使用对流加热和无标记微阵列对DNA进行多重扩增和检测的装置和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月14日提交的美国临时专利申请序列号62/731,495的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文。

本公开涉及使用对流加热和无标记微阵列对dna进行多重扩增和检测的装置和方法。

背景技术：

本发明是在美国国立卫生研究院和美国国家癌症研究所授予的政府拨款号r01ca203964的支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

相关技术

政府机构、医院和医生办公室以及民间消费者对快速和多重dna诊断有着强烈的市场需求。当前商用qpcr系统体积大且价格昂贵，而且仅限于同时检测4-6个感兴趣的dna标记(4-6重)。商用qpcr系统的两个示例是luminex-xtag和biofire-filmarray，它们允许对单个dna样品进行闭管20重分析。这两个系统都需要笨重(>20kg)和昂贵(>$50,000)的仪器，并且不适用于护理点应用。等温dna扩增方法诸如alerei流感试验，不需要体积大或复杂的仪器，但限于3重。最后，新一代测序技术(ngs)允许对dna进行极高的多重分析，但需要劳动密集型的文库构建工作流程(12小时或更长)和长时间的测序运行(24小时或更长)。这些劳动密集型和时间密集型的特点使得ngs不适用于护理点应用。不同平台基于其多重处理能力和仪器负担能力/便携性的比较如图1所示。与本发明有关的实施例(称为“donutpcr”平台，在下文更详细地讨论)唯一地允许使用负担得起的便携式的仪器进行高度多重dna测试。

国际专利申请号pct/us2017/02453和pct专利公布wo2017/172760(‘760公布)公开了由未决申请的发明人开发的系统和方法，这些系统和方法能够在护理点环境中实现高度多重dna分析。参考实施例的循环性质，‘760公布中公开的系统在本文将被称为“donutpcr系统”(或类似术语)。‘760公布公开了一种donutpcr耗材芯片、一种将探针共价附接到流控反应室的内表面的方法、包含扩增引物的pcr试剂和检测探针设计。在‘760公布中，使用了若干不同的仪器进行pcr扩增、微阵列荧光成像、图像分析和数据解释。此外，运行试验需要许多手动干预步骤。在此，公开了单个统一仪器，该仪器结合有所有的机械部件、热部件、光学部件和用户界面部件，从而允许dna样品入答案出平台(sample-inanswer-outplatform)。

看起来至少有三个应用领域，在这个三个应用领域中，donutpcr系统的高度多重性和便携性独特地满足了未满足的需求：(1)基于家庭和药房的传染病检测和分型，(2)医院获得性感染的床边分析，以及(3)基于现场的农业和兽医基因分析和疾病检测应用。

如先前所提及的，‘760公布公开了donutpcr试验和耗材芯片。如本文所用，术语“芯片”包括如‘760公布中所述的对流流体流控设备。尽管描述了仪器的一些必要部件，但‘760公布并未描述完全集成式donutpcr仪器，在该仪器中，在芯片初始装载之后不需要手动干预。具体地，它并未描述装载donutpcr芯片和将芯片自动夹紧到加热器以形成良好热接触所需的机械部件。另外，‘760公布描述了荧光显微镜的使用，但并未描述独立读出设备所需的光学元件(滤光片、透镜、镜子)。因此，相对于‘760公布，本发明是新颖的和创造性的。

已由诸如appliedbiosystems、bio-radlaboratories、qiagen、cepheid和roche等公司发明了许多定量pcr(qpcr)仪器并将其商业化。这些qpcr仪器均具有主动冷却机制，并且耗电大。此外，这些qpcr仪器均未使用像素分辨率小于100μm的相机来获取荧光点的图像，而这是实现高重读出所必需的。因此，相对于过去的qpcr仪器，本发明是新颖的和创造性的。

对流pcr在2002年的学术文献中已有报道，它使用两个处于不同温度的加热器。然而，已报道的对流pcr仪器并未集成用于高重dna分析的微阵列，因此，没有已报道的对流pcr仪器使用像素分辨率小于100μm的相机来获取荧光点的图像，这是实现高重读出所必需的。因此，相对于过去的对流pcr仪器，本发明是新颖的和创造性的。

微阵列利用具体探针的空间分离来实现dna分析的高重读出。然而，商用微阵列使用主动流控(例如，泵)和/或手动清洗来去除未结合的标记试剂或扩增子，从而形成易于受到污染的开放系统。相比之下，在本发明中，将嵌入在donutpcr芯片中的微阵列竖直安装，并使用两个单独的加热器将其差异化加热到95℃和60℃。因此，相对于过去的微阵列技术，本发明是新颖的和创造性的。

技术实现要素：

简而言之，本公开提供了用于生物样品中的核酸靶标的多重扩增和检测的装置和方法。本公开的实施例包括：机械系统，所述机械系统配置成提供芯片的装载、竖直定位和夹紧；热控制系统，所述热控制系统配置成维持所述芯片的不同温度；以及光学荧光成像系统。

某些实施例包括一种用于样品中的核酸靶标的多重扩增和检测的装置，其中该装置包括：机械系统，该机械系统配置成提供芯片的装载、竖直定位和夹紧；热控制系统，该热控制系统配置成维持芯片的第一温度和芯片的第二温度，其中第一温度不同于第二温度；光学荧光成像系统，该光学荧光成像系统配置成收集至少40像素×40像素的阵列中的空间信息；电力系统，该电力系统配置成向机械系统、热控制系统和光学荧光成像系统提供电能；控制器，该控制器配置成控制机械系统、热控制系统、电力系统和光学成像系统的操作；以及图形用户界面(gui)，该图形用户界面配置成允许用户经由用户界面软件操作控制系统。

在特定实施例中，芯片具有10mm和320mm之间的高度、10mm和320mm之间的宽度以及0.5mm和10mm之间的厚度。在一些实施例中，gui为触摸屏界面。在具体实施例中，触摸屏界面集成在智能电话中。在某些实施例中，机械系统包括芯片保持器、框架、滑动部件和支撑部件。在特定实施例中，芯片保持器包括插槽、定位槽和运动控制套件。在一些实施例中，框架包括底座、主要结构载件、压杆定位器、压杆和运动控制套件。在具体实施例中，运动控制套件包括机动移动部件及其保持器。

在某些实施例中，机动移动部件包括线性致动器或步进马达。在特定实施例中，滑动部件包括滑动平台和滑动杆。在一些实施例中，支撑部件包括轨道支架。在具体实施例中，热控制系统包括多个温度传感器、多个加热块和热源。在某些实施例中，多个温度传感器包括电阻温度检测器(rtd)、热敏电阻、热电偶或ir传感器。在特定实施例中，多个温度传感器中的某个温度传感器嵌入到加热块中。在一些实施例中，多个温度传感器中的某个温度传感器联接到多个加热块中的加热块的表面。在具体实施例中，多个加热块包含铝、不锈钢或黄铜。

在某些实施例中，多个加热块共同接触室的总表面积的至少50％。在特定实施例中，热源包括粘合柔性加热器、热探针或电热丝。在一些实施例中，荧光成像系统包括光源、光学模块和具有至少40×40像素的检测器。在具体实施例中，检测器为相机。在某些实施例中，相机包括科学级相机或智能电话相机。在特定实施例中，光源包括弧光灯、蒸气灯、发光二极管(led)或激光器。在一些实施例中，光学模块包括激发滤光片、二向色镜、分束器、发射滤光片、平面镜、物镜和/或光学透镜。在具体实施例中，机械系统包含一种或多种塑料。在某些实施例中，机械系统包含聚乳酸(pla)、聚碳酸酯(pc)、乙腈丁二烯苯乙烯(abs)或陶瓷。在特定实施例中，电力系统包括ac/dc电源、mosfet、开关、放大器、二极管、晶体管和电阻器。在一些实施例中，控制器包括微控制器和/或pid控制器。在具体实施例中，微控制器包括raspberrypi、arduino或genuino。

某些实施例包括一种用于使用如本文所述的装置(包括例如根据权利要求1所述的装置)来分析芯片中的样品的方法。在特定实施例中，该方法包括：将芯片装载到装置中；操作机械系统以将芯片夹紧在第一加热块和第二加热块之间；将第二加热块加热到第二温度，其中第二温度不同于第一温度；将来自光源的激发光引导到芯片的表面；检测来自芯片的发射光；以及分析来自芯片的发射光。

一些实施例进一步包括生成数据报告，该数据报告记录对发射自芯片的光的分析。具体实施例进一步包括从第一加热块与第二加热块之间松开芯片。某些实施例进一步包括从装置卸载芯片。在特定实施例中，装载芯片包括操作马达进行线性移动达。在一些实施例中，装载芯片包括操作配置成将芯片拉入装置的机构。在具体实施例中，夹紧芯片包括利用自锁马达、凸轮从动件组合或弹簧来操作机构。

在某些实施例中，在操作期间，将第一温度保持在75℃至105℃之间。在特定实施例中，在操作期间，将第二温度保持在30℃至75℃之间。在一些实施例中，由微控制器程序控制第一温度和第二温度，该微控制器程序基于来自温度传感器的反馈来改变热源功率。在具体实施例中，由比例-积分-微分(pid)控制器控制第一温度和第二温度。在某些实施例中，将第一温度传感器嵌入在第一加热块中。在特定实施例中，将第二温度传感器嵌入在第二加热块中。在特定实施例中，将第一温度传感器联接到第一加热块的表面。在一些实施例中，将第二温度传感器联接到第二加热块的表面。在具体实施例中，激发光源与芯片的表面形成介于30°与90°之间的角度。在某些实施例中，检测来自芯片的发射光包括操作相机来以每2分钟不少于1幅图像的频率连续获取图像。

本发明的方法、组合物、试剂盒和系统中的任一个的任何实施例可由所描述的步骤和/或特征组成或基本上由所描述的步骤和/或特征组成，而不是包括/包含(comprise/include)/含有/具有所描述的步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由……组成”或“基本上由……组成”可替换上述任何开放式连接动词，以将给定权利要求的范围从使用开放式连接动词的范围更改为其他范围。

除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互斥的，否则权利要求中的术语“或”的使用是指“和/或”，尽管本公开内容支持仅涉及替代方案及“和/或”的定义。

贯穿本申请全文的术语“约”用于表示一个值包括用于测定该值的设备或方法的误差的标准偏差。

根据长期存在的专利法，“一个/一种(a/an)”在权利要求书或说明书中与“包括”结合使用时表示一个或多个，除非特别注明。

根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，虽然指示了本发明的优选实施例，但是详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为通过此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

以下附图形成了本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合在此呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。专利或申请文件可含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。

图1是关于不同平台的多重处理能力以及仪器负担能力和便携性的图形比较。

图2示出了根据本公开的在毛细管中的对流流动和在芯片中的流动，以及相关联的制造和操作原理。

图3示出了根据本公开的用于装置操作的工作流程图。

图4示出了根据本公开的装置的局部分解图，以及原型装置的照片和来自原型的成像结果。

图5示出了根据本公开的装置的概念性功能流程图。

图6示出了根据本公开的装置的芯片保持器和芯片的透视图和照片表示。

图7示出了根据本公开的装置的替代的芯片保持器、装载机构和夹紧机构的示意图。

图8示出了根据本公开的装置的各个子框架和组装好的框架的透视图。

图9示出了根据本公开的装置的压杆和组装好的框架的透视图。

图10示出了根据本公开的处于未夹紧位置和夹紧位置的装置的机械系统。

图11示出了根据本公开的装置的单独的并且处于组装好的框架中的加热块的正投影视图和透视图。

图12示出了根据本公开的装载的热控制系统部件的正投影视图、透视图和照片表示，以及加热块温度的响应曲线。

图13示出了根据本公开的装置的荧光成像系统的示意图。

具体实施方式

本公开的示例性实施例包括三个主要部件：(1)芯片：环形反应室，用于可靠的对流pcr，无需主动冷却或流控；(2)试验和读出：使用单个荧光通道，经由微阵列中探针的空间分离，以封闭管的方式同时检测和分析50个或更多的dna靶标；以及(3)装置：一种便携式且价格合理的仪器，可实现多重扩增和实时读出。

对流pcr的原理是，由于温度引起的密度差(瑞利-贝纳德对流)，水溶液可以可控地循环。简而言之，较热的溶液密度较小，而较冷的溶液密度较大，因此重力可驱动差异化加热的溶液的循环。由于不需要主动冷却或流控部件，因此对流pcr仪器的尺寸和重量将显著低于采用peltier系统的常规pcr。

对流pcr首先在概念上引入，并在2002年使用垂直毛细管作为反应室进行了实验证明，如图2的截面a所示。然而，该反应室具有循环速度低的“死区”，导致非特异性dna扩增和引物二聚体形成。使用了毛细管的对流pcr的这些相对缺点使对流pcr成为常规pcr的不受欢迎的替代方案，因此在商业上使用率很低。相比之下，图2的截面b所示的工程化环形反应室消除了芯片中的死区，并促进了pcr溶液在室内穿过95℃温度区和60℃温度区的均匀循环。截面b中所示的donutpcr流控芯片100设计为实现比毛细管更均匀的温度控制，以便对流pcr能够进行诊断级dna分析。经由入口孔口将pcr溶液注入到反应室中，而另一孔口则允许空气旁通。中间的内部圆形插入物(“岛状物”)防止出现pcr混合物在不受控制的温度下长时间停留的死区。图2的截面c中示出了doughnutpcr芯片100的制造和组装过程。图2的截面d中示出了可与donutpcr芯片100结合使用的无标记微阵列技术的概述。扩增子和dntp是未标记的，并且通过未标记的扩增子置换淬灭剂标记的寡核苷酸来实现局部荧光增强。因此，该技术避免了开管清洗步骤。图2的截面e提供了与扩增子混合物杂交之前(上图)和之后(下图)的无标记微阵列的荧光图像。此处的图像是使用zeissaxioobserver荧光显微镜拍摄的。

常规的定量pcr(qpcr)仪器使用不同的光谱波长来实现对不同dna靶标的多重分析。然而，不重叠可见光波长荧光团的数量限制为5-6。对于从感染性疾病和抗生素耐药性分析到农业基因分析的应用，通常必须检测二十多个不同的靶标。可以例如通过经由四个反应对样品中的二十个不同的dna靶标进行分析来执行样品缩分，每个反应测试五个靶标。然而，在实践中，这很麻烦并且当样品有限时会牺牲灵敏度。微阵列使用空间分离来实现使用单个荧光波长的高度多重处理，但需要劳动密集型和开管清洗步骤来抑制荧光背景。复杂的微阵列工作流程使得传统的微阵列不适合体外诊断(ivd)使用。相比之下，印在环形donutpcr芯片的内表面上的微阵列是无标记微阵列，并且不需要清洗即可去除多余的扩增子或反应试剂。

为了在donutpcr芯片中执行许多dna靶标的多重扩增和检测，需要将芯片轻巧地安装在不同温度的两个加热器上，以形成良好的热接触。为了防止背景光过多，需要将donutpcr芯片移到暗区，或者必须密封芯片装载门。还需要通过使用适当选择和定位的滤光片和光学元件，利用适当波长、强度和焦点的光对donutpcr芯片进行照明。相机以固定的时间间隔为微阵列拍照，然后使用软件解释图像，以判断存在/不存在亮点。本公开的示例性实施例提供一种实现上述每个过程的集成装置。

现在参考图3，提供了用于对样品中的核酸靶标进行多重扩增和检测的装置200的示意图，以及与装置200一起使用的工作流程图的概述。如图3所示，样品110可与一种或多种pcr试剂混合，然后经由移液管装载到芯片100中。然后，可将芯片100(具有样品110)密封并插入装置200中进行分析。用户可经由图形用户界面(gui)210来控制装置200的操作。在某些实施例中，gui210可无线地联接至装置200，并且在特定实施例中，gui210可集成至移动设备220(包括例如智能电话、膝上型计算机、平板计算机或其他适当的设备)中。gui210可用于经由装置200发起对样品110的分析并显示图像结果。设备220可用于将测试结果发送给医生、护士或其他医疗保健专业人员。

现在参考4，提供了装置200的概述。图4的截面a示出了组装好的部件的三维图(外壳除外)。图4的截面b提供了装置200的工程原型的照片(同样，除外壳外)。图4的截面c示出了通过截面b中所示的装置200的实施例成像的doughnutpcr芯片100中的100-点阵列的荧光图像。装置200的某些实施例可包括三维打印的结构部件(例如，使用诸如ultimaker3的合适设备)。其他部件可包括大量现成的模块。在截面b所示的实施例中，智能电话用作相机、图像处理单元、用户界面和无线数据发射器。图4所示的实施例是壁式供电的，但也具有内部移动电源，其旨在为长达60分钟的操作供电(例如，一份完整的样品分析加上可能需要的额外时间裕度)。

图5提供了由装置200执行的分析的概念图或流程图，其包括在四个主要系统中执行的步骤：荧光成像210、用户界面220、机械230和热控制240。下面结合装载有适当样品、dntp、dna聚合酶和缓冲剂的doughnutpcr芯片100，提供了用于操作装置200的通用过程的概述。

用户最初可接通装置200的电源，因此在初始化之前执行系统检查(验证控制器连接、检查相机功能和光源照明等)。在装置200的初始化期间，打开热控制系统，然后激活加热块至预定温度并将它们保持在稳定温度。更详细的温度控制方法信息将在热控制系统一节中进一步解释。随着加热块过程，温度记录也可同时开始。热控制系统可连续运行，直到实验完成。系统初始化过程还包括打开荧光成像系统、检查光源能量、确认相机焦点以及重新确保准备好拍摄初始化图像以进行记录。接下来，系统重置移动的机械零件的位置。例如，这可包括向后移动将加热块固定到未夹紧位置的框架、将芯片保持器设置为卸载/弹出位置以及准备装载芯片。

装置200可包括指示装置准备好进行实验或分析的显示器。然后，用户可准备将芯片装载到装置200中。接下来，用户可插入并装载芯片，确保已装载并放置了芯片。装置200可配置成使得加热块随后将夹紧芯片。然后，装置200指示其准备好开始并显示用于实验/分析的倒计时。然后，装置200启动/重置荧光成像系统定时器，使用相机以预定义的时间间隔(例如，每45秒)拍摄一幅图像。在每个预定义的时间间隔后，光源将打开以激发芯片中的荧光团。在某些实施例中，具有激发滤光片的激光器或led灯可被认为是潜在光源。

然后，装置200可使用相机来捕获并保存当前芯片的荧光图像。不同类型的荧光团和仪器设计将需要不同的荧光滤光片组。接下来，可关闭光源电源，并以预定义的时间间隔拍摄下一幅图像。这可重复进行，直到实验/分析完成。实验完成后，热控制系统和荧光成像系统将关闭。分析完成后，芯片会自动弹出。由于芯片温度高，用户应谨慎使用。然后，可松开机械系统中的加热块，然后将芯片弹出。装置200可继续分析图像并最终确定数据报告。然后，用户可继续进行下一个实验或关闭电源装置200。

现在参考图6，截面a示出了配置成保持一个或多个芯片100的芯片保持器205的三维图。图6的截面b示出了芯片100在装载到保持器205中之后的位置，而截面c示出了处于未装载位置(左图)和装载位置(右图)的芯片100。图6的截面d提供了装载有芯片100的芯片保持器205(在此示例中经由三维打印制造)的照片。

装置200包括机械系统中的部件，该部件将执行包括但不限于芯片装载和加热块夹紧的功能。

装置200中的芯片保持器205的功能是插入doughnutpcr芯片100并引导芯片竖直移动到预定位置。芯片保持器包括三个主要部分：插槽206、定位槽207和运动控制套件208。插槽206从仪器表面挤出以进行芯片插入。芯片100插入插槽206中，该插槽将支撑芯片100竖直上下移动，并且伴随运动控制套件208的引导，然后将芯片100精确地定位在定位槽207中。

定位槽207旁边的两个竖条用作导轨209，并且引导芯片100竖直上下移动。运动控制套件208包括两个部分，移动部件211及其固定装置213。在某些实施例中，移动部件211利用线性运动马达，例如，线性致动器或步进马达。运动控制套件208的固定装置213用于固定并确保在芯片100移动期间移动部件211的稳定。插槽206、定位槽207、导轨209和固定装置213共同形成集成芯片保持器205。在示例性实施例中，运动控制套件208的移动部件211组装在芯片保持器205上。在组装了整个芯片保持器205和移动部件211之后，它们将固定在装置200内部。由运动控制套件208引导和指示芯片100的竖直移动过程，其中doughnutpcr芯片100是竖直移动的物体。

在实验之前，将芯片保持器205重置到卸载位置，并且移动部件211(例如，线性致动器)将如图6的截面c的左视图所示伸长。在插入芯片100后，芯片将与缩短的线性致动器一起竖直向下移动，直到芯片100精确定位在定位槽207中。在那时，芯片100的上边缘和下边缘两者都将装配在插槽206(芯片100的下边缘的一部分)和定位槽207中并保持竖直，如图6的截面d和截面c的右视图所示。实验之后，移动部件211将伸长，并引导芯片100向上移动以便弹出芯片100。

在其他实施例(未示出)中，芯片保持器可包括不同的形状以容纳不同类型的装备。在特定实施例中，芯片保持器可竖直地上下移动，而不是仅移动芯片本身。

在执行实验或分析之前，将由移动部件211驱动芯片保持器205，并且这会将插槽206从装置200中推出以进行芯片插入。在插入芯片100之后，芯片100将直接接触定位槽207的底部，并且芯片的上边缘将平行于插槽206。然后，移动部件211将驱动整个芯片保持器205向下移动，然后将插槽206的一部分拉回到装置200，并完成芯片装载的过程。

在实验之后，移动部件211将与携带芯片100的芯片保持器205一起向上移动，以将插槽206从仪器200的表面中挤出，然后可移除芯片100。

图7的截面a示出了用于配置成保持芯片100的芯片保持器205的替代设计。图7的截面b提供了用于配置成装载芯片保持器205的装载机构215的四种不同配置。每个实施例包括加热器，但包括用于将芯片保持器205移入和移出加热器之间的位置的不同部件。第一实施例包括具有导螺杆和导螺母的步进马达。第二实施例包括凸轮围绕水平轴线旋转以升高和降低联接到芯片保持器的从动件的步进马达。第三实施例包括凸轮围绕竖直轴线旋转以升高和降低联接到芯片保持器的从动件的步进马达。第四实施例包括联接到辊齿轮和辊的配置成接合和升高和降低芯片保持器205的马达。图7的截面c示出了配置成将加热器夹紧在芯片保持器和芯片的每一侧上的夹紧机构225的三个不同实施例。每个实施例包括配置成控制部件移动的步进马达，以及配置成接触加热器的夹紧块。第一实施例包括联接到步进马达的凸轮和联接到夹紧块的从动件。该实施例还包括在导轨上的多个弹簧，其中弹簧被偏置以朝向加热器上对夹紧块施加力(例如，弹簧朝向夹紧位置偏置)。当凸轮旋转时，它可接合从动件并抵消弹簧力，以将夹紧块引导至远离加热器的位置(例如，到达未夹紧位置)。

图7的截面c中的第二实施例示出了具有与前述实施例类似的配置的夹紧机构225。然而，代替凸轮，该实施例利用导螺杆和导螺母布置来使夹紧块朝向和远离加热器移动。图7的截面c所示的第三实施例示出了具有步进马达和凸轮的夹紧机构225，这些凸轮接合围绕铰链机构枢转的夹紧块。该实施例还包括扭转弹簧，该扭转弹簧配置成将枢转夹紧块朝向加热器偏置。

现在参考图8和图9，示出了单独的和组装好的框架的透视图。框架的主要功能是竖直固定加热块。此处所示的框架有两个部分，在本文有时称为“框架alpha”和“框架beta”。

图8的截面a提供了子框架410(也称为框架alpha)的透视图，而图8的截面b提供了子框架420(也称为框架beta)的透视图。图8的截面c示出了位于子框架410的近侧以形成框架450的子框架420。这两个框架都包含三个主要部件：底座、主要结构载件和压杆。底座用于整体框架和滑动平台之间的连接和固定。图8的截面a示出了具有底座411和主要结构载件412的子框架410，而图8的截面b示出了具有底座421和主要结构载件422的子框架420。图9的截面a示出了与子框架410结合使用的压杆413和414，以及与子框架420结合使用的压杆423和424。另外，图9的截面a示出了联接到压杆413和414的加热块415和416，以及联接到压杆423和424的加热块425和426。图9的截面b示出了组装有子部件的框架450。为了清楚起见，并非在截面b中标记所有单独的部件。

主要结构载件412和422在框架450中起主要作用，并且它们的主要功能是将压杆413、414、423和424固定在夹爪417和427上(在图8的截面a和b中标记)。在某些实施例中，在制造期间，底座411和421以及结构载体412和422可分别制成单个部件。每个部件都可由硬质材料制成，以便保持其形状和形式。在三维打印原型中，聚乳酸(pla)材料和丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)材料等都可以是合适的材料。

压杆413、414、423和424的功能是固定加热块415、416、425和426。如图9所示，压杆413、414、423和424的形状是扁u形。压杆需要在高温下保持其形状，建议使用耐热材料。在某些实施例中，可将聚碳酸酯(pc)或陶瓷材料可用于压杆。

在将压杆413、414、423和424(经由子框架410和420)联接到框架450之后，加热块415、416、425和426将被竖直地放置。子框架410将组装前两个加热块415和416，并且子框架420将组装后两个加热块425和426。子框架410和420(也称为框架alpha和框架beta)的配置(例如，形状和尺寸)不同，以利于便于两个完全组装好的子框架。如图8所示，线性致动器430联接在子框架410和子框架420之间。当线性致动器430伸长时，加热块425和426将更靠近加热块415和416移动，直到加热块完全接合或夹紧芯片100。当线性致动器430缩短时，加热块425和426将远离加热块415和416移动，直到加热块成功地分离或松开芯片100。

图10提供了配置成提供芯片100的竖直装载和夹紧的机械系统500的概述。图10的截面a示出了处于未夹紧位置的机械系统500的侧视图。在该视图中，线性致动器430处于缩回位置，并且子框架420朝向线性致动器430移动。

图10的截面b示出了处于夹紧位置的机械系统500的侧视图。在该视图中，线性致动器430处于伸出位置，并且子框架420远离线性致动器430并且朝向芯片100移动。

图10的截面c提供了处于夹紧位置的机械系统500的透视图，而截面d提供了具有装载的doughnutpcr芯片100的机械系统500的照片。为了清楚起见，并非图10中的所有部件都用参考数字标记。

子框架410和420可由滑动部件460支撑，以便于框架向前和向后移动。在具体实施例中，可将可商购获得的线性轴承平台(由部件号sc8uu识别)用于滑动部件。在某些实施例中，滑动部件可包括滑动平台、滑动杆和夹紧支架。滑动平台的表面是水平的，并且联接到框架底座411和421。滑动平台联接到滑动杆，并且可沿着滑动杆来回移动。

在示例性实施例中，滑动平台设计可以定制，只要其保持其功能以最小化摩擦即可。在一个实施例中，滑动杆是直径为8mm的不锈钢表面抛光圆柱体。在某些实施例中，两个滑杆可用于平台。滑动杆可从许多可商购获得的产品中选择，并且可以是多种尺寸和材料中的任一种。夹紧支架用于固定和定位滑动杆。在某些实施例中，可使用三组夹紧支架，每组包含两个夹紧支架。一组夹紧支架在两组滑动平台之间形成分隔和缓冲，以防止过度移动，从而避免在夹紧过程中破坏donutpcr芯片100。

本发明的示例性实施例还包括热控制系统，该热控制系统配置成经由加热块415、416、425和426维持芯片100的两个不同温度。现在参考图11的截面a，提供了加热块415和416的前视图和后视图。如图11所示，加热块416包括靠近块416的一个边缘的楔形狭缝418。如下面进一步描述的，楔形狭缝418允许荧光成像。当加热块416处于夹紧位置时，楔形狭缝418的中心对应于无标记微阵列在装载的doughnutpcr芯片100上的位置。在所示的实施例中，在操作期间将加热块415和425设置为95℃，并且在操作期间将加热块416和426设置为60℃。

图12示出了根据本发明的热控制系统的示例性实施例的不同方面。截面a示出了附接至加热块的热源431的三维图的示意性透视图，而截面b提供了配置成联接到加热器块(例如，块426)的粘合柔性加热器的热源431的照片。图12的截面c示出了嵌入在doughnutpcr芯片室下方的加热块425和426中的温度传感器432的局部剖视图。图12的截面d示出了附接在芯片100旁边并且位于加热块425和426的表面上的温度传感器432。图12的截面e提供了配置成热电偶和热敏电阻的温度传感器432的照片。另外，图12的截面e示出了各种温度传感器，包括表面粘合rtd传感器。图12的截面f提供了热控制系统600的照片，包括热控制板610的原型。图12的截面g示出了以摄氏度为单位测量的加热块温度相对于以秒为单位的时间的响应曲线。

在某些示例性实施例中，加热块是具有抛光表面的导热板。在特定实施例中，加热块应表现出可覆盖donutpcr芯片的至少一半的宽度和长度。加热块的原理是通过将芯片夹紧到加热的加热块的抛光表面上，将芯片加热到预定温度。在附图所示的具体实施例中，总共使用四个单独的加热块。在仪器操作期间，加热块中的两个保持95℃的温度，另外两个保持60℃的温度。

用于稳定温度控制的加热块的总数可能会有所不同。例如，在图11中，考虑到维持温度的良好的反馈控制回路，仅使用加热器415和416就足够了。在附图所示的实施例中，使用四个加热块实现温度鲁棒性和容错性。加热块中使用的材料可以是铝、不锈钢或黄铜或其他合适的导热材料。加热块的厚度可基于期望的温度和热源的性质进行调整。在附图所示的示例性实施例中，对于加热块，使用三毫米厚的铝板。

在示例性实施例中，温度传感器可组装在加热块的表面上，也可嵌入在加热块中，如图12的截面c和d所示。在所示的实施例中，温度传感器在加热块与donutpcr芯片接触的位置处嵌入在加热块中，以便获得donutpcr芯片温度的最准确的温度读数(参见图图12的截面c)。在示例性实施例中，温度传感器应能够准确地测量20℃至105℃的温度，其响应时间≤1秒，并且准确度≤1.5℃。附图中所示的实施例使用了omegat型热电偶。在实验上，已经观察到其他类型的热电偶也能达到类似的结果。另选地，也可替代地使用电阻温度检测器(rtd)或热敏电阻。需注意，如果采用嵌入式温度传感器策略，则加热块的形状应适应温度传感器的形状。

本公开的示例性实施例还包括向加热块提供热量的热源。所示的实施例包括kapton聚酰亚胺粘合柔性加热器。该加热器粘附在加热块表面，但不直接接触donutpcr芯片。加热器通过改变提供给热源的功率来维持温度。另选地，任何包含电热丝的加热板都可代替加热块或加热器。具体地，需注意，热源可经由将电能转换成热量来快速加热加热块，但不能提供快速冷却。

示例性实施例进一步包括温度传感器反馈回路作为热控制器的中心方面。热控制器从温度传感器读取温度，并对加热块的功率提供指导，以(1)快速实现加热到所需温度，以及(2)准确保持温度，即使由于环境而可能产生波动。示例性实施例可使用arduino微控制器通过放大器模块准确读取热电偶的温度，并控制热源的功率。另选地，通用pid(比例-积分-微分)控制器也能够实现相同的功能。

本发明的示例性实施例还包括光学荧光成像系统，该光学荧光成像系统配置成收集至少40像素乘40像素的阵列中的空间信息。现在参考图13，示出了示例性光学荧光成像系统的概述。图13的截面a示出了包括传统的或典型的荧光显微镜布置的系统700，而截面b示出了用于原型仪器的光学系统800的示意图。

donutpcr芯片100的荧光成像需要：光源710；光学模块720，用于将光引导并聚焦到芯片100的适当区域；发射滤光片730，用于减少其他波长的背景信号；以及光电探测器阵列740或相机，用于图像获取。

在图13的截面a所示的实施例中，系统700还包括二向色镜750，该二向色镜是高通镜，其将反射波长较短的光，同时允许波长较长的光通过。因此，激发光将反射到标本以穿过物镜，然后激发荧光团。所发射的光子发生红移约20nm，并且将穿过二向色镜750。为了提高信噪比，应用发射滤光片730以阻挡其他波长的背景光。最后，发射光穿过目镜760以获得更好的放大和聚焦。

上面描述了荧光显微镜中使用的荧光成像的标准方法。图13的截面b呈现了更便携并且与智能电话相机兼容的系统800的简化替代设计。系统800仅使用一个发射滤光片830和一个绿光激光器(532nm)810。在所示的实施例中，绿光激光器810用作相干光源，并且相对于芯片表面成45℃角。通过发射滤光片830可清楚地看到dna微阵列。可使用替代光源(例如，发光二极管(led)或弧光灯)代替激光器，但需要额外的激发滤光片，并且需要聚焦。

现在返回参考图13的截面a，光学透镜760用于提供放大。无论是科学级相机还是移动电话相机都能产生清晰的微阵列图像，以供专用软件进行下游图像处理。图2的截面e中所示的图像是使用具有标准滤光片套件的科学级相机拍摄的。图4的截面c中的图像是采用iphone6s使用图12的截面b中所示的设置拍摄的。另选地，适当定位的光电探测器阵列也可起到提供有关微阵列点亮度的相关信息的作用。

鉴于本公开，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文所公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选的实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法以及方法的步骤或所述步骤的顺序施加变化。更具体地，将显而易见的是，化学上和生理上均相关的某些药剂可以代替本文所述的药剂，同时将实现相同或相似的结果。对于本领域的技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

v.参考文献

以下参考文献以提供对本文所述的那些的示例性程序或其他细节补充的程度明确以引用方式合并于本文。

pct专利公布wo2017/172760