能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法与流程

本发明涉及磁性高分子微球的制备，尤其是涉及一种在糖蛋白纯化分离中能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法。

背景技术：

糖蛋白是具有与蛋白质侧链共价连接的糖类的功能性蛋白质。作为生物体内最为重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，糖基化在许多生理调节过程中诸如细胞识别、信号传导、免疫保护、炎症的产生等方面起着重要的作用。糖蛋白研究具有重要的生物学意义和潜在临床应用。质谱已被引入到糖蛋白的研究中以获得关于它们的详细信息，特别是关于每个乙二醇位点处的糖基化位点占据和多糖异质性。然而，相对低丰度的糖蛋白及其差的电离效率经常导致质谱分析中的信号抑制。在糖蛋白组学研究中采用特异性和有效的方法富集糖蛋白是很有必要的。鉴于糖蛋白和糖肽的典型结构和物理化学性质，已经开发出基于凝集素、酰肼化学、亲水相互作用和硼酸成键几种富集策略。

凝集素法只适应于某些特定的糖型，且凝集素价格昂贵。

酰肼化学法富集糖蛋白和糖肽必须要先将糖上的邻位羟基氧化成醛基，然后肼再和该氧化后的醛基反应，该过程复杂且只能适用于n糖的富集，有一定的局限性。

亲水富集法利用糖蛋白和糖肽比其他蛋白或肽有更好的亲水性，从而与材料亲水相互作用，利用亲水性的材料可以将糖蛋白和糖肽从有机相中富集出来,并在水相里洗脱。但是，该富集方法特异性差，因为该作用不是化学键作用，其他非糖蛋白可能也有亲水性较好的容易被富集出来，并且它的回收率也不高。

硼酸成键是利用硼酸基团可以在碱性条件下和糖蛋白上的邻羟基形成紧密但可逆的共价键，这是一种化学作用，所以其选择性较好。重要的是，硼酸易得，稳定，且在糖蛋白富集应用限制少。硼酸酯基琼脂糖树脂和硼基化修饰介孔材料已被广泛用于糖蛋白的富集和固定。然而硼酸酯衍生物和固相基之间的空间和扩散障碍影响糖蛋白的富集效果。另外，因为硼酸是疏水的，接到材料上会使得材料有一定的疏水性，从而导致富集时疏水性的非糖蛋白可能会被吸附。再者，该富集是在碱性条件下进行的，而人体内环境是偏中性的，碱性富集往往导致一些不稳定的糖蛋白发生分解或变性，不能富集得到人体内最原始的糖蛋白标志物。

磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型磁性材料，是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅具有普通高分子微球的众多特性还具有磁响应性，所以不仅能够通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基（如-oh、-cooh、-cho、-nh2等），还能在外加磁场作用下具有导向功能。目前，磁性复合微球已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等诸多领域。

目前，采用乳液聚合方法（包括传统的乳液聚合、无皂乳液聚合、微乳液聚合和细乳液聚合）可以制备出不同结构的磁性高分子微球。但是乳液聚合对于所制得微球的结构以及磁含量的控制相对较差。因此，开发一种结构规整、磁含量可控的磁性微球制备方法是很有必要的，若能将其表面修饰上亲水性硼基化材料则可实现快速分离纯化糖蛋白，解决糖蛋白富集中的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种方法简便、高效，结构规整、磁响应良好可控且能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法，所述磁性微球的内核为四氧化三铁磁性纳米微粒，外壳为富含氨基的交联聚合物网络，在其表面采用氨基基团和羧基苯硼酸酯酰胺化反应进行修饰；其具体步骤如下：

第一步，以六水合三氯化铁、醋酸盐为原料，采用溶剂热法制备纳米四氧化三铁磁性微粒；

第二步，采用溶胶凝胶法将纳米四氧化三铁磁性微粒表面包覆一层sio2；

第三步，对包覆有sio2的磁性微球进行修饰，使其表面含有活性的乙烯基官能团；

第四步，通过聚合反应制备表面富含氨基的核壳式磁性复合微球；

第五步，将表面氨基和羧基苯硼酸酯通过酰胺化反应修饰上大量硼酸酯基团，得到核壳式硼基化磁性微球。

所述第一步中所用的醋酸盐为醋酸锂、醋酸钠、醋酸钾、醋酸镁或醋酸铵中的一种。

所述第二步在纳米四氧化三铁磁性微粒表面包覆sio2层时，首先将纳米四氧化三铁磁性微粒分散在盐酸或硝酸的一元强酸中进行超声分离。

所述第三步在对包覆有sio2的磁性微球表面修饰乙烯基官能团过程中，采用了含有双键的硅烷偶联剂kh570。

所述第四步制备表面富含氨基的核壳式磁性复合微球过程中采用了阴离子型表面活性剂，所述阴离子型表面活性剂为烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、油酰甲基牛磺酸钠或烷基磺酸钠中的一种。

所述第四步制备表面富含氨基的核壳式磁性复合微球过程中采用了含有氨基支链的烯类单体，所述含有氨基支链的烯类单体为丙烯胺、丙烯酰胺、甲基丙烯胺、甲基丙烯酰胺或丁烯胺中的一种或其中的几种。

本发明制备得到的核壳式硼基化磁性微球，粒径分布均一，结构规整，磁含量可控，并且具有高磁响应性以及表面可修饰的特性。磁性微球表面经过进一步的修饰以后，能在生理条件下分离纯化糖蛋白，分离能力良好。因此，该核壳式硼基化磁性复合微球是一种极具应用前景的生物磁性分离材料。

本发明通过表面包覆sio2以获得结构较好、磁含量可控的复合磁性微球，进而在微球表面修饰乙烯基，再通过与含有氨基支链的烯类物质反应使微球表面存在大量氨基基团，最后通过与比硼酸有更好亲水性的羧基苯硼酸酯酰胺化反应得到表面固定大量硼酸酯基团的微球，其成品复合微球具有以下特征：（1）粒径分布均一，结构规整；（2）磁性复合微球的磁含量可控，磁响应高；（3）核壳式磁性复合微球的表面富含硼酸酯基团；（4）核壳式磁性复合微球的制备过程简单、高效；（5）该微球亲水性好并可用于生理条件下分离富集糖蛋白，效果优良，有望用于工业化生产。

附图说明

图1是本发明实施例2制备的核壳式硼基化磁性微球的透射电镜图。

图2是本发明实施例2制备的核壳式硼基化磁性微球的磁滞回线。

图3是本发明制备的核壳式硼基化磁性微球从胎牛血清体系中分离糖蛋白的电泳图。

图4是本发明制备的核壳式硼基化磁性微球从复杂模型蛋白中分离糖蛋白的电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。

实施例1制备壳层厚度25nm左右，粒径大小250nm左右的核壳式四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球

具体步骤为：

（1）、磁性四氧化三铁纳米微粒的制备

将2g六水合氯化铁、4g醋酸钠溶于10ml乙二醇/乙二胺（2:1，v/v）混合溶剂中，在室温下机械搅拌15分钟，随后将溶液转入到含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高温高压反应釜中，将反应釜置于200℃的烘箱中反应20小时，自然冷却至室温；采用磁铁分离得到黑色样品，接着将黑色物质用无水乙醇洗涤4次，纯化水洗涤3次，用磁铁将样品分离出来，置于真空干燥箱30~50℃干燥12小时。将干燥磁性微粒收集备用。

（2）、四氧化三铁@二氧化硅纳米磁性复合微粒的制备

将以上得到的磁性四氧化三铁微粒500mg分散在50ml的0.1m的硝酸溶液中，超声10min，磁分离得到物质经乙醇洗涤4次、纯化水洗涤3次，最后将物质分散在200ml纯化水、800ml乙醇和10ml氨水（25wt%）中；接着，在搅拌条件下，将10ml原硅酸四乙酯加入上述分散相中；最后将分散相于反应温度40℃下继续机械搅拌6小时；反应结束后，采用磁分离得到四氧化三铁@二氧化硅磁性复合微粒，并用纯化水和无水乙醇洗去过量的原硅酸四乙酯；最后放在真空干燥箱里干燥。

（3）、乙烯基修饰的四氧化三铁@二氧化硅纳米磁性复合微粒的制备

将以上得到四氧化三铁@二氧化硅纳米磁性复合微粒200mg分散在10ml纯化水、40ml乙醇和2ml氨水（25wt%）中；接着，在搅拌条件下，将0.5ml硅烷偶联剂kh570加入上述分散相中；最后将分散相于反应温度50℃下继续机械搅拌12小时；反应结束后，采用磁分离得到乙烯基修饰的四氧化三铁@二氧化硅纳米磁性复合微粒，并用纯化水和无水乙醇洗去过量的硅烷偶联剂；最后放在真空干燥箱干燥。

（4）、四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺纳米磁性复合微粒的制备

将以上得到的200mg乙烯基修饰的四氧化三铁@二氧化硅纳米磁性复合微粒加入到100ml三颈烧瓶中，加入8ml乙醇、60ml纯化水、12mg十二烷基苯磺酸钠，机械搅拌30分钟，接着加入1ml的0.03m的过硫酸钾水溶液、0.5ml丙烯胺，接着机械搅拌15分钟，然后将烧瓶转入60℃油浴反应8小时；反应结束后用磁分离，并用乙醇和纯化水进行洗涤，得到四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺纳米磁性复合微粒。

（5）、四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球的制备

将以上得到的磁性复合微球分散在二甲基亚砜中配制成固含量为100mg/ml的分散液；取1ml分散液于离心管中，超声处理5分钟，加入1ml的30mg/ml的edc的二甲基亚砜溶液、1ml的30mg/ml的nhs的二甲基亚砜溶液，将离心管置于垂直混合仪上混合20分钟，加入5ml的20mg/ml的4-羧基苯硼酸酯的二甲基亚砜溶液，最后将离心管置于垂直混合仪室温反应12小时；反应结束后用磁分离，并用二甲基亚砜洗涤，得到核壳式四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球。

实施例2制备壳层厚度40nm左右，粒径大小300nm左右的核壳式四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球

具体步骤为：

（1）、磁性四氧化三铁纳米微粒的制备

同实施例1。

（2）、四氧化三铁@二氧化硅纳米磁性复合微粒的制备

同实施例1步骤。

（3）、乙烯基修饰的四氧化三铁@二氧化硅纳米磁性复合微粒的制备

同实施例1。

（4）、四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺纳米磁性复合微粒的制备

其中丙烯胺的用量为1ml；其他同实施例1。

（5）、四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球的制备

同实施例1。

图1、图2分别为所得的核壳式四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球的透射电镜图和磁滞回线。

实施例3利用实施例2制备的磁性复合微球进行复杂的胎牛血清体系中分离糖蛋白辣根过氧化物酶（hrp）的富集实验

具体方法为：

（1）、首先称取1mg四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球，用100μl缓冲溶液ⅰ（10mmpbs，ph=7.4）洗涤两次；

（2）、接着加入5μl（40μl/ml）糖蛋白和5μg糖蛋白hrp的混合物，加缓冲溶液ⅰ至在100μl，室温下孵育10分钟；

（3）、磁分离收集上清液，加入100μl缓冲溶液ⅰ洗涤两次；

（4）、最后用50μl缓冲溶液ⅱ（50%an含1%tfa）进行洗脱，取10μl原液，10μl上清液和10μl洗脱液冻干后分别加入10μl溴酚蓝loadingbuffer，跑电泳，其电泳图见图3：泳道1为标准分子量的条带，泳道2为富集前的混合蛋白（牛血清白蛋白和hrp）电泳条带，泳道3为经磁性复合微球富集后的混合蛋白上清液的电泳条带，泳道4为洗脱后得到的洗脱液的电泳条带。

结论：如图3所示，经磁性复合微球富集后的混合蛋白（牛血清白蛋白和hrp）上清液中不含有hrp，而洗脱后得到的洗脱液中不含有bsa，表明所用磁性复合微球可以从复杂的胎牛血清体系中高效富集分离糖蛋白辣根过氧化物酶。

实施例4利用实施例2制备的磁性复合微球进行复杂的模型蛋白中分离糖蛋白辣根过氧化物酶（hrp）的富集实验

具体方法为：

（1）、首先称取1mg四氧化三铁@二氧化硅@聚丙烯胺-羧基苯硼酸酯磁性复合微球，用100μl缓冲溶液ⅰ（10mmpbs，ph=7.4）洗涤两次；

（2）、接着加入5μgbsa，5μg糖蛋白hrp，5μgmyo和5μgcytc，在室温下孵育10分钟；

（3）、磁分离收集上清液，加入100μl缓冲溶液ⅰ洗涤两次；

（4）、最后用50μl缓冲溶液ⅱ（50%an含1%tfa）进行洗脱，取10μl原液，10μl上清液和10μl洗脱液冻干后分别加入10μl溴酚蓝loadingbuffer，跑电泳，其电泳图见图4：泳道1为标准分子量的条带，泳道2为富集前的混合蛋白（bsa+hrp+myo+cytc）的电泳条带，泳道3为经磁性复合微球富集后的混合蛋白（bsa+hrp+myo+cytc）上清液的电泳条带，泳道4为洗脱后得到的洗脱液电泳条带。

结论：如图4所示，经磁性复合微球富集后的混合蛋白（bsa+hrp+myo+cytc）上清液中不含有hrp，而洗脱后得到的洗脱液中不含有bsa、myo、cytc，表明所用磁性复合微球可以高效选择性富集分离糖蛋白hrp。