结合有微球状体的色谱介质及其制备方法与流程

在下游处理中，由于高效率，蛋白a亲和色谱是抗体纯化的重要方法。在单一步骤中获得了高纯度的抗体，并且这在经济上和环境上将所述方法与其他纯化方法区别开来。与用于制备目的的所有色谱方法的情况一样，色谱介质的生产率至关重要。特别地，这由介质允许的流速(渗透率)和动态结合容量构成。然而，现有技术中迄今已知的色谱介质展现出低流速或低渗透率(例如蛋白a凝胶柱)或低动态结合容量(例如蛋白a膜吸附剂)。

在现有技术(pa)中，其中多孔基质是修饰的使得它们在其孔中具有大孔(未)交联的(水)凝胶的色谱介质是已知的(参见，例如us8,652,849b2、us7,316,919b2、us8,133,840b2、us7,247,370b2、ep1776176b1；在下文中被称为pa文献1至5)。根据来自“聚合物词典(dictionaryofpolymers)”,katsuyoshinishinari,progr.colloidpolym.sci.(2009)136:87-94，katsuyoshinishinari的“关于凝胶定义的一些想法(somethoughtsonthedefinitionofagel)”和“凝胶：结构，性质和功能：基础和应用(gels:structures,properties,andfunctions:fundamentalsandapplications)”(springerverlagberlinheidelberg2009)的定义，聚合物凝胶由三维交联网络组成并且在溶剂中溶胀至一定限度，但其自身在该聚合物的良好溶剂中并不如此溶解。根据来自“在线2014(online2014)”的定义，水凝胶是一种含水但不能溶解于水的聚合物，其分子是化学连接的(例如通过共价或离子键)或物理连接的(例如通过聚合物链的缠结)以形成三维网络。由于掺入的亲水性聚合物组分，水凝胶在水中溶胀，其体积大幅增加，但不丧失它们的物质凝聚力。

然而，现有技术中已知的这些色谱介质也展现出低流速或低渗透率或低动态结合容量。

因此，本发明的目标是提供允许高流速且具有高动态结合容量的色谱介质。

通过权利要求中表征的本发明的实施方案实现了该目标。

具体地，根据本发明提供的是色谱介质，其包含：

多孔基质；和

无孔微球状体，

所述无孔微球状体结合在所述多孔基质的内表面和外表面上，并且

所述微球状体的平均半径不超过所述多孔基质的平均孔直径的30％。

在本发明的上下文中，术语“多孔基质”被理解为意指可用作色谱方法的固定相的任何多孔物质。本发明的多孔基质(在根据本发明的方法中被称为“起始基质”)，不受任何特定的限制，只要基质包含孔。基质的孔的平均尺寸或平均直径不受任何特定的限制，并且可能使用例如具有0.01至20μm，优选地0.1至10μm，并且更优选地0.2至4μm的平均孔直径的基质。

基质的其他结构不受任何特定的限制。因此，根据本发明，多孔基质可能是例如膜(包括中空纤维膜)，由长丝、分裂纤维、纳米纤维或中空纤维、超短纤维组成的非纺织物或整体材料。多孔基质的材料也不受任何特定的限制，并且根据本发明，可能使用例如由纤维素水合物/纤维素酯/乙酸纤维素、纤维素纳米纤维、尼龙纳米纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚(氧-1,4-苯磺酰基-1,4-苯基)、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚乙烯(pe)和/或聚丙烯(pp)组成的膜或非纺织物。

根据本发明使用的是最初具有能够自由基聚合的基团的多孔基质，或者其中通过本领域技术人员已知的表面修饰的方法插入了官能团的多孔基质。在这种情况下，已知的表面修饰是例如具有官能团的单体的接枝聚合(“通过聚合接枝”)、通过等离子体处理、电子束处理、γ辐射、水解、氨解、氧化、还原、与功能性碳烯和/或氮烯反应等方法的活化。可替代地，也可以在不存在能够自由基聚合的基团的情况下使用多孔基质。

根据本发明，在特别优选的实施方案中，通过物理方法(例如通过粘合相互作用)或者通过共价方法(例如通过接枝)将无孔微球状体(微球体)结合在多孔基质的内表面和外表面上。在本发明的上下文中，术语“无孔微球状体”基本上被理解为意指球形结构，即微球状体的最小直径与最大直径的比率通常优选在1:2至1:1的范围内。根据本发明，微球状体的平均半径不超过多孔基质(即，未结合微球状体的多孔基质)的平均孔直径的30％。因此，根据本发明，微球状体优选地具有不超过约6μm，更优选地不超过3μm，并且最优选地不超过1.2μm的平均半径。根据本发明，微球状体或孔的直径或半径被理解为意指微球状体或孔的最大直径或最大半径。可以经由例如扫描电子纤维束(sem)测定多孔基质的孔的直径或半径以及微球状体的直径或半径。

根据本发明的色谱介质的微球状体不是凝胶或水凝胶，因为它们在亲水性溶剂(例如水和丙酮中)仅非常可忽略地溶胀(如果有的话)。因此，微球状体显著不同于pa文献1-5的(水)凝胶。

由于无孔微球状体的基本上为球形的结构，与仅由多孔基质构成的色谱介质相比，无孔基质的内表面和外表面上的无孔微球状体的形成有利地显著增加色谱介质的比表面积。本发明的色谱介质的显著增加的表面积有利地允许较高数量的色谱活性中心，意味着根据本发明的色谱介质具有增加的动态结合容量。根据本发明，术语“色谱活性中心”在这一点上表示意指可以选择性地与流体的某些组分形成键的官能性表面基团，色谱活性中心最初已存在于微球状体中，或者，然而，它也可能通过另外的修饰方法将它们固定在微球状体上。

因为根据本发明，微球状体的平均半径不超过多孔基质的平均孔直径的30％，多孔基质的孔结构被尽可能得到保留，意味着与仅由多孔基质构成的色谱介质相比，根据本发明的色谱介质的渗透率有利地受损很小。因此，根据本发明的色谱介质有利地允许高流速(渗透率)，并且还具有高动态结合容量。根据本发明的优选的实施方案，色谱介质的渗透率为起始基质(即，未结合微球状体的色谱介质的多孔基质)的渗透率的至少40％，优选地至少50％，更优选地至少60％，并且最优选地至少70％。

此外，微球状体使得可能针对亲和色谱的用途将多孔基质的孔尺寸最优化，即可能特别地将多孔基质的那些孔最优化，其将具有在无孔微球状体不存在下的过大孔尺寸，意味着在色谱过程中靶标分子将对流通过所述孔，而在如此进行的同时不展现出与表面的相互作用。

根据本发明，微球状体是无孔的，即其不具有任何孔。由于无孔微球状体，有利地没有仅通过扩散可到达的孔。这将动态结合容量对停留时间的依赖性最小化，因为这然后仅取决于色谱靶标分子向色谱活性中心的扩散。此外，这增加了动态分离过程中色谱活性中心的可达性，意味着可能特别地将后来引入色谱介质中的的色谱活性中心(诸如例如(亲和)配体)的消耗最消化，因为在固定(掺入)过程中配体未被固定在色谱靶标分子不能到达的孔中。

根据本发明的色谱介质的微球状体不受任何特定的限制，只要其平均半径不超过多孔(起始)基质的平均孔直径的30％。微球状体的材料也不受任何特定的限制。根据优选的实施方案，无孔微球状体基本上是球形的低聚物和/或聚合物，特别是由选自以下的至少一种单体构成的低聚物和/或聚合物：(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、取代或未取代的(甲基)丙烯酸烷基酯及它们的衍生物(特别优选地(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸丁酯或(甲基)丙烯酸羟乙基酯)、苯乙烯及它的衍生物(特别优选地氯甲基苯乙烯或4-乙酰氧基苯乙烯)、2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯、取代或未取代的n-烷基(甲基)丙烯酰胺及它们的衍生物，以及取代或未取代的n-n’-二烷基(甲基)丙烯酰胺及它们的衍生物，因为它们是以如下所述的合适好的方式合成可获得。根据优选的实施方案，至少一种单体具有环氧官能，因为可以经由所述官能以容易可获得的方式合成引入其他的色谱活性中心(诸如例如(亲和)配体)，和/或可以经由所述官能以简单的方式将微球状体结合至多孔基质上。根据本发明的其他实施方案，微球状体仅由单一单体构成。

根据本发明优选的实施方案，无孔微球状体以单层结合在多孔基质的内表面和外表面上。相反，如果无孔微球状体以多层结合在多孔基质上，则多孔基质的孔有变得堵塞的风险，并且这可以不利地影响根据本发明的色谱介质的渗透率。

根据本发明优选的实施方案，色谱介质的接枝度p为25％-40％。通过下式给出接枝度p：

其中mm为根据本发明的色谱介质的质量，且m0为多孔基质(未结合微球状体)的质量。如果接枝度p大于40％，则色谱介质的渗透率可能下降。相反，如果接枝度小于25％，则与多孔(起始)基质相比，色谱介质的表面积仅可扩大到相对小的程度。

根据本发明优选的实施方案，色谱介质的相对接枝度prel为最多0.25g/cm³。通过下式给出相对接枝度prel：

其中p为以％表示的以上限定的色谱介质的接枝度，ρ为以g/cm³表示的多孔基质(无微球状体)的密度，以及por为以％表示的多孔基质(无微球状体)的孔隙率。如果色谱介质的相对接枝度与pa文献1至5中的一样，为大于0.25g/cm³，则色谱介质的渗透率可能下降。

根据本发明的一个实施方案，无孔微球状体包含另外的色谱活性中心或配体，其与微球状体结合或被固定于所述微球上。另外的色谱活性中心或配体能够与色谱过程中的流体的某些组分选择性形成键。

通过实例的方式，可以提及的色谱活性中心或配体为离子交换剂、螯合剂和重金属螯合剂、各种链长度和构型的亲硫的疏水性配体、反相系统、染料配体、亲和配体、氨基酸、辅酶、辅因子及其类似物、底物及其类似物、内分泌和外分泌物质(诸如激素，和具有激素样作用的物质)、效应分子及其类似物、酶底物、酶抑制剂及其类似物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、缀合的脂肪酸及其类似物、核酸(诸如dna、rna及其类似物和衍生物(单链的、双链的和/或多链的))，以及肽核酸及其衍生物、病毒、病毒粒子、单体及其类似物和衍生物、低聚物至聚合物及其类似物和衍生物，可以为线性的或支链的、未取代的或取代的高分子量碳水化合物，聚合糖缀合物(诸如肝素、直链淀粉、纤维素、几丁质、壳聚糖及它们的单体和低聚物以及它们的衍生物和类似物)、木质素及其衍生物和类似物，其他的生物/化学配体，诸如寡肽和多肽，例如蛋白及它们的低聚物、多聚体、亚基以及其部分，特别是凝集素、抗体、融合蛋白、半抗原、酶及其亚基以及部分、结构蛋白、受体和效应分子以及它们的部分，另外的异源物质、药物和活性药物成分、生物碱、抗生素、生物模拟物等。根据本发明的一个实施方案，另外的色谱活性中心或配体选自：阴离子和阳离子基团、疏水基团、亲和配体、金属螯合物和反应性环氧化物、醛、吖内酯、n-羟基琥珀酰亚胺和/或碳二亚胺基团。根据本发明特别优选的实施方案，另外的色谱活性中心或配体为蛋白a或蛋白b。

本发明的其他方面涉及制备根据本发明的色谱介质的方法，其包括：

提供多孔起始基质；

提供包含至少一种单体，双官能、三官能或多官能交联剂，聚合引发剂和溶剂或溶剂混合物的聚合溶液，所述至少一种单体，所述双官能、三官能或多官能交联剂和所述聚合引发剂完全可溶解于所述溶剂或溶剂混合物中；以及

在所述多孔起始基质存在下在聚合溶液中引发聚合以形成无孔微球状体，所述无孔微球状体不能溶解于所述溶剂或溶剂混合物中，并与所述多孔起始基质的内表面和外表面结合；

所述微球状体的平均半径不超过所述多孔起始基质的平均孔直径的30％。

以上所有关于根据本发明的色谱介质的评论也适用于根据本发明的用于制备根据本发明的色谱介质的方法。

在根据本发明的方法的第一步中，提供了多孔起始基质。多孔起始基质不受任何特定的限制，并且可能使用例如以上所述的用于根据本发明的色谱介质多孔基质。此类多孔起始基质是商业可获得的，或者可以通过本领域技术人员已知的方法制备。

在根据本发明的方法的第二步中，提供了聚合溶液，其包含至少一种单体，双官能、三官能或多官能交联剂，聚合引发剂和溶剂或溶剂混合物，所述至少一种单体，所述双官能、三官能或多官能交联剂和聚合引发剂完全可溶解于所述溶剂或溶剂混合物中。

根据本发明，可能使用单一单体或者两种或更多种不同单体的混合物。至少一种单体不受任何特定的限制，只要它完全可溶解于使用的溶剂或溶剂混合物中。根据优选的实施方案，至少一种单体选自：(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、取代或未取代的(甲基)丙烯酸烷基酯及它们的衍生物(特别优选地(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸羟乙基酯或(甲基)丙烯酸丁酯)、苯乙烯及它的衍生物(特别优选地氯甲基苯乙烯或4-乙酰氧基苯乙烯)、2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯、取代或未取代的n-烷基(甲基)丙烯酰胺及它们的衍生物，以及取代或未取代的n,n’-二烷基(甲基)丙烯酰胺及它们的衍生物。根据优选的实施方案，至少一种单体具有环氧官能，因为可以经由所述官能以容易可获得的方式合成引入其他的色谱活性中心(诸如例如(亲和)配体)，和/或可以经由所述官能以简单的方式将微球状体结合至多孔基质上。

此外，聚合溶液包含根据本发明的方法中的双官能、三官能或多官能交联剂。根据本发明，术语“交联剂”被理解为意指能够将产生的微球状体交联至多孔起始基质的内表面和外表面上并且特别是能够将低聚物或聚合物交联至彼此以产生根据本发明的无孔微球状体结构的试剂。根据本发明的方法中的交联剂不受任何特定的限制，只要它完全可溶解于使用的溶剂或溶剂混合物中，并且为双官能、三官能或多官能的(即具有两个、三个或更多个官能团)，经由其形成的三维网络被连接。根据本发明，可能使用单一交联剂或者两种或更多种交联剂的混合物。根据优选的实施方案，双官能、三官能或多官能交联剂选自：乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯和n-n-亚甲基双丙烯酰胺。

此外，聚合溶液包含根据本发明的方法中的聚合引发剂。根据本发明，术语“聚合引发剂”被理解为意指能够例如通过uv照射或通过热能输入引发自由基聚合的试剂。根据本发明的方法中的聚合引发剂不受任何特定的限制，只要它完全可溶解于使用的溶剂或溶剂混合物中。根据本发明，可能使用单一聚合引发剂或者两种或更多种聚合引发剂的混合物。根据优选的实施方案，聚合引发剂选自：2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、偶氮双(异丁腈)、4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)、1,1’-偶氮双(环己烷甲腈)、过氧化苯甲酰、2,2-双(叔丁基过氧)丁烷、1,1-双(叔丁基过氧)环己烷、叔丁基过氧化氢、叔丁基过氧异丙基碳酸酯、过氧化环己酮和过氧化2,4-戊二酮。

在根据本发明的方法的第三步中，在多孔起始基质的存在下在聚合溶液中引发聚合以形成无孔微球状体，所述无孔微球状体不能溶解于溶剂或溶剂混合物中，并与多孔起始基质的内表面和外表面结合。聚合的引发不受任何特定的限制，并且可以例如通过uv照射和/或通过热量方法进行。

在聚合中，形成无孔微球状体，所述无孔微球状体通过物理方法(例如，通过粘合)或通过共价方法(例如，通过接枝聚合)与多孔起始基质的内表面和外表面结合。无孔微球状体不能溶解于使用的溶剂或溶剂混合物中，即在可检测范围内没有溶解。

根据本发明的方法的第二和第三步中的溶剂或溶剂混合物不受任何特定的限制，只要至少一种单体，双官能、三官能或多官能交联剂和聚合引发剂完全可溶解于其中，即存在均相的聚合溶液，而在第三步中产生的微球状体完全不能溶解于溶剂或溶剂混合物中。因此，根据优选的实施方案，使用选自以下的制备溶剂或溶剂混合物：环己醇/十二烷-1-醇、辛-2-酮、乙酸正丁酯、对二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、苯甲腈、环己酮、十二烷-1-醇、乙腈/乙醇/水、癸-1-醇和异丙醇/癸-1-醇。

在根据本发明方法的第三步中产生的微球状体的平均半径不超过多孔起始基质(即，无微球状体的多孔起始基质)的平均孔直径的30％。这是通过在聚合期间基于聚合引发剂(其与至少一种单体快速反应以形成低聚物和聚合物)的快速分解产生的无孔微球状体实现的。在其中生长的聚合物链不溶解的溶剂或溶剂混合物中产生的快速的宏观可观察的相分离(优选地在不超过30秒内)导致无孔微球状体的形成。由于使用的单体和交联剂与反应溶解的总体积的比率而造成的与表面的相互作用以及由于非常短的反应时间，无孔微球状体仅在多孔起始基质的内表面和外表面上形成，并且不形成将填充多孔起始基质的孔空间的内聚网络，并因而形成其自己的孔隙率。结果，尽可能保留多孔起始基质的孔结构，意味着与根据pa文献1至5的孔完全填充的情况一样，色谱介质的渗透性的受损可以得到明显减少。

为了实现上述球状体的形成，优先性考虑使用聚合溶液，其中基于聚合溶液的总体积，单体和交联剂的总体积不超过20体积％。此外，基于聚合溶液的总体积，交联剂的总体积优选地不超过6体积％。另外，聚合溶液中的聚合引发剂的浓度优选地为1重量％-3重量％。通过协调上述的优选条件和聚合溶液的成分，可能确保在不超过30秒后，优选地在不超过20秒后出现宏观可观察的相分离，意味着产生了与多孔起始基质的内表面和外表面物理或共价结合的微球状体，其平均半径不超过多孔起始基质的平均孔直径的30％。根据本发明，“宏观可观察的相分离”被理解为意指在单相中存在的先前均相的聚合溶液的异相的、双相的或多相的状态的达到。在聚合期间微球状体结构的团聚非常少，即在它们产生时微球状体彼此的交联仅非常少，意味着与从pa文献1至5已知的色谱介质相反，尽可能防止多孔起始基质的孔的填充。

由于根据本发明的色谱介质的多孔基质的内表面和外表面上的无孔微球状体，与仅由多孔基质构成的色谱介质相比，色谱介质的比表面积有利地显著增加。这有利地允许较高数量的色谱活性中心，意味着根据本发明的色谱介质具有增加的动态结合容量。同时，多孔基质的孔结构得到尽可能的保留，意味着与仅由多孔基质构成的色谱介质相比，根据本发明的色谱介质的渗透率有利地受损很少。因此，根据本发明的色谱介质有利地允许高流速并且还具有高动态结合容量。此外，微球状体有利地使得其可能针对亲和色谱的用途将多孔基质的孔直径最优化，即可能特别是在不存在无孔微球状体下将具有过大孔尺寸的多孔基质的那些孔最优化，意味着在色谱过程中靶标分子将对流通过所述孔，而在如此进行的同时不展现与表面的相互作用。由于无孔微球状体，有利地没有仅通过扩散可到达的孔。这有利地将动态结合容量对停留时间的依赖性最小化。此外，这增加了动态分离过程中色谱活性中心的可达性，意味着可能特别是将后来引入至色谱介质的色谱活性中心(诸如例如(亲和力)配体)的消耗最小化，因为在它们被固定(引入)时配体未被固定在色谱靶标分子不可到达的孔中。因此，根据本发明的色谱介质非常适合用于亲和色谱，特别是用于蛋白a或b亲和色谱。

将基于以下没有限制作用的实施例更具体地阐述本发明。

实施例

多孔起始基质：

通过本领域技术人员已知的常规制备方法制备了用作根据本发明的方法中的起始基质的具有0.01至20μm，优选地0.1至10μm，并且更优选地0.2至4μm的孔尺寸的多孔基质。通过进行毛细管流量测孔测试测定孔尺寸。可以从相应的操作说明(毛细管流量孔隙度仪6.0，capwin软件系统，porousmaterialsinc.)收集测定的细节。

实施例1：表面的预处理

预处理纤维素起始物质以在多孔起始基质的表面上产生不饱和官能团

在典型的反应中，将起始物质(再生的稳定化的纤维化)在使用氢氧化钠调节至ph13的20重量％的甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液中浸渍过夜，然后用反渗透水(“ro水”)冲洗15分钟。其后，将处理的膜在80℃干燥30分钟。

实施例2：在处理的表面上的接枝聚合物的生成

对于典型的聚合溶液，称重或测量并在超声波浴中处理30分钟直至完全溶解的是例如1.7ml(1.82g；12.79mmol；0.10eq.)的甲基丙烯酸缩水甘油酯(单体)、0.16g(0.71mmol；7·10-3eq.)的2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(聚合引发剂)、0.33ml(0.347g；1.75mmol；0.013eq.)的乙二醇二甲基丙烯酸酯(交联剂)、0.34ml(0.28g；1.78mmol；0.014eq.)的1-正癸醇和13.36ml(12.85g；128.32mmol；1.00eq.)的环己醇(溶剂混合物)。其后，将用聚合溶液润湿的样品在惰性条件(n2气氛)下用uv光(紫外光；254nm,40w)照射(5分钟)。对于在此发生的uv引发的、常规的自由基聚合，使用来自制造商llg的blx-e254bio-linkuv交联剂。然后将聚合的膜在流动的ro水下冲洗10分钟，然后在丙酮中摇动20分钟并空气干燥。

聚合机制的示意性描述。

进行了以下具体示例性实施溶液，其显示了使用的化学物质和每种情况中使用的以体积％和重量％按表示的量：

图1显示了对应于本发明的修饰2的根据本发明的色谱介质的(上/中间)和修饰之前多孔起始基质(下图)的sem图像。图1清楚地显示微球状体仅被接枝在起始基质的表面上，并且几乎保留了起始基质的实际孔结构。此外，很明显的是微球状体自身不展示多孔性。

相反，图2显示了具有相同起始基质的根据pa文献2(左上)、5(右上)、1(左下)和4(右下)的修饰方案修饰的色谱介质的sem图像。在这些修饰条件下，差异化的微球状体结构并未出现，并且可以容易地认识到多孔起始基质的孔被完全填充，且球状体结构(如果存在的话)非常高度地团聚，意味着有效表面积大大降低，且在起始基质的孔中产生了另外的单体生成的多孔物。

实施例3：色谱介质的渗透率的测定

使用圆形打孔机，按照实施例2从色谱介质中冲压出47mm圆形坯料(blanks)。将得到的47mm冲料(punches)用反渗透水润湿，并在流动的反渗透水下冲洗5分钟。将每块冲料装入顶部进料过滤器壳体sartorius16249型中。

在20-25℃和0.10巴正压下进行每次测量。测量的是100.0g介质为了流过色谱介质所需的时间。由此确定的流速的指定单位是ml/cm2×min×巴。使用的介质是反渗透水和ph7.5的磷酸盐缓冲盐水溶液。在流速确定之后，可能使用冲料作进一步分析。

图3显示由于经由起始基质的内表面和外表面上的微球状体的形成的多孔起始基质的本发明的修饰2(“inv.mod.2”)，渗透率为未修饰起始基质的渗透率的至少40％。相反，如果根据pa文献1至5的修饰方案(“mod.pa1至5”)对起始基质修饰，则修饰的色谱介质的渗透率不超过未修饰起始基质的渗透率的26％，在大多数情况下甚至显著低于起始渗透率的20％。

实施例4：蛋白质的固定

通过将根据本发明的色谱介质的微球状体的环氧官能团转化为醛官能团来固定蛋白质(配体)。将蛋白质(配体)直接固定在其上是可能的。为此，将根据本发明修饰的色谱介质在含有3％(重量％)偏高碘酸钠溶液的ro水中放置30min，并于随后在流动的ro水下冲洗10分钟，并在空气中干燥丙酮。此后，将因此制备的色谱介质在含有2.5％(重量％)氰基硼氢化钠溶液的磷酸氢钾缓冲液(ph8)中放置2h，向其中加入4.958μl/cm²的重组蛋白溶液(的蛋白质)以达到7.2mg/ml的浓度。此后，用ro水再次冲洗色谱介质，并在含0.01％(重量％)硼氢化钠溶液的ro水中放置10min。此后，用1×pbs缓冲液(磷酸盐缓冲盐水溶液)洗涤色谱介质，并于随后储存在20％乙醇/pbs溶液中。

实施例5：免疫球蛋白g的结合容量的测定：

通过使用pbs缓冲液(ph＝7.5)中的合适的蛋白质溶液(1mg/ml)测定免疫球蛋白g(igg)的结合。将按照实施例2的根据本发明的修饰并按照实施例4用蛋白a官能化的3层膜夹在膜支持物中。在膜支持物中，膜叠层具有15cm²的膜面积、5cm²的流入面积和500μm的床高度(膜叠层的厚度)。将膜支持物中的膜充满1×pbs缓冲液(ph＝7.5)以取代空气，然后连接到来自通用电气医疗(generalelectrichealthcare)的探测器100fplc系统。

然后，针对igg结合，使用包括四步的测试程序分析膜或膜叠层。测试程序的四步如下指定：

1.用25ml的1×pbs缓冲液(ph＝7.5)平衡膜，

2.用50ml的igg溶液装载膜，

3.用20ml的1×pbs缓冲液(ph＝7.5)洗涤，和

4.用0.1％甘氨酸溶液(ph＝3.5)洗脱。

以5个膜体积/min的流速进行所有步骤。在所有步骤中，测量膜单元后的检测器中的280nm处的吸收。

图4显示了按照本发明的修饰1的根据本发明制备的色谱介质的穿透曲线，其绘制为相对于动态结合容量dbc的百分比穿透。作为参考绘制的是商业上可获得的蛋白a膜吸附剂(sartobinda)的穿透曲线。图4清楚地显示，由于本发明的修饰(即由于微球状体的形成)，根据本发明的色谱介质的比表面积显著增加，并且这有利地导致明显更高的动态结合容量。

实施例6：按照实施例2的修饰的膜的比表面积的测定：

在来自微粒学的geminiv的帮助下，实施了所进行的表面积测定。事先将待测量的样品称重并放入样品室中。随后将其在70℃和2毫巴(由来自微粒学的vacprep061产生的负压)下完全加热2h。此后，用氮气冲洗样品室并在70℃和2毫巴下再次完全加热1h。对于实际测量，将氮气引导穿过待分析的物质。在通过液氮(-196℃)冷却的基础上，可能使用标准压力测量仪器在氮气的饱和蒸气压下测定吸附的量(吸附)。随后装置内压力的降低使一部分吸附气体量从表面脱离(解吸附)。结果，可能确定吸附/解吸附等温线。在0.05毫巴至0.3毫巴的相对压力范围内，由此测量的吸附或释放气体的量与表面积成比例。结果以m²/g直接输出。

图5显示了在本发明的修饰之后和修饰之前(即无微球状体的多孔起始基质)的比表面积的图。不管起始基质的比表面积如何，根据本发明的色谱介质的比表面积由于微球状体结构的形成总大于修饰之前。如从图6中明显看出的，在其他方面相同的条件下，本发明的修饰有利地导致蛋白a膜吸收剂(按照实施例4固定)上的igg的动态结合容量增加。

实施例7：测定根据本发明的色谱介质的孔尺寸和通过反向尺寸排阻色谱(isec)的方法测定孔隙率

通过进行毛细管流量测孔测试测定孔尺寸。可以从相应的操作说明(毛细管流量孔隙度仪6.0,capwin软件系统,porousmaterialsinc.)收集细节。

在标准的agilentlc系统(agilenttechnologies)上进行所有孔隙率测定实验，所述标准的agilentlc系统由具有脱气装置的四元泵、调温的自动进样器、二极管阵列检测器(dad)和折射率(ri)检测器组成。使用dad在280nm的波长处记录丙酮示踪信号。使用ri检测器追踪普鲁兰多糖示踪信号。对于所有记录的信号，按照haynes和sarma等人(alchejournal,第19卷，no.5，pp.1043–1046)建议的测量并计算了第一和第二统计动差。此外，校正由此获得的值以考虑hplc系统的影响：

μp＝μp，obs-μhplc

其中μp和代表示踪信号的第一和第二统计动差，μp，obs和涉及整个系统，而μhplc和仅描述hplc系统的影响。ci(l，t)描述在时间点t检测器处的示踪物质i的浓度。

为了测定作为示踪物的分子大小的函数的特定色谱介质的孔隙率，使用具有不同摩尔质量的普鲁兰多糖分子作为示踪物质。按照segre等人(biomacromolecules2003,4,1843–1847)建议的，基于摩尔质量计算它们的流体动力学半径。按下式计算作为分子大小的函数的色谱床中的可达的体积分数(accessiblevolumefraction)：

其中ε代表可达的体积分数(孔隙率)，v代表柱体积，且f代表体积流量。

图7显示了根据本发明的色谱介质(按照本发明的修饰1)相比使用的多孔起始基质的孔尺寸分布(上)，和经由isec确定的起始基质和根据本发明修饰的色谱介质的孔隙率相对于示踪分子的流体动力学直径的图(下)。如从图7中明显看出的，根据本发明可能调整取决于应用的起始基质的孔尺寸，并且在本发明的修饰后，色谱介质在任何情况下具有比起始基质小的孔尺寸。这仅仅是由于无孔微球状体接枝而引起的起始基质的预先存在的孔的尺寸减小。此外，图7显示经由具有相同修饰的各种起始基质的比较测量，可以排除微球状体的孔隙率。如果微球状体即为多孔的或如果将发生交联的大孔凝胶堵塞起始基质的孔，则就会出现孔分布的重叠，尽管为具有相同修饰的不同的起始物质，但情况并非如此。

实施例8：根据本发明的色谱介质的溶胀度和接枝度的测定

溶胀度描述在溶剂中一经溶胀聚合物膜体积的相对增加。出于实际原因，在pbs缓冲液中测定蛋白a亲和吸附剂。为此，首先测定的是干燥状态(v0)的色谱介质的体积，且其次测定的是湿润状态(vq)的色谱介质的体积。为了尽可能排除由于水含量引起的测量误差，在干燥箱中于80℃干燥(30min)后进行干燥体积的测量。经由以下公式测定溶胀度q：

下表显示了按照实施例3和实施例8，用水和丙酮，在按照本发明的修饰1的色谱介质上和无修饰的多孔起始基质(纤维素膜)上测量的溶胀和流速测量的结果：

作为亲水性溶剂在水中的溶胀(由于它们的亲水性结构，其由起始物质展现出来)被接枝的微球状体尽可能地阻止，而在作为非质子溶剂的丙酮中发生的仅是非常低的溶胀，其主要由起始基质引起。渗透率也在两种溶剂中没有显示出显著差异。这额外地排除了溶胀。根据限定，与来自pa文献1至5中的聚合物相反，接枝的微球状体因此不能被认为是聚合物凝胶/水凝胶。

接枝度描述了在修饰后起始基质的质量的相对增加。为此，首先测定的是修饰前的起始基质的质量(m0)，且其次测定的是修饰后的起始基质的质量(mm)。为了尽可能地排除由于水含量引起的测量误差，在干燥箱中于80℃干燥(30min)后进行质量的测量。经由以下公式计算接枝度p：

图8显示了用于igg的蛋白a膜吸附剂的渗透率(流速)、接枝度p和动态结合容量相对于起始基质的修饰的聚合时间的图。在这方面，可以经由用于修饰的组分的选择和经由反应时间来调整接枝度。从图8中可以明显看出，根据本发明的组合物允许非常快速的反应时间，其导致根据本发明的结构特征。随着聚合时间的增加，正如对水的渗透率，接枝度增加，以及igg的动态结合容量减少。在根据本发明的情况下，高接枝度展现出最大值，当超过该最大值时，导致较差的色谱介质性能。特别地，如pa文献中所公开的120分钟的长聚合时间对色谱介质的性能具有专有地不利的影响(也参见实施例9)。

如上文所解释的，接枝度也可以被描述为经由以下方程式的相对接枝度：

其中p为上文限定的以％表示的色谱介质的接枝度，ρ为以g/cm³表示的无微球状体的多孔基质的密度，且por为以％表示的无微球状体的多孔基质的孔隙率。

图9显示了根据本发明的色谱介质(菱形)和来自引用的pa文献1至5的色谱介质(方形)的渗透率相对于它们各自的相对接枝度的图。引用的pa文献1至5中的色谱介质的相对接枝度不超过0.25g/cm³，且这导致色谱介质的渗透率的明显下降。相反，根据本发明的色谱介质由于它们较低的接枝度而有利地展现较高的渗透率。

此外，渗透率和相对接枝度之间的相关性非常清楚地表明无孔微球状体仅使得根据本发明的色谱介质的起始基质的孔变窄，因为发现了线性相关性。此外，通过实施例的方式，可能基于所述线性相关性的第二测量点显示确定的孔尺寸与流速(渗透率)之间的哈根-泊肃叶(hagen-poiseuille)行为：

哈根-泊肃叶方程式通常描述了在层流稳定流过管道的情况下体积流量的变化，其中当流体及其性质保持不变时，管的半径和长度发生变化。因为，根据本发明，膜的长度保持不变，并且由于用微球状体的修饰，仅孔的直径变窄，所以这里可以假设根据本发明的色谱介质的假定行为和相关结构性质(无孔微球状体，其仅使得起始基质的孔变窄并且不会阻塞它们)适用(如根据本发明所假定的)。

表：与根据哈根-泊肃叶计算的流速测定相比的实验的孔尺寸和流速测定。

如上表所示，在根据本发明的色谱介质的情况下，计算的和实验的流速非常好地匹配，但这在来自pa文献的色谱介质的情况下不能观察到。由此可以推断，在本发明修饰的情况下，起始基质的孔随着接枝度的增加而逐渐变窄，而大孔凝胶完全填充来自pa文献的色谱介质中的孔，因此，流速由大孔凝胶的孔隙率决定，因为这里不能观察到线性行为。此外，pa文献中的色谱介质的流速(渗透率)小于根据本发明的色谱介质的流速(渗透率)。

实施例9：亲和吸附剂上的固定色谱活性中心(配体)的测定

为了测定每膜面积作为色谱活性中心(配体)的固定蛋白质，使用bca(二喹啉甲酸)测定。为此，从根据本发明的色谱介质冲压出冲料(d＝13mm)，并将它们最初放入皮氏(petri)培养皿(3ml)中并用bca试剂(2ml)润湿。bca试剂由比例为50:1的bca蛋白质测定试剂a(pierce产品号23221)和bca蛋白质测定试剂b(pierce产品号23224)组成。此后，将如此制备的样品在振动平台(80rpm)上搅动60分钟。

与没有膜样品的bca试剂的参比溶液相比，将由bca试剂的氧化产生的颜色变化测量为吸光度(在562nm处)。在来自analytikjena的specord200plusuv/vis分光光度计上进行光度测量。借助于来自图10的校准曲线(其产生下面的方程式)，可能将吸光度转换成蛋白质量[μg]。

随后将该值与冲料的体积相关联，并以每ml膜体积(vm)的μg蛋白质指定。

蛋白a：a[au]＝0.00578·固定化量蛋白[μg]

图11至13显示了动态配体利用率(图11)和静态配体利用率(图12)以及固定化配体的量(图13)相对于根据本发明的色谱介质的各自的比表面积的图。

如在图11至13中可以鉴定的，通过微球状体产生的根据本发明的色谱介质的较大比表面积提供了多个结合的配体，并且出人意料地提供了更佳的配体利用率。

如果色谱介质的性能“per”被限定如下，如下表所显示的，则与商业亲和吸附剂和来自引用的pa文献1至5的那些相比，结果是性能的明显增加。

表：色谱介质的接枝度、h2o渗透率、10％穿透下的动态结合容量(dbc10％)和产生的性能的总括。

(“5cv/min”对应于5个柱体积/分钟的通量)

图显示：

图1：按照本发明的修饰2的根据本发明的色谱介质(上/中间)和修饰之前的多孔起始基质(下)的sem图像。

图2：按照pa文献2(左上)、5(右上)、1(左下)和4(右下)的修饰方案的色谱介质的sem图像。

图3：按照实施例3的渗透率的降低。

图4：根据本发明的色谱介质和sartobinda的穿透曲线，绘制为相对于动态结合容量dbc的百分比穿透。

图5：本发明修饰之后和修饰之前的比表面积的图。

图6：根据本发明的色谱介质的动态容量相对于它们的比表面积的图。

图7：根据本发明的色谱介质和未修饰的起始基质的孔尺寸分布(上)；根据本发明的色谱介质的孔隙率相对于示踪分子的流体动力学直径的图(下)。

图8：渗透率(流速)、接枝度和动态结合容量相对于修饰的聚合时间的图。

图9：渗透率相对于相对接枝度的图。

图10：实施例9的校正曲线。

图11：根据本发明的色谱介质的动态配体利用率相对于各自的比表面积的图。

图12：根据本发明的色谱介质的静态配体利用率相对于各自的比表面积的图。

图13：根据本发明的色谱介质的固定化配体的量相对于各自的比表面积的图。