发生器向两片负载磷脂干膜的平面高定向热解石墨电极施加电场，进行磷脂囊泡的电形成制备，即完成；

所述信号发生器的输出波形为正弦波，输出电压为4v交流电压，输出电压的频率为10hz，施加电场时间为20min。

图2为实施例1制备的单个磷脂囊泡的明场显微镜照片；由图2可知，本实施例成功制备了磷脂囊泡；制备的磷脂囊泡的直径为15～20μm；图3为实施例1制备的多个磷脂囊泡的荧光显微镜照片；由图3可知，本实施例中同一个反应池得到的不同的磷脂囊泡的直径差最大为7μm。