液相色谱用填充剂及液相色谱用柱的制作方法

本发明涉及具有磺基的液相色谱用填充剂以及将该填充剂填充而成的液相色谱用柱。

背景技术：

液相色谱(以下也称为“hplc”)作为广泛的样品的分析方法，在各种领域中使用。其中使用了具有磺基的填充剂的阳离子交换色谱用于蛋白质、氨基酸等的分析。

在采用阳离子交换色谱的蛋白质的分析中，有时发生蛋白质对填充剂的非特异吸附。如果发生蛋白质的非特异吸附，则不仅得不到准确的分析结果，而且产生加快柱的劣化这样的问题，因此需要使用不发生该非特异吸附的填充剂。

蛋白质的非特异吸附的主要原因是填充剂与蛋白质间的疏水性相互作用。因此，作为抑制该蛋白质的非特异吸附的手段，填充剂使用了亲水性高的粒子。例如，作为填充剂，众所周知利用了(甲基)丙烯酸酯系聚合物的粒子。

专利文献1中公开了利用向包含甲基丙烯酸酯系聚合物的粒子导入了磺基的离子交换体的糖化血红蛋白的分析方法。

在专利文献2中公开了在二乙烯基苯系疏水性粒子的表面形成甲基丙烯酸等的亲水性聚合物层而获得的填充剂。

在非专利文献1中公开了使用了下述填充剂的蛋白质的分析例，所述填充剂是通过乙腈中的聚合反应，在产生的二乙烯基苯的聚合物的芯表面形成甲基丙烯酸酯的层并获得粒子，进一步，使表氯醇与该粒子反应后，导入了磺基的填充剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平3-255360号公报

专利文献2：日本特开平3-073848号公报

非专利文献

非专利文献1：shuhongzhangetal.journalofchromatographya，965(2002)83-92

技术实现要素：

发明所要解决的课题

对于对蛋白质进行分析的柱，需要提高粒子的亲水性。在使用包含广泛使用的(甲基)丙烯酸酯系共聚物的粒子作为填充剂的情况下，作为其原料，选择使用亲水性的单体。此时为了交联而使用的交联性(甲基)丙烯酸酯具有疏水性比较高这样的特征，因此，在蛋白质的分析用途的填充剂中，不能提高交联性(甲基)丙烯酸酯单体的比例。其结果，不能提高填充剂的交联度，不具有充分的强度。虽然为了提高分析能力，可以考虑减小填充剂的粒径，但是如果在填充剂的强度不高的状态下使其为小粒径，则不耐受制成柱的情况下的压力而变形，不能进行良好的分析。因此，要求具有高亲水性，能够以小粒径使用的强度高的填充剂。

此外，如专利文献2那样，对于在疏水性粒子的表面形成亲水性聚合物层的方法，由于形成亲水性层的必要性，因此具有操作工序增加、生产性降低这样的问题。

因此，本发明的课题是提供可以适合用于蛋白质、氨基酸等的分析，并且能够有效率地生产的液相色谱用填充剂以及液相色谱用柱。

用于解决课题的方法

本发明提供以下的液相色谱用填充剂以及将该填充剂填充而成的柱。

[1]一种液相色谱用填充剂，其包含：具有来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的共聚物的粒子，其特征在于，上述来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元：上述来源于二乙烯基苯的单体单元的比为70～90质量％：30～10质量％，在上述粒子表面结合有磺基，包含式(1)所示的结构作为结合了磺基的结构，在上述粒子中包含磺基40μmol/g～300μmol/g。

(式中，r表示来源于共聚物粒子表面的结构部分，x表示氧原子或硫原子，n表示2～4的整数。)

[2]根据上述1所述的液相色谱用填充剂，上述(甲基)丙烯酸酯包含甲基丙烯酸缩水甘油酯。

[3]一种填充剂的制造方法，是上述1或2所述的填充剂的制造方法，其具有下述工序：通过悬浮聚合将包含(甲基)丙烯酸酯和二乙烯基苯的单体混合物进行共聚，获得共聚物粒子的工序；以及在碱的存在下，在包含仲醇的溶剂中使共聚物粒子与磺化剂反应的工序。

[4]根据上述3所述的填充剂的制造方法，在上述获得共聚物粒子的工序之后，实施不将所得的粒子供于其它化学反应，而使其与上述磺化剂反应的工序。

[5]根据上述3或4所述的填充剂的制造方法，(甲基)丙烯酸酯为甲基丙烯酸缩水甘油酯，磺化剂为丙磺酸内酯，仲醇为2-丙醇。

[6]一种糖化血红蛋白分析用的液相色谱用柱，其是填充上述1或2所述的液相色谱用填充剂而成的。

[7]一种糖化血红蛋白的分析方法，其使用了填充有上述1或2所述的液相色谱用填充剂的柱。

发明的效果

本发明的一个实施方式中的液相色谱用填充剂以及液相色谱用柱可以适合用于蛋白质、氨基酸等的分析。特别是填充剂即使将丙烯酸系聚合物作为基剂，也可以在使亲水性高的状态下提高强度，因此能够减小粒径，因此分析能力提高。

此外，上述填充剂和柱能够有效率地生产。

附图说明

图1为通过分析例1获得的色谱图。

图2为通过分析例2获得的色谱图。

图3为通过分析例3获得的色谱图。

图4为通过分析例4获得的色谱图。

图5为实施例1中获得的填充剂粒子的sem照片(倍率20000倍)。

具体实施方式

本发明的一个实施方式中的液相色谱用填充剂使用包含来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的共聚物的粒子作为基材。另外，所谓(甲基)丙烯酸酯，是指丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。

本发明的一个实施方式中的共聚物使用二乙烯基苯作为交联性单体。通过使用二乙烯基苯作为交联性单体，从而即使提高非交联性单体的比例，所得的共聚物也具有高的机械强度。因此，该共聚物的粒子即使减小粒径，强度也高，在使用了该粒子作为柱的填充剂的情况下也能够耐受与粒子的小粒径化相伴的分析时的压力上升。由此，能够提高柱的分离性能。

作为单体的二乙烯基苯可以为间位和对位的异构体混合物。

作为共聚物的单体的(甲基)丙烯酸酯，可举出例如，(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸2-羟基乙酯、(甲基)丙烯酸4-羟基丁酯、二(甲基)丙烯酸甘油酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯等，它们可以单独使用或组合二种以上使用。

为了提高基材的亲水性、为了导入磺基，(甲基)丙烯酸酯优选包含一定量以上的具有羟基、缩水甘油基的(甲基)丙烯酸酯。其量不能笼统地说，但优选为(甲基)丙烯酸酯整体的例如70质量％以上。作为具有羟基、缩水甘油基的(甲基)丙烯酸酯，可举出(甲基)丙烯酸2-羟基乙酯、甘油二(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸4-羟基丁酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯等。其中，(甲基)丙烯酸缩水甘油酯可以适合用于磺基结构的导入，并且可以通过开环反应而转变成具有羟基的结构，因此是更优选的。从获得容易性考虑，最优选为甲基丙烯酸缩水甘油酯。

(甲基)丙烯酸酯中，也可以并用疏水性强的乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸己酯。其使用量只要为对共聚物的亲水性不带来大影响的范围即可，具体而言，相对于(甲基)丙烯酸酯的总量为10质量％以下。

在本发明的一个实施方式中的共聚物中，来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的比是，来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元(使用多种时为它们的合计量)：上述来源于二乙烯基苯的单体单元为70～90质量％：30～10质量％，更优选为75～85质量％：25～15质量％。

如果来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元小于70质量％，则共聚物的疏水性变高，易于发生蛋白质的非特异吸附。此外，在向来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元导入磺基的情况下，难以有效率地导入磺基。另一方面，如果来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元超过90质量％，则共聚物粒子的强度变低，在将其用于柱的填充剂的情况下，粒子变形，易于导致柱的劣化。

聚合物中，除了来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元、来源于二乙烯基苯的单体单元以外，还可以包含其它单体单元。其它单体单元的量只要是对共聚物的亲水性不带来大影响的范围即可，例如为共聚物的10质量％以下的量。优选为5质量％以下的量，进一步优选为3质量％以下的量。作为其它单体单元的单体，可举出苯乙烯、乙基苯乙烯、甲基苯乙烯、丙基苯乙烯、甲氧基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、丁二烯、乙酸乙烯酯等。

共聚物的粒子的大小只要是能够作为液相色谱的柱用填充剂使用的范围，就没有特别限制，如果考虑对柱的填充和分离性能，则平均粒径优选为1μm～10μm。如果平均粒径为10μm以下，则化合物的分离能力高，可以获得良好的分析结果。另一方面，如果为1μm以下，则柱的压力变高，填充易于变得困难。为了获得分离能力高的柱，粒子的平均粒径更优选为2μm～7μm，最优选为2μm～3μm。

本说明书中的平均粒径为体积平均粒径，可以如下测定。首先，将粒子用粒度分布测定装置以成为2000个以上的方式拍摄，从所得的二维粒子图像(优选为静止图像)获得各粒子的等效圆直径(具有与粒子图像的投影面积相同的面积的圆的直径)。从该等效圆直径算出各粒子的体积，以算出的体积为基准，进行平均化而获得的粒径即为本说明书中的平均粒径。此时，各粒子视为与上述等效圆直径具有相同直径的球体。作为粒度分布测定装置，可以使用fpia-3000(シスメックス社制)等。

共聚物的粒子优选在其表面几乎不具有微细的细孔。具体而言，通过气体吸附法测定的总细孔容积相对于粒子的质量优选为0.05cm³/g以下，进一步优选为0.02cm³/g以下。几乎没有微细的细孔的粒子的强度提高。此外，在使用以该粒子作为基材的填充剂进行hplc分析的情况下，试样所包含的蛋白质等化合物不会在细孔内扩散，因此能够进行迅速的分析。

总细孔容积可以使用カンタクローム社制autosorb(注册商标)iq作为装置进行测定。

本发明的一个实施方式中的液相色谱用填充剂可以通过在获得了具有来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的共聚物的粒子后，向粒子表面导入磺基来制造。

上述共聚中，可以使用公知的油溶性自由基聚合引发剂。作为聚合引发剂，可举出例如2,2’-偶氮二异丁腈(以下也称为aibn)、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)(以下也称为v-65)、2,2’-偶氮二异丁酸二甲酯、2,2’-偶氮二(2-甲基丁腈)、过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰等。

聚合引发剂的使用量只要根据单体的种类、量来适当确定即可，通常，相对于单体的合计量100质量份为0.1～5质量份。

作为共聚的方法，可以利用例如，悬浮聚合法、乳液聚合法、沉淀聚合法等。对于在单体溶解但聚合物不溶解的适当有机溶剂中进行聚合反应的沉淀聚合，可以获得粒径一致的粒子。然而，沉淀聚合有时在聚合中发生粒子的凝集，有时难以收率好地合成单分散的粒子。在不易发生粒子的凝集方面，优选为悬浮聚合法或乳液聚合法，更优选为悬浮聚合法。在悬浮聚合法中，使用了控制了细孔径的shirasu多孔质玻璃(spg)膜和内压式microkitmn-20(sgpテクノ株式会社制)的spg膜悬浮聚合法、使用了微通道悬浮装置(株式会社イーピーテック制)的微通道悬浮聚合法等由于能够获得粒径一致的粒子，因此是更优选的。

在这样的聚合方法中，聚合反应可以通过例如，在60～80℃下加热6～20小时来进行。

在聚合后，使用筛子、分级装置(例如，半自由涡式分级机aerofineclassifierac，日清エンジニアリング株式会社制)进行分级，从而可以调节平均粒径、均匀性和微细粒子的含量等。

为了在共聚物的粒子的表面几乎不设置微细的细孔，例如，可以通过在聚合时不添加稀释剂来进行。

为了向所得的共聚物粒子的表面导入磺基，例如，可以使用磺化剂。作为磺化剂，可举出2-羟基乙烷磺酸钠、3-羟基丙烷磺酸钠、2-巯基乙烷磺酸钠、3-巯基丙烷磺酸钠、2-溴丙烷磺酸钠、3-溴丙烷磺酸钠等磺酸盐、1,3-丙磺酸内酯、1,3-丁磺酸内酯、1,4-丁磺酸内酯、2,4-丁磺酸内酯等磺内酯化合物等。它们之中，从反应的容易性考虑，优选为3-巯基丙烷磺酸钠和1,3-丙磺酸内酯，更优选为1,3-丙磺酸内酯。

这些磺化剂利用与在共聚物粒子表面存在的反应性官能团的反应，作为磺基结合。作为反应性官能团，优选为羟基、环氧基，更优选为环氧基。

磺化剂除了与来源于在粒子表面存在的共聚物的反应性官能团直接反应以外，也可以使间隔基与上述反应性官能团反应，或在上述反应性官能团为环氧基的情况下使环氧基开环反应后，与磺化剂反应。优选直接反应，使用了由此获得的填充剂的柱的分离性能提高，除此以外制造效率也优异。特别是，在糖化血红蛋白的分析中，与在进行了存在于共聚物粒子表面的环氧基的开环反应后进行磺化相比，将环氧基直接磺化时作为目标的蛋白质的分离变得更良好。

这样，优选不将所得的共聚物粒子供于其它反应，也包括环氧基的开环反应，而用于与磺化剂的反应。

共聚物粒子与磺化剂的反应可以通过与磺化剂的种类对应的适当方法进行。例如，在使用磺内酯化合物作为磺基剂向来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的单体单元导入磺基的情况下，可以使用碱进行。作为碱，可举出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等无机碱、三乙胺、n,n-二异丙基乙基胺等胺类、甲醇钠、甲醇钾、叔丁醇钾、1,8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一碳烯等有机碱。上述碱中，优选为氢氧化钠、氢氧化钾、叔丁醇钾，更优选为氢氧化钠、氢氧化钾。无机碱以适当浓度的水溶液使用。

在使用磺酸盐作为磺基剂而导入磺基的情况下，也可以同样地使用碱进行。在使用具有卤基的磺酸盐的情况下，通过在反应中在共聚物粒子上产生的羟基引起的卤素取代反应而导入磺基，在使用具有羟基或巯基的磺酸盐的情况下，通过伴随共聚物粒子上的环氧基的开环的亲核反应而导入磺基。

作为用于磺化反应的溶剂，可举出水、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮、醇等。它们之中优选为醇，从反应效率和反应性的观点考虑更优选为仲醇。作为仲醇，可举出2-丙醇、2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-戊醇、3-戊醇等，从经济的观点考虑优选为2-丙醇。在使用磺内酯化合物作为磺化剂的情况下，从反应效率性的观点考虑也特别优选为仲醇。

在将酸性催化剂用于共聚物粒子与磺化剂的反应的情况下，反应性不充分。特别是，在使用了路易斯酸的情况下，所得的填充剂的亲水性低，不分散于水溶液，因此不能填充于柱等，不发挥作为蛋白质分离用填充剂的功能。

与共聚物粒子结合的磺基的量优选为20μmol/g～300μmol/g，更优选为40μmol/g～300μmol/g。如果结合的磺基的量小于40μmol/g，则hplc等液相色谱分析中的保留时间变短，可进行良好的分离。如果为40μmol/g以上，则填充剂的水分散性良好，可以获得对蛋白质的分析良好的柱。此外，在结合的磺基的量超过300μmol/g的情况下，试样的保留变得过强，有分析时间变长的倾向，不优选。

上述磺基的量可以通过以下方法测定。即，在进行了真空干燥的粒子(试样)1g中加入0.5m盐酸10ml使其分散，在过滤后用水洗涤。由此，磺基变为酸型，获得经洗涤的状态的粒子。接下来，在上述粒子中加入0.5m氢氧化钠10ml，在设置了用于收集滤液的容器的状态下将其过滤，接着将粒子用水10ml洗涤。将滤液与洗涤液的混合液用0.1m盐酸滴定。求出此时所需的盐酸的摩尔数，将从氢氧化钠的摩尔数(在上述情况下为5mm)扣除的值设为磺基的量。

期望在本发明的一个实施方式中的共聚物粒子的表面具有导入了磺基的下述式(1)所示的结构。

(式中，r表示来源于共聚物粒子表面的结构部分，x表示氧原子或硫原子，n表示2～4的整数。)

该结构例如通过使用(甲基)丙烯酸缩水甘油酯作为(甲基)丙烯酸酯的至少一种进行共聚，然后，通过磺基剂使环氧基开环并且形成磺基而结合，或使环氧基开环而形成二醇或单醇单硫醇后利用磺基剂使磺基结合来形成。此外，也可以通过使用含有二醇结构的酯或含有单醇单硫醇的酯作为(甲基)丙烯酸酯的至少一种进行共聚，然后，利用磺基剂使磺基结合来形成。

在本申请说明书中，所谓粒子表面，是指固体的共聚物粒子在反应溶剂中能够与试剂接触的部分，通常不包含固体内部。但是，可以在个体内部结合磺基。

本发明的一个实施方式中的液相色谱用填充剂是在上述共聚物粒子表面结合具有磺基的特定结构而成的。

本发明的一个实施方式中的液相色谱用柱具有上述填充剂。柱通过将上述填充剂通过浆料法等公知的填充法填充于柱而获得。填充用的柱可以使用peek制或sus制的物质作为框体的材质，但在sus制的情况下蛋白质可能会吸附，因此在对包含蛋白质的试样进行分析的情况下优选为peek制。柱内设置为了使填充剂粒子不流出的玻璃料，但为了也抑制该玻璃料的吸附，优选使用peek制的框体。

本发明的一个实施方式中的液相色谱用柱通过作为离子交换色谱用柱使用，可以对各种蛋白质、氨基酸等进行分析。在该情况下，作为洗脱液，可以优选利用例如磷酸等缓冲液。

实施例

以下举出实施例和比较例具体地说明本发明。

在实施例和比较例中测定的平均粒径为体积平均粒径，通过具体实施方式之栏所记载的方法测定。

实施例1

[聚合工序]

在由甲基丙烯酸缩水甘油酯(日油株式会社制)和二乙烯基苯(新日铁住金化学株式会社制，纯度99％)(甲基丙烯酸缩水甘油酯：二乙烯基苯＝82：17(质量比))构成的单体混合物50g中，添加作为聚合引发剂的过氧化月桂酰(ナカライテスク株式会社制)0.5g(相当于上述单体混合物的1质量％的量)，获得了混合物。将所得的混合物以1％烷基二苯基醚磺酸钠水溶液500g作为水相，通过微通道悬浮装置(株式会社イーピーテック制)制成油滴，进一步进行聚合反应，获得了共聚物粒子。

所得的粒子的平均粒径为2.6μm。

[修饰工序]

在上述共聚物粒子3g中加入2-丙醇24g和1,3-丙磺酸内酯(东京化成工业株式会社制)3g，加热到50℃。在其中加入8m氢氧化钾水溶液1.2g，搅拌6小时后过滤，用0.5m盐酸、水、0.5m氢氧化钠水溶液、水依次洗涤，从而获得了填充剂粒子1。

加入0.5m盐酸10ml使1.0g的进行了真空干燥的填充剂粒子1分散，过滤后用水洗涤，获得了磺基变为酸型的粒子。在上述粒子中加入0.5m氢氧化钠10ml，在设置了用于收集滤液的容器的状态下将其过滤，接着将粒子用水10ml洗涤。将采集到设置的容器的滤液与洗涤液的混合液用0.1m盐酸滴定。由开始使用的氢氧化钠的摩尔数(5mm)与滴定所需的盐酸的摩尔数之差，求出磺基的量。其结果，磺基量相对于粒子质量为200μmol/g。

将填充剂粒子1进行了sem观察。未确认到细孔。将观察结果示于图5中。采用气体吸附的细孔测定(使用了カンタクローム社制autosorb(注册商标)iq作为使用装置。)的结果，细孔容积为0.01cm³/g，是非常小的值。

将所得的填充剂粒子1通过浆料法填充于内径4.6mm×长度10mm的peek制柱，获得了柱1。

分析例1

将实施例1中制造的柱1安装于液相色谱(agilent(注册商标)1260infinity，アジレント·テクノロジー株式会社制)，在下述分析条件下进行了糖化血红蛋白对照样品(アークレイ株式会社制)的分析。

洗脱液：磷酸缓冲液(ph5.3)

流速：1.7ml/min

检测器：uv-vis检测器(波长：415nm)

温度：35℃

将所得的色谱图示于图1中。此时的稳定型糖化血红蛋白峰的理论板高为33μm。

分析例2

将实施例1中制造的柱1安装于液相色谱(agilent(注册商标)1260infinity，アジレント·テクノロジー株式会社制)，在下述分析条件下进行蛋白质的分析。

洗脱液：(a)20mm2-吗啉代乙烷磺酸缓冲液(ph值5.6)

(b)(a)+0.5mna2so4

线性梯度0min～2min，(a)～(b)

流速：1.7ml/min

检测器：uv-vis检测器(波长：280nm)

温度：室温

样品：1.卵清蛋白，2.胰蛋白酶原，3.核糖核酸酶a，4.细胞色素c，5.溶菌酶(シグマアルドリッチ社制)

将所得的色谱图示于图2中。可知在1.5分钟这样的短时间内5种蛋白质被良好地分离。

比较例1

在由二甘醇二甲基丙烯酸酯(日油株式会社制)30g、2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(东京化成工业株式会社制)10g(二甘醇二甲基丙烯酸酯：2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸＝75：25(质量比))构成的单体混合物中，使作为聚合引发剂的过氧化苯甲酰0.1g(相当于上述单体混合物的0.25质量％的量)溶解而获得了混合物。将所得的混合物加入到5％聚乙烯醇(クラレポバールpva224，株式会社クラレ制)水溶液中，通过悬浮聚合法在80℃下聚合24小时。将所得的粒子分级，获得了平均粒径6.5μm的填充剂粒子2。

将所得的填充剂粒子2利用浆料法填充于内径4.6mm×长度20mm的sus制柱，获得了柱2。

分析例3

使用比较例1中获得的柱2，在与分析例1相同的条件下进行了分析。将所得的色谱图示于图3中。此时的糖化血红蛋白峰的理论板高为81μm。

由于不能减小平均粒径，因此与分析例1相比，理论板高大。进一步，由于得不到充分的分离，因此柱长度变得必要，与分析例1相比，分析所需的时间变为约1.3倍。

比较例2

[聚合工序]

在由甲基丙烯酸缩水甘油酯56g和乙二醇二甲基丙烯酸酯24g(甲基丙烯酸缩水甘油酯：乙二醇二甲基丙烯酸酯＝70：30(质量比))构成的单体混合物中，使作为聚合引发剂的v-651.5g(相当于上述单体混合物的1.88质量％的量)溶解而获得了混合物。在使聚乙烯醇4g和氯化钠4g溶解于水400g的水溶液中，加入所得的混合物，通过悬浮聚合法在60℃下聚合10小时。将所得的粒子分级，获得了平均粒径2.5μm的共聚物粒子。

[修饰工序]

将上述聚合物粒子与实施例1同样地修饰，获得了填充剂粒子3。将该填充剂粒子3与实施例1同样地填充于柱，结果在填充中途由于填充剂粒子的变形而压力上升，输送停止，不能填充于柱。

比较例3

在实施例1中获得的共聚物粒子3g中加入四氢呋喃24g使其分散。在其中加入1,3-丙磺酸内酯3g和三氟化硼二乙基醚配位化合物0.1g，在50℃下反应6小时。将反应液过滤，按照四氢呋喃、水、0.5m盐酸、水、0.5m氢氧化钠水溶液、水的顺序洗涤而获得了粒子。

在所得的粒子1.0g中加入2-丙醇1ml和0.5m盐酸10ml使其分散，过滤后用水洗涤，获得了磺基变为酸型的粒子。在上述粒子中加入0.5m氢氧化钠10ml，在设置了用于收集滤液的容器的状态下将其过滤，接着将粒子用水10ml洗涤。在采集到设置的容器的滤液与洗涤液的混合液中加入纯水70ml，用0.1m盐酸滴定。计算的结果，磺基量相对于粒子质量为38.2mmol/g。

所得的粒子具有不分散于水的性质。

作为不分散于水的理由，推测是因为在酸性条件下，由丙磺酸内酯的反应导入的磺基量少。由于不分散于水，因此得不到适于蛋白质的分析的柱。

实施例2

使实施例1中获得的共聚物粒子3g分散于8ml的水，加入0.5m硫酸8ml，在70℃下反应6小时，使环氧环开环。通过利用ft-ir而来源于环氧基的峰烧失确认了环氧环通过其与硫酸的反应而开环。通过与实施例1同样的操作对所得的粒子进行与1,3-丙磺酸内酯的修饰工序，获得了3g填充剂粒子4。磺基量相对于粒子质量为180μmol/g。

将所得的填充剂粒子4通过浆料法填充于内径4.6mm×长度10mm的peek制柱，获得了柱4。

分析例4

使用柱4，作为洗脱液条件，使不连续梯度(stepgradient)为0min～0.5min为(a)磷酸缓冲液(ph5.3)，0.5min～1.0min为(b)磷酸缓冲液(ph8.5)，除此以外，与分析例1进行了同样地测定。将所得的色谱图示于图4中。与图1同样地，糖化血红蛋白在短时间内良好分离。在进行了比较的情况下，关于糖化血红蛋白和不稳定型糖化血红蛋白的分离，图1的色谱图稍微胜出。