用于收集核酸样本的系统和方法与流程
本申请是申请号为201580073867.2、申请日为2015年11月20日、发明名称为“用于收集核酸样本的系统和方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为pct/us2015/061917的国际申请的中国国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2014年11月21日的美国临时申请号62/082,830的优先权。
相关申请的交叉引用
本申请要求在2014年11月21日提交的申请号为62/082,830，名称为“biomoleculeextractionsystem”的美国临时申请的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本文。
背景技术：
从用于测试的生物样本中收集、提取和检测核酸的现有系统和方法通常比较复杂，需要经过专业培训的人员实施多个步骤，并且没有针对处理大体积样本而进行优化，也没有针对防止样本处理和稳定运输中的交叉污染而进行优化。
各种体液，例如血液、血浆、血清、脑脊液(csf)、胸腔积液、腹水、尿液等都含有短链核酸(na)片段，即，无细胞核酸(cfna)或循环核酸(cna)。内源性地源自于肿瘤或者“外源性地”源自于胎儿或者体内病原性感染的改变的核酸可以以非常低的浓度作为外周血液中的cfna存在，并且是可检测的，并且可以与正常的宿主cfna区分开。从血浆或血清中提取足量的这些cfna用于测试需要处理相对较大体积的流体，这在临床诊断环境中提出了不可避免的技术挑战。因此，在该领域需要新的方法来应对这些挑战。
用于检测例如结核病的示例性的这类方法在pct公开申请wo2012135815(也由本申请的发明人发明)中进行了描述，并且通过引用并入本文。然而，这样的测试可能在世界上缺乏分析样本中所使用的昂贵处理设备的地区是最有用的。因此，在本领域中需要一种收集系统和方法，其将允许从大体积的生物样本中捕获足量的核酸，以进行后续分析、以防止来自环境和操作员的污染、以及保存和运送核酸，使得可以使用相对便宜的设备在定点照护设施处收集核酸，然后以稳定的形式运送到中心地点进行进一步的处理和测定。
适用于从大体积生物流体中分离循环dna或rna的各种提取方法是已知的，例如在“
另外，第7,897,378和8,158,349号美国专利描述了用于从较大样本体积中纯化或分离核酸的装置和方法，包括系统，所述系统包含一对协作的中空体，样本穿过所述中空体进入收集容器，使核酸结合到所述中空体之一内的结合材料。将含有保留样本的中空体转移到第一接收容器中进行洗涤，然后将纯化或分离的核酸洗脱并收集在第二接收容器中用于进一步分析。也需要用高速离心机从固相基质中洗脱结合的核酸。
例如，通过引用并入本文的第5,234,809号美国专利(boom)公开了一种分离核酸的方法，其适用于多种不同用途。它描述了通过将含核酸的起始材料、离液缓冲液、以及结合dna的固相一起孵育来从所述起始材料中分离核酸的方法。如果需要，所述离液缓冲液影响所述起始材料的裂解和所述核酸与固相的结合。
本申请人的序列号为61/827,244的美国临时专利申请和序列号为us14/39,320的pct申请(“原始申请”)首次描述了新的生物分子提取系统，上述两篇专利申请的全部内容通过引用并入本文。所述原始申请公开了涉及用于处理生物样本的方法和系统的发明，即裂解、结合、洗涤、稳定和洗脱生物样本的生物分子。一种实施方式包括用于收集核酸样本的系统，所述系统包括限定内部容积的容器、用于所述容器的可移除盖、与所述盖中的样本连接端口流体连通的连接接口、适于可移除地附接到所述容器盖的连接接口的过滤柱、样本收集容器、以及运输容器。公开了该系统的各种其它部件。所述原始申请还公开了收集核酸样本的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供本文所述的收集系统；(b)在所述样本收集容器中收集一定体积的含样本的流体；(c)通过所述样本连接端口将所述样本收集容器连接到所述容器；(d)使所述样本收集容器中的一定体积的含样本的流体穿过所述过滤柱，从而在所述基底上收集所述样本，并在所述容器中收集剩余物；(e)将所述运输容器的开口端套在所述过滤柱上，将所述过滤柱与所述运输容器接合，并且将所述过滤柱从所述容器盖上拆下，以及(f)用所述可拆卸盖临时密封所述运输容器。所公开的方法对于在最低配置的医疗设施(例如小型诊所、远程诊所和/或周边诊所)处理所收集的核酸特别有用，并将收集的样本运送到设备更好的中央实验室，以进一步分析所收集的样本来检测疾病，例如检测潜伏性结核病。
随着分子技术的迅速发展，血浆、血清和其他体液中的循环无细胞核酸(na)的生物标志物检测作为较小侵入性的方法而变得新兴起来，所述循环无细胞核酸分别包括无细胞dna和无细胞rna(cfdna和cfrna)，或者一起的(cfna或cna)，所述的方法用于产前遗传异常、癌症、实体器官移植排斥反应和感染性疾病(如结核病)的早期发现的诊断和预后。然而，由于体液极不充裕，因此将cfna作为临床分析物仍然面临着各种技术问题，这些技术问题影响着cfna样本的质量、数量以及随之产生的最终诊断结果。所述技术问题包括：1)样本收集/运输，2)样本处理，和3)使用cfrna进行疾病状态监测的潜在机会。
样本收集/运输问题
cfna的大多数可获得的来源是外周血液中的血浆或血清(合称为ps)。正常个体中cfna的血浆浓度非常低，在1.8-44ng/ml或约500-10000个基因组当量/ml(ge/ml)的范围内。如果存在的话，ps中痕量的肿瘤衍生的cfna或循环肿瘤na(ctna)可能仅为每ml一至几百个拷贝，或总cfna(4)的约0.005-0.01％。为了收集足够的目标ctna，通常需要大量的ps，即1-5ml。此外，即使从血液中释放小百分比的细胞dna或rna也会导致目标cfna的下游分析困难。为了防止血细胞中的cfna降解和基因组na(gna)释放，根据不同的方案，通常应在静脉注射后2小时、2-4小时或7小时内分离ps与血细胞。分离通常需要1步或2步，在1000-2000g离心10分钟，并且可选地5000-16000g。在血液凝固后通过简单离心分离血清可能更容易，但是可能由于凝血引起可预测程度的细胞裂解，这可能不会显著影响最终分析。虽然血浆和血清中目标ctdna的浓度大致相同，但注意到血清含有更多的大的gdna片段，可能是在凝血过程中从血细胞释放出来的。
样本收集的另一个问题是温度。从血细胞分离后的ps通常需要在-20℃(短时间)或-80℃(长时间)下储存。样本收集站点，例如静脉切开术站点，并不总是靠近分子诊断设施。因此，在运输期间通常需要保持冷冻的ps低温贮藏。斯特雷克公司(ne)开发了新型的采血装置，cell-freednabcttm(bct)和cell-freernabct。它们防止细胞dna和rna释放，并在环境温度下稳定血液中的cfdna和cfrna，分别持续长达7天和2天。bct技术部分解决了分离延迟和运输条件的问题。然而，如下所述，它仍然面临着在分子诊断设备中进行样本处理的障碍。
样本处理问题
cfna测试的临床应用也受到样本处理的影响，即，从大量相同流体中有效提取、富集和回收痕量的脆性cfna。通常基于两种方法从生物材料中提取和纯化核酸：有机萃取和固相吸附。有机萃取，即，硫氰酸胍-苯酚/氯仿法，适用于大体积生物液体，如ps，但不适用于临床实验室，因为试剂的毒性和多次动手处理步骤。基于boom技术的固相萃取已逐渐发展成两种主要形式：柱(或旋转柱)和磁珠技术。基本原理是高度浓缩的离液剂破坏蛋白质和脂质复合物的二级结构和三级结构，使酶(包括dna和rna核酸酶)失活，并从结合的微结构中释放核酸(裂解)。将酒精加入到裂解物中有助于将游离核酸与吸附性基质结合(结合)。在柱(旋转柱)形式中，将结合裂解物的混合物加入到微量柱中，通过离心或真空流过多孔基质(即，二氧化硅膜)。混合物中的dna或rna被吸附在基质上，其余的(废物)被除去。然后，通常进行1-2个洗涤步骤以去除残留污染物(洗涤)。最后，结合的核酸从基质中释放并通过离心收集到新管中(洗脱)。不容易实现旋转柱操作的自动化；然而，(qiagen)最近开发了一种专门用于旋转柱的自动化仪器(qiacube)。用旋转柱处理样本通常需要，例如，用高速桌面型离心机重复离心四至五次。如果使用真空装置的话，离心可以减少到一个步骤(洗脱)，但是仍然需要多次移液。旋转柱通常设计用于处理小体积样本，通常<300μl。一种流行的试剂盒，
另一个专门为cfna提取而设计的试剂盒是qiagen的
二氧化硅涂覆的磁珠(mb)技术是基于相同的原理，并具有与上述相似的步骤。柱形式中的吸附剂被固定在柱上，与此不同的是，磁珠被分散至裂解物中并用磁场收集。由于自动化，mb处理操作相对容易。几个制造商提供了针对特定需求量身定制的多种模型，但是它们中的大多数样本体积容量限制为1毫升。
因此，仍然需要解决一个或多个上述问题的系统和方法，改进并提供在原始申请中描述的收集系统的替代性实施方式。
技术实现要素：
本发明的一个方面包括用于收集生物分子的系统。在一种实施方式中，所述系统包括：提取器组件，其包括顶盖、提取器芯、提取器芯适配器、具有内部容积的提取器主体、以及底盖环。所述顶盖适于用所述底盖环可拆卸地固定到所述提取器主体上，所述顶盖具有内侧和外侧，所述内侧面向所述提取器主体的内部容积，所述外侧背对所述提取器主体。所述顶盖包括在所述内侧和外侧之间连通的样本连接端口，所述盖在所述内侧和外侧之间没有其他的连通孔。所述样本连接端口包括用于将其可释放地锁定到协作的第二互锁部件的第一互锁部件。所述盖的内侧包括与所述样本连接端口流体连通的连接接口。所述提取器芯适于可移除地附接到所述顶盖的所述连接接口，并且具有敞开的上游端、敞开的下游端以及位于其间的内部通道，所述内部通道容纳用于收集所述生物分子的基底。所述提取器主体具有第一开口端和第二端，所述第一开口端构造成与所述顶盖配合，所述第二端包括构造成接纳所述提取器芯适配器的开口。所述提取器芯适配器具有上游开口端、下游突起、下游开口端以及所述上游开口端和所述下游开口端之间的内部通道，所述上游开口端用于与所述提取器芯的下游端配合，所述下游突起构造成突出穿过所述提取器主体中的开口。
所述系统还可以包括注射器和限定适于容纳所述提取器芯的体积的运输容器，所述注射器包括第二互锁部件，所述第二互锁部件适于连接到所述顶盖中的样本连接端口的第一互锁部件。所述运输容器适于可释放地接合所述提取器芯以使其从所述顶盖的连接接口分离，所述运输容器还包括用于将提取器芯暂时密封在该运输容器内的可拆卸盖。
所述收集系统还可以包含一个或多个样本处理试剂缓冲液，例如裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，或废物收集容器，这些容器中的一个或多个包括具有可膨胀体积的柔性容器。例如，柔性容器可以是塑料袋，其可以进一步具有整合到所述袋中的一个或多个刚性加强件，以给所述袋提供结构强度，例如提供足够的结构以使柔性容器在充满或部分填充液体时保持在竖直位置的刚性加强件。特别地，一个或多个所述柔性容器可以包括样本处理容器，所述样本处理容器具有密封盖和盖中的开口，所述开口的尺寸被设置成接收穿过所述密封盖插入且与所述柔性容器的内侧流体连通的一段长度的管子。所述穿过柔性容器的密封盖插入的一段长度的管子可以具有第一端和第二端，所述第一端设置在所述柔性容器的内部，所述第二端包括第一互锁部件，所述第一互锁部件适于连接到所述注射器的所述第二互锁部件。所述密封盖中的开口可以进一步设计成接收所述提取器适配器的下游端。
所述收集系统可进一步包括驱避剂。从多孔基底中洗脱被吸附的核酸的现有技术程序需要首先在所述基底上加入少量的洗脱缓冲液以从所述基底释放结合的核酸，然后再通过高速离心或空气吹扫来收集所述洗脱液。高速离心需要昂贵的离心机和电力供应。空气吹扫可能会导致样本显著损失。一种方法包括首先在所述基底上加入洗脱缓冲液，然后将疏水性驱避剂注射到所述提取器芯中，这种方法导致大部分释放的核酸的水性的洗脱缓冲液从多孔基底中排出，从而使其容易收集。
本发明的另一方面包括收集生物分子样本的方法。所述方法包括以下步骤：提供如本文所讨论的用于收集生物分子的所述系统，然后在所述注射器中收集一定体积的含样本的液体，通过所述样本连接端口将所述注射器连接到所述提取器组件，并将所述提取器适配器的下游端连接到所述样本处理容器的密封盖，并将来自所述注射器的含有样本的液体的体积穿过所述提取器芯，从而在所述基底上收集所述样本，并在所述样本处理容器中收集提示物。使来自所述注射器的含样本液体的体积穿过所述提取器芯的步骤可选地重复一次或多次，并且该方法还可以包括可选地实施一次或多次洗涤步骤。所述方法可以进一步包括以下步骤：在提取器芯的基底上收集样本之后，通过驱避剂洗脱再水化的样本；或将所述运输容器的开口端套在所述提取器芯上，将所述提取器芯与所述运输容器接合，并将所述提取器芯从所述顶盖分离，并用所述可拆卸盖临时密封所述运输容器。因此，该系统可以消除对用于样本处理的特殊设备和电力的需要，使其更适合在农村或远程护理点(poc)设置中使用。然后，所述运输容器可以在周围无气候控制的条件下运输，此后该方法还可以包括处理收集在所述提取器芯中的生物分子，以检测疾病或感染性病原体，例如深层感染，例如，结核病，特别是潜伏性结核病。
附图说明
图1a示出了示例性容器盖的透视侧视图。
图1b示出了图1a的示例性容器盖的横截面图。
图2示出了示例性过滤柱。
图3示出了图2的示例性过滤柱/提取器芯的横截面。
图4是展示了图2的过滤柱和图1a-1b的容器盖如何彼此连接的分解图，其与图9a-9b的提取器芯和图8a-8c的顶盖的连接相同。
图5示出了附接到示例性容器的、图1a-1b的容器盖。
图6a示出了新实施方式的示例性运输容器底部部分。
图6b示出了图6a的示例性运输容器如何套在示例性过滤柱或提取器芯上，以使其从示例性容器盖或顶盖旋出。
图6c是示例性运输容器顶部的横截面图。
图6d是被图6c的示例性运输容器顶部密封的、图6a的示例性运输容器底部部分的横截面图。
图6e是图6d的密封运输容器的立体图。
图7a示出了在示例性提取系统中使用的示例性注射器。
图7b示出了在示例性提取系统中使用的示例性提取器组件。
图7c和7d分别示出了用于示例性提取系统的示例性样本处理/含有试剂的塑料袋的透视俯视图和纵向剖视图。
图8a-8c分别示出了示例性提取器组件的示例性顶盖的透视俯视图、侧视图和透视仰视图。
图9a-9c分别示出了示例性提取器芯的透视俯视图、纵向剖视图和透视仰视图。
图10a-10c分别示出了示例性提取器芯适配器的透视俯视图、侧视图和透视仰视图。
图11a-11c分别示出了示例性提取器主体的透视俯视图、侧视图和透视仰视图。
图12a-12c分别示出了示例性底盖环的透视俯视图、纵向剖视图和透视仰视图。
具体实施方式
原始申请中所公开的系统
在原始申请中描述的示例性系统包括容器，例如图5的容器400，其定义了内部容积。虽然以示例性几何形式示出，本发明不限于容器的任何特定尺寸和形状。如本文稍后讨论的，在一个改进的实施方式中，所述容器可以包括柔性袋700，如图7c和7d所示。在原始申请中描述的实施方式具有可移除盖101，例如图1a-1b所示的示例性实施方式，其具有面向所述容器的内部容积的内侧107和背对内部容积的外侧102。图1a示出了所述盖的外侧。所述盖具有通过通道连通所述内侧和外侧的通气端口105，例如公鲁尔滑动连接，以及通过通道连通所述内侧和外侧的样本连接端口103。在与本文稍后讨论的原始申请的系统的改进相比，顶盖900基本上与顶盖101相同，但没有通气端口105。所述样本连接端口包括第一互锁部件，例如鲁尔锁连接件120，用于将所述样本连接端口可释放地锁定到诸如注射器的样本转移容器(未示出)的协作的第二互锁部件。端口103和105都可以通过鲁尔适配盖或插头(未示出)容易地打开或关闭。当向连接到端口103的注射器的柱塞施加向下的压力以迫使液体移动时，打开端口105以允许移动的空气离开容器400。当使用真空来强制来自连接的源头(其仍然可能是注射器)的液体移动时，所述端口105连接到真空源。所述盖的内侧包括与所述样本连接端口103流体连通的连接接口108。虽然在所述盖和容器之间可以使用任何连接方式，但是所述盖可以带有阴螺纹110，用于螺纹连接到具有阳螺纹(未示出)的容器上。如将在下文中讨论的那样，所述系统的改进使用具有可膨胀体积的柔性容器7c和7d，而不是刚性的不可膨胀容器400，这样消除了对通气端口105的需要。
内部具有固相萃取基质(例如硅胶膜、烧结多孔玻璃粉(glassfrit)或玻璃纤维滤纸)的过滤柱，例如图2和3所示的示例性过滤柱200，适于可移除地附接到所述容器盖的连接接口。例如，如图1b所示，所述连接接口108可以具有与过滤柱200上的阳螺纹220配合的阴螺纹109。所述过滤柱具有开口端202和204，以及其间的内部通道206，其内部包含用于收集核酸的基底212。所述过滤柱也可以称为“中空体”，因为它被设计成使流体通过，而不会使流体以保留在容器中的方式留在过滤柱中。所述过滤柱基底212可以邻近多孔过滤器214，并且保持环210可以产生紧贴所述柱的内部的摩擦接合，以将基底和过滤器保持在与过滤柱的颈部相邻的位置。至少就与所述顶盖的连接接口配合的阳螺纹和相对于所述基底、过滤器和保持环而言，后面将要详细描述的提取器芯300可以基本上与过滤柱200相同。
基底212可以包括柱结合基质，所述基质包含允许流体穿过所述基质的固体基质。在某些方面，所述基质是高度多孔的，以便使暴露于缓冲溶液的表面积最大化，从而使所述基质的结合能力最大化。所述基质可以由各种材料制成。在某些具体实施方式中，所述结合基质可以是二氧化硅材料(主要由sio2形成)，例如玻璃纤维、二氧化硅珠、硅胶、烧结多孔玻璃粉等。已知许多商业提供者的二氧化硅基质，例如，例如，由whatman(nj)生产的gf/a、gf/b、gf/c、gf/d和gf/f玻璃纤维过滤器。这种过滤器已知特别用于核酸分子的纯化。在其它实施方式中，可以应用各种固体基质，例如适于某些生物分子的提取和分离的离子交换基质、亲和力基质和表面改性的基质。所述结合基质可以是被核酸结合材料的颗粒或纤维嵌入的任何材料。所述基质材料通常对液体而言是可渗透的，使得样本可以通过所述基质，核酸与核酸结合材料接触并结合核酸结合材料，样本的其它组分可以离开所述基质。所述结合基质可以包括本领域已知的任何支撑材料，包括选自下组的材料：硅质材料、硅胶、玻璃、沸石、氧化铝、二氧化钛、二氧化锆、高岭土、凝胶状二氧化硅、磁性颗粒、烧结多孔玻璃粉、以及陶瓷或聚合物支撑材料。所述核酸结合材料可以是核酸在某些条件下结合(通常非共价)的任何材料，而样本中的其它物质在这些条件下不结合。核酸结合通常是可逆的，使得核酸可以随后通过改变条件从材料中再次洗脱。
在一个实施方式中，柱200的几何形状可以与可由bocascientific(fl)获得的mobicol柱类似，或者可以是其特别修改或特别制造的版本。具有这种几何形状的设计可以在微量离心机中离心，并允许用注射器容易地处理大体积的样本。多孔过滤器214可以包括孔径为10-90μm的惰性塑料。固体提取基质(基底)可以包括gf/d过滤纸(whatman，nj)，例如通过将过滤纸冲压成适合于所述柱的内部直径的片制成。可以将两层或多层过滤片放在过滤器的顶部。可以在过滤片的顶部放置支撑环(ring-store，wa)(如图2所示)，例如由ptfe(例如
开启器和运输容器，例如图6e中的完全组装构造中所描绘的示例性容器650，包括保护容器600和适配的盖610。所述相配合的底部部分和顶部部分限定了适于容纳用于运输的过滤柱的体积。运输容器的保护容器600具有敞开的顶部，并且适于可释放地接合所述过滤柱，以将其从容器盖的连接接口上拆下。例如，过滤柱可以具有图2所示的突片222或图6b所示的凸片362，或提取器芯300可以具有如图9c所示的突片360，其中任一个被配置为与图6a的槽602接合。所述封闭的运输容器与周围环境隔绝，以防止可能导致核酸(特别是rna)加速降解(水解)的污染和水分。所述封闭的运输容器可以进一步包括预先包装的干燥剂，例如颗粒状或串珠形状的硅胶，以产生或维持其内的干燥(脱水)状态，例如在图6c和6d的容器的上部中所示的干燥剂612。干燥剂的位置也可以在容器的下部，并且不限于任何特定的位置或构型。干燥剂可以包括本领域已知的用于提供和维持干燥的任何合适的材料，例如但不限于蒙脱石粘土、氯化锂、活性氧化铝、碱铝硅酸盐、dq11块状硅胶、硅胶、分子筛、硫酸钙、或氧化钙。干燥剂可含有水分指示剂，当干燥剂从无水(干)转变为水合(湿)状态时，水分指示剂逐渐改变颜色，例如对于一些硅胶是已知的。
尽管用鲁尔锁定配件示出了从所述盖的外侧突出的样本连接端口，但是本发明不限于任何特定类型的互锁连接，也不限于样本连接端口的任何特定配置。尽管样本连接端口和样本容器之间的一些类型的锁定接合是优选的，但是可以提供任何类型的可逆锁定接合。所述样本转移容器未示出，但可以是具有配合的鲁尔锁配件的标准注射器。因此，在一个示例性方法中，注射器与容器盖互锁，并且在所述注射器的柱塞被压下以迫使包含核酸的溶液在存在诸如离液剂和酒精之类的结合试剂的情况下通过过滤柱。因此，核酸被保留在基底212上，同时滤液进入容器400。如上所述，在具有刚性容器400和通气端口105的实施方式中，注射器柱塞可以手动压下，端口105打开，或者真空源可以附接到端口105，使得当从注射器清空溶液时，真空使得注射器柱塞被压下。
离液剂在本领域中作为改变蛋白质或核酸的二级、三级和/或四级结构但至少不影响其一级结构的物质是众所周知的。实例是硫氰酸胍、盐酸胍、nai、ki、硫氰酸钠或这些物质的组合。离液剂会扰乱液态水的有序结构，使dna或rna从该水溶液与玻璃表面结合。在某些条件下，加入醇，如乙醇或异丙醇，可促进na与表面结合。如nacl、kcl或cacl2的物质可能存在于溶液中，以便改变离子强度。dna和rna可以在离液条件下结合到玻璃表面的性质被用来将它们从含有其他生物材料的溶液中分离出来。在结合步骤之后，可以应用洗涤和清洁缓冲液来除去污染物。与玻璃表面的结合是可逆的，例如，如果离液剂的浓度降低或完全除去离液剂，则可以再次洗脱dna或rna。洗脱缓冲液可以是纯的、不含dnase/rnase的水，或含有低浓度tris(羟甲基)-氨基甲烷和edta(乙二胺四乙酸)(通常分别为5-10mm和50-100μm)的缓冲液。通常，洗脱缓冲液(eb)的体积在50-200μl的范围内。
现有技术方法通常使用高速离心从过滤柱收集洗脱液。为了尽可能多地从多孔基质中回收洗脱液，通常需要高速离心机，即相对离心力(rcf)>10,000g。或者，在一些情况下也可以采用重复的空气吹扫，但只有一部分水溶液被回收。在本发明的收集方法的一种实施方式中，采用疏水性驱避剂来手动收集洗脱液，而不需要电力和设备。合适的疏水性驱避剂优选具有以下特征：高疏水性、低粘度、低于特定密度(即<1，低于水的密度)、低表面张力和高铺展性、与水相不混溶、不挥发、与普通塑料(或至少与本文所述系统中使用的塑料)相容、化学惰性并且无毒。令人惊讶的是，已经发现了一组聚二甲基硅氧烷(pdms、硅油或硅液)可以满足所有这些要求。聚二甲基硅氧烷的粘度取决于其聚合度，即，聚合度越低，粘度越低。pdms是极好的驱避剂。
在一种示例性方法中，当组装和连接如图4所示的盖101和过滤柱200时，或者组装如图7b所示的提取器组件10的适配器410、提取器主体500、顶盖900和底盖环800时，样本收集后，通过端口103将少量的洗脱缓冲液(例如50-200μl)加到多孔基底上，水性eb被快速吸附到多孔基质中。之后，通过紧密连接到端口103的注射器垂直注入一定体积的pdms，例如0.2至1ml。疏水pdms具有比水性eb更小的密度。因此，在缓慢注射的过程中，包括附着于多孔基质表面的痕量水性eb在内的水性eb被pdms置换，并通过重力从出口204洗出。此外，可以将针附接到出口204，从而可以更精确地收集洗脱液。由于疏水性pdms的表面张力非常低，疏水性pdms可以迫使水性洗脱液在收集管的底部形成单个片段，其与pdms的上层由清楚的边界分开。合适的低粘度pdms包括由clearcoproductsco.，inc.(pa)公司提供的psf-5、10和20cst纯硅油(puresiliconefluids)。
所述原始申请公开了还包括真空室(未示出)的收集系统实施方式。这里描述的新实施方式的改进避免了对顶盖上的真空室和通气端口的需要，从而使处理样本所需的设备的总量最小化。
新实施方式附加详情
本发明的示例性生物分子提取器用于从含有生物分子，特别是大分子如核酸、蛋白质脂质、多糖的大体积流体中浓缩和提取生物分子。所述提取基于固相萃取(spe)。通常，spe包括具有目标生物分子的移动系统(液相)和包含表面的固定相(固相)，所述表面包含与目标分子具有高亲和力的官能团。在典型的方法中，由正压或负压或简单地通过重力驱动的液相穿过多孔固体基质，所述多孔固体基质包含具有官能团的表面，并且目标生物分子通常可逆地吸附或结合官能团，并在随后的步骤中从基质中洗脱出来。
示例性的提取器装置系统具有以下特征：1)基本上无污染的封闭系统；2)配置为便携且手动处理的提取操作，包括无仪器无电力操作的能力；3)配置为允许处理大体积的(例如1-5ml)生物流体，使得血浆、血清和其他体液中的低丰度分子浓缩高达100倍，所述低丰度分子为，例如，肿瘤的片段dna和rna的无细胞循环核酸、诸如tb(结核杆菌)的病原体、和胎儿dna；4)配置为使分子(例如核酸，特别是rna物质)稳定，以使得样本在周围环境条件下运输；5)配置为在不离心的情况下洗脱所提取的核酸；6)配置为在设备中进行样本的无病原体处理，来为下游应用准备样本，在核酸的情况下，例如为pcr、定量pcr(qpcr)、数字pcr(dpcr)、微阵列和下一代测序(ngs)准备样本。
如图7a-7d所示的示例性提取系统包括提取器组件10(图7b)(优选塑料)、一组多个样本处理/含有试剂的袋子(图7c，7d)(优选塑料)、以及用于所述提取器芯的分离和运输的保护容器(图6a-6e，如上面所详细讨论的)。该系统还适用于与用于其操作的一个或多个注射器一起使用，或可包括用于其操作的一个或多个注射器(图7a)。
所述示例性提取器组件10具有五个部件：(1)顶盖900(图8a-8c)；(2)提取器芯300(图9a-9c)(与原始申请的公开内容中提及的“过滤柱”基本相同)；(3)从所述提取器芯延伸的提取器芯适配器410(图10a-10c)；(4)提取器主体500(图11a-11c)；和(5)底盖环800(图12a-12c)。所述顶盖，如图8a-8c所示，在其外部顶部的端口970上具有锁连接器902(诸如母鲁尔锁连接器)，其适于连接到塑料的一次性注射器。所述顶盖900进一步构造成在设置在顶盖内侧的提取器芯接收构件910上可拆卸地接收提取器芯300(例如用螺钉连接)。除了顶盖900没有通气端口，所述顶盖900基本上与图1a-1b所示的以及原始申请中描述的可拆卸盖101相同，并且盖中除了端口970之外没有提供连通所述盖的内表面和外表面之间的其它开口。因此，除了没有通气端口105，所述顶盖900纵向截面与图1b中的盖101大致相同。
如图9a-9c所示的提取器芯具有两个连接器：用于连接到顶盖900的接收构件910的上游连接器310，使得所述提取器芯与由顶盖上的端口970限定的通道流体连通；以及下游连接器320(例如鲁尔滑动公连接器)，其被配置为连接到所述适配器410。所述提取器芯300在其内部包括固定的多孔固体吸附性基质340。如图9b所示，在一种实施方式中，支撑环330将吸附性基质340设置在多孔过滤器350的顶部上。所述提取器芯的外表面具有一个或多个构件，例如突片360和插入突片之间的槽364，用于相配合的一组突片和槽，以提供用于接收扭矩的机构，施加扭矩以旋转提取器芯300，将其与顶盖900中的接收构件910分离。例如，如图6a和6b所示的示意性实施方式所示，保护容器600具有单个槽602，用于接收提取器芯300上的凸片362。应当理解，与单个突片和匹配的槽不同的是，每个保护容器600和提取器芯300中都可以具有多个互相啮合的突片和槽，其设计成啮合在一起，例如图9a和图9c所示的多个均匀间隔的突片360。
所述适配器410，如图10a-10c所示，适于在其上游连接器(例如鲁尔滑动母连接器420)附接到提取器芯的下游连接器320时作为提取器芯的延伸部进行操作。所述适配器还包括延伸的下游端430，例如延伸的鲁尔锁母连接器，其远离提取器主体延伸。所述提取器主体500，如图11a-11c所示，是管状容器。当提取器芯300牢固地附接到顶盖900的接收构件910时，其中适配器410连接到提取器300的下游连接器320，组装的组件被配置成插入提取器主体500并与提取器主体500配合，如图7b所示，适配器延伸的下游端430(即鲁尔锁母端)延伸穿过提取器主体的底孔530，使得下游端430延伸到提取器主体500的外部。所述提取器主体的内底部具有圆形脊540，其与所述适配器底部上的圆形脊440配合。
替代地，通过较小的修改，鲁尔锁公连接器可以代替适配器410的母鲁尔锁端。本发明不限于鲁尔锁连接器，也不限于所指示的位置中的公或母连接器。在每种情况下，可以使用其他类型的连接器，并且本领域技术人员可以理解，可以以较小的修改将公连接器和母连接器彼此替代。在一些实施方式中，提取器主体底部的内部圆形脊和适配器底部的圆形脊可以具有一个或多个构件，例如配合凸缘，凹部和/或突片，彼此相对，防止当接合时适配器相对于提取器主体的旋转运动(图10a-10c或11a-11c中未示出)。在提取器主体的外壁上，如下面进一步描述的，圆形脊部550可用作接合提取器主体与顶盖和底盖环的止挡件。所述底盖环，如图12a-12c所示，包括在其内壁上的内螺纹接头，并且适于从底部通过提取器主体，以使提取器主体的外壁上的脊部550与所述盖环800的内表面850接合，并且使顶盖的阳螺杆螺纹960与其阴螺纹配件860接合，以便当如本文所述的整个组件牢固地连接在一起并且正在进行时，最小化或消除液体泄漏。
如图7c和7d所示，可以进一步提供一组样本处理容器/试剂容器/废物收集容器。所述袋子包含不同的试剂，例如裂解缓冲液(lb)、结合缓冲液(bb)、洗涤缓冲液(wb)、清洁缓冲液(cb)、洗脱缓冲液(eb)和本文进一步描述的驱避液(rf)。所述容器的容量可以从50ml到2ml变化，这取决于操作所需的试剂的量。所述容器通常是柔性的，例如由聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚氯乙烯(pvc)和/或乙酸乙烯酯(eva)制成的袋。代表性的试剂/样本处理容器由lb袋(图7c和7d)举例说明。所述lb袋具有约50ml容量并且具有圆柱形形状。所述袋的内壁包含四个刚性脊706，这有助于提供更多的结构来使得柔性袋能够在处理样本时保持在直立位置。该示例性袋具有圆形密封盖702以及所述盖上的管道沟704，使得管道708可以插入以与所述袋的内部流体连通。所述管道的另一端可以包括可直接连接到注射器(例如鲁尔锁注射器)的接头(未示出)，例如鲁尔锁母连接器，以通过注射器注射接收液体样本，例如血浆、血清、或其他生物流体。所述lb袋包含预加载的裂解缓冲液。所述生物流体与袋中的裂解缓冲液混合，并且还可以在水浴或加热块中孵育以加速从其它生物复合物释放核酸。所述lb袋的圆环形状适于装配在通常使用的50ml离心管架或加热块中。完成裂解处理后，将结合缓冲液从bb袋转移至lb袋，通过用注射器从bb袋中抽出并注射到lb袋中。在通过重复注射器从lb袋抽出再注射入lb袋的混合后，将裂解物和结合缓冲液的混合物吸入注射器中，然后将注射器连接到提取器组件10的顶盖900顶部的端口970上的(例如鲁尔锁母)锁连接器902上，然后提取器组件底部的鲁尔锁母连接器(即，适配器410的下游连接器470)，例如通过鲁尔锁公-公适配器(未显示)，被连接到lb袋。通过按压注射器柱塞，将混合物注入提取器中，穿过固体吸附性基质，任何未被捕获的液体流回lb袋中。在这些情况下，目标分子片段短的dna或rna被吸附在固体基质的表面上。
使用袋子或其他柔性容积的容器作为收集容器具有一些优点，包括在收集系统上使用非通气盖的能力。由于袋具有柔性容积，因此可以在袋中保留足够的容积以容纳有意引入注射器中的少量空气(例如1-5ml)，以跟随通过提取器的每一液体体积。这种少量的空气有助于在注射器中的液体首次排出之后从多孔基质中的残余液体中驱除空气。因此，所述收集袋或其他柔性容积的容器可以被设计成具有足够量的保留容积，以适应不仅在处理期间要添加到袋中的任何预期量的液体，而且还可以在整体处理过程中预期的注射器引导步骤期间引入任何预期量的额外空气数量。此外，柔性容积的容器使连接的注射器-提取器-容器系统成为可能，其中的三部分(注射器、提取器和柔性容积的容器)形成封闭连接，而不与周围环境相通。当注射器将液体推入或从柔性容器中吸入液体时，柔性容器的体积被改变，而不需要分配封闭系统外部的液体或空气或将外部空气吸入封闭系统。因此，与开放系统相比，该封闭系统布置更好地最小化或防止了污染。该系统还允许液体双向流动，因此提取过程可以重复多次以实现最大效率。
通过流速的控制以及通过反复抽吸和注射几次(2-10次)，所述目标分子有多次机会与吸附性基质相互作用，从而将短核酸从大体积的裂解物中的回收最大化。在完成提取过程之后，将lb袋从提取器组件(例如从可选的鲁尔锁公-公适配器)上分离出来。所述提取器组件上的适配器依次连接到洗涤缓冲液袋和清洁缓冲液袋，重复用较小的新的注射器抽吸和注射(洗涤和清洁缓冲液的体积比样本和结合-裂解缓冲液混合物的体积小很多，大约几毫升)。再次，重复地抽吸和注入洗涤缓冲液和清洁缓冲液使其通过提取器可以帮助更有效地从吸附性基质中去除污染物，以使这些各种污染物显著影响下游应用的可能性最小化。
在完成提取、洗涤和清洁之后，可以通过以下步骤从提取器组件移除提取器芯：(1)使鲁尔锁公-公适配器与从提取器组件10突起的下游连接器470分离；(2)拧下底盖环800；(3)从提取器主体500上取下顶盖900；(4a)利用保护容器600将提取器芯300从顶盖900的接收构件910上分离，并用盖610密封所述保护容器(如在原始申请中更详细地描述的)；(4b)替代地，通过吸移加入洗脱缓冲液，然后通过顶盖900的入口注射驱避液(rf)以立即洗脱。因此，提取器芯(其吸附性基质上有经提取的核酸)已准备好在下游设施中立即进行洗脱步骤，或者被储存或在周围环境下运输。
如本文所述的包括用驱避剂处理的方法可以用于从任何类型的过滤或收集系统中的任何类型的基底中回收生物分子，不限于本文所述的系统，尽管应该理解该方法可以特别适用于本文描述的任何系统，包括在原始申请以及新实施方式中公开的系统。
所述提取器芯可以优选地配置成适应常用的96孔形式，使得洗脱步骤可以在高通量处理中完成。
所述提取器芯包含塑料的多孔过滤器、吸附性基质层和塑料的支撑环，或另一塑料多孔过滤器。塑料过滤器和塑料支撑环用于将吸附性基质固定到其提取器芯中的位置，并允许液体流过吸附性基质，如关于在原始申请中公开的系统所进一步描述的。
此外，对于过滤部件和与容器盖101/顶盖900接合的上部，提取器芯300与过滤柱200基本上相同，但是提取器芯具有下游连接器320，下游连接器320比过滤柱200的开口端204长，并且提取器芯300整体尺寸设置成适于装配在提取器组件主体500内并与适配器410相接合。而内部过滤器部件位于过滤柱200的下游端附近，内部过滤器部件沿纵向大致位于提取器芯300的中间位置，以便为细长的下游连接器提供空间，用于与适配器410和适配器410的下游端430相接触以突起而穿过提取器主体500中的底孔530。但是，所述提取器芯和过滤柱不限于任何特定的尺寸、形状或其他几何形状。
对于本文所描述的所有部件，应当理解，为了强调，仅在某些图中仅描绘了诸如锁定配件或螺纹之类的接口特征，为了简单起见，可以不在其他部分中描述。此外，尽管这里相对于某些组件描述了某些示例性的接口特征，但是应当理解，本发明不限于所讨论的特定接口特征类型，也不限于相对于接口特征的存在或不存在具体组件。因此，具有所描绘的特定接口特征的部件可以被提供有其他类型的接口特征或根本没有接口特征，而没有接口特征的其它部件可以具有本领域已知的任何类型的接口特征。
附加特点
吸附性基质
已经考虑并测试了吸附性材料和孔径对流速的影响。有几种吸附性基质可用，包括二氧化硅膜、玻璃纤维纸和烧结多孔玻璃粉。通常，这些二氧化硅材料的较大表面积提供足够的结合(吸附)位点(高达100μgna)。少量的cfna(通常小于100μg)不太可能使结合表面饱和；然而，结合表面可能对cfna的吸附速率有影响，导致未完全提取或不允许的流速或甚至高压。吸附性基质的孔径增加与表面积呈负相关，与流速呈正相关。具有10-50μm孔径的多孔玻璃粉提供良好的流体流动以及与短核酸的牢固结合。它的快速流速允许样本重复通过，从而显著提高提取效率。此外，吸附剂表面的预处理可以增强cfna的提取。
尺寸选择性提取
众所周知，来源于肿瘤或起源于胎儿的cfdna通常比来自正常组织和母体起源的cfdna更加碎片化，即更短。在样本收集、储存/运输和处理过程中从血细胞释放的基因组dna显著影响cfdna群体，从而影响目标cfna的检测灵敏度。然而，在进行cfna提取之前，从体液中选择性去除长的dna也是可能的。通过使用弱阴离子交换磁珠，成功从尿液中除去长的dna(>1000bp)，这显著增加了最终提取物中片段化的cfdna部分。其他人也报告了用阴离子交换基质从血液中提取gdna。因此，本文所述的含有阴离子交换基质的另外的提取器可用于在某些相容条件下在提取cfna之前去除大部分长的dna。功能性阴离子交换基质，例如在市场上有羧化或deae缀合的珠粒、树脂和/或滤纸可用于进行该步骤。
因此，额外的提取器可以由不同的基质和不同的试剂系统制成。例如，为了从体液中除去大尺寸的细胞dna，可以参照图9a-9c按照如下步骤来构建阴离子交换提取器：将塑料多孔过滤器350放入提取器芯300中后，将200μl缓冲液悬浮液(50％)中的deaesephadexa-50珠(gehealthcarelifescience)装载在第一过滤器上代替吸附性基质340，并且将第二过滤器放置在deaesephadex珠层的顶部以代替环330，从而将所述珠固定在两个过滤器之间。如前所述组装提取系统的其余部件。优选地，首先将ph缓冲液和盐加入到体液裂解物中，以建立所需的ph和盐条件(本领域已知)，在该条件下，裂解物中的大dna将紧密结合所述珠，但小dna不会。因此，通过如上所述提取器并且被收集到收集袋中的流体将比在这种提取之前具有更少的大尺寸细胞dna分子。在收集袋中，然后将流体与另外的结合缓冲液混合，并通过如上所述具有二氧化硅基质的第二提取器。现在结合缓冲液为小dna提供了条件。因此，用于这种方法的合适的试剂盒可以包括第一提取器和第二提取器，所述第一提取器配置有用于去除大尺寸细胞dna的第一基质，所述第二提取器配置有用于保留运输和分析所需的生物分子样本的第二基质。
样本收集
与原始申请中描述的裂解容器一致，通常，lb袋可以含有预先配制的裂解试剂，其可以包括例如至少：非离子洗涤剂(例如，tritonx-100或bj58)、或非离子洗涤剂与阴离子洗涤剂的组合物(例如，月桂酰肌氨酸钠)、蛋白酶(例如，蛋白酶k)、盐或离液剂(例如，氯化锂、胍、胍氰胺、尿素)、还原剂(例如，二硫苏糖醇(dtt))、螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(edta))、以及缓冲剂(例如，三(羟甲基)氨基甲烷(tris))。众所周知，胍和硫氰酸胍在摩尔浓度下具有较强的dnase和rnase抑制活性。所述裂解试剂可以在溶液中，或以干燥形式(脱水的)存在，例如通过在裂解容器内使用冻干法(冷冻干燥)或喷涂。
以水性流体形式存在的样本，例如血液、血浆、血清、痰液、唾液、尿液、脑脊液(csf)、胸腔积液、腹膜液、滑膜液等，可直接或与额外的水一起添加到所述lb中。当将水性流体加入到lb中时，所述样本流体与裂解溶液混合，或再水合干燥的裂解试剂，以形成完整的样本裂解缓冲液混合物。优选的样本是血浆或血清，并且所收集的血浆或血清的优选体积在1-20ml的范围内，更优选至少2ml，甚至更优选2-10ml，最优选2-5ml。
高粘度形式或半固体和固体形式的其它样本，例如脓液、细胞悬浮液和组织，可以与额外的水一起加入到lb中，所述水的量是再次水合干燥的溶解试剂需要的量，以保持所述样本体积与裂解溶液的最佳比例。
在优选的实施方式中，在提取之后，可以用本领域已知的任何方法，如上文和原始申请所述，通过洗涤和漂洗进一步处理收集的样本。
虽然在过滤柱上示出了具有一个突片和在该运输容器上的配合槽，但是也可以提供布置在过滤柱上的任何构件，所述构件适合于通过配置在运输容器上的配合的第二构件可释放地接合，并且能够传递足够的力至过滤柱以将其从与容器盖的螺纹连接中拧开。类似地，尽管示出了在过滤柱和容器盖之间的螺纹连接，但是可以使用任何类型的互锁连接，并且这种系统的各个元件可以利用运输容器和过滤柱之间的任何类型的配合，优选地，以无菌的方式，来将过滤柱从所述盖中取出。
所述过滤柱的尺寸可以设置成适合于用于接收多个过滤柱的样本保持器(未示出)，并且适于安装在离心机中以一次将多个过滤柱一起离心，例如但不限于达到适合半自动或全自动处理和操作的96孔形式的尺寸。
所述收集系统可以作为试剂盒的一部分出售，所述试剂盒包括进行特定类型的测试所需的一种或多种材料，例如但不限于以下：用于从患者中提取流体样本的装置(例如，用于抽取血液、血清、血浆或其他体液的针和注射器)，样本处理容器/试剂容器/废物收集容器，包括如本文进一步描述的含有试剂的容器(例如，裂解缓冲液(lb)、结合缓冲液(bb)、洗涤缓冲液(wb)、清洁缓冲液(cb)、洗脱缓冲液(eb)和驱避液(rf))，样本转移装置(例如，注射器)，如本文所述的提取器组件和运输容器。
在其它实施方式中，上述各种部件可以单独出售。理想情况下，对于大多数类型的测试，特别是对于本文所述的结核病检测方法，在从患者身上提取核酸直到所述核酸沉积在所述过滤柱中的基底上的时间内，所有接触样本或者接触含样本的液体的部分应该是无菌的或不被任何其他来源(例如来自操作员或来自周围环境)的核酸污染，并且不被普遍存在的迅速降解核酸的dnase和rnase污染。本文所讨论的各种容器、注射器和容器可以是实验室/保健领域中公知的标准组件。然而，具有连接的过滤柱的创新的容器盖，是专门用于所述特定的收集系统的。
因此，所述改进的另一方面可以包括用于容器的无菌可移除盖，所述盖具有面向容器的内部容积的内侧和与内侧相对的外侧，所述盖不包括连通内侧和外侧之间的通气端口，包括连接在内侧和外侧之间的样本连接端口，所述样本连接端口包括第一互锁部件，用于将所述样本连接端口与相配合的第二互锁部件可拆卸地锁定，所述盖的内部包括与所述样本连接端口流体连通的连接接口。所述可移除盖可以单独出售，或者在另一个实施方式中，与本文所讨论的无菌过滤柱一起可移除地附接到所述容器盖的连接接口。
本文描述的系统的所有部分可以通过本领域已知的任何方法制造，例如通过热塑性注射成型。优选的热塑性塑料包括聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，但是本发明不限于任何特定的材料或构造方法。
一种用于使用本文讨论的系统的示例性方法可以按如下执行。
(a)收集一定体积的含样本的液体，所述液体可以在lb袋中用裂解缓冲液和具有离液剂、盐、沉淀剂(例如醇)的结合缓冲液进行处理和孵育，以从生物样本中的复合物、细胞或其它颗粒中释放核酸，并使用注射器从所述lb袋中提取粗裂解物；
(b)将含有粗裂解物的注射器连接到提取器组件的上游端，并将lb袋连接到提取器组件的下游端；
(c)使所述注射器中的含样本的液体穿过所述提取器组件，从而从基底上的粗裂解物样本中收集核酸并在所述lb袋中收集提示物；
(d)用洗涤缓冲液洗涤所述柱中的与核酸结合的过滤基质；
(e)使一定体积的溶剂穿过所述柱，使与核酸结合的基质脱水(并且同时进一步洗涤和脱盐)，优选同时使用100％乙醇或丙酮；
(f)将运输容器底部部分套在过滤柱上，使过滤柱与运输容器接合，并且将过滤柱与容器盖分离；
(g)通过配合所述运输容器顶部和运输容器底部部分来临时密封所述运输容器，所述密封的运输容器优选地包含一袋吸湿剂(干燥剂)，例如，颗粒或珠粒硅胶。
(h)或者，不操作步骤(f)和(g)，不分离所述过滤柱，而是直接添加eb，然后用注射器通过顶盖900上的入口注射rf，以立即在另一个容器中收集洗脱液；
(i)运输洗脱液的容器进行处理，或立即进行处理。
与相对稳定的dna分子不同，rna分子更易于降解，因为rna中邻近磷酸二酯键的2'羟基而使得rna可以在碱和酶催化的水解中作为分子内亲核试剂。
洗涤步骤(d)可以包括通过使一个或多个体积的处理流体流过所述过滤柱来处理基底上收集的样本。例如，所述处理可以包括使用于运输的核酸样本稳定，例如用洗涤液(例如包含乙醇的流体)洗涤所述样本。在一个实施方式中，其中所述样本转移容器包括注射器，使所述液体通过所述过滤柱的方法包括手动地向注射器的柱塞施加压力。当准备下游核酸测定时，结合在所述过滤柱中的基底上的核酸被释放出来并从所述过滤柱中洗出，例如通过向所述过滤器(固体基质)中加入少量洗脱缓冲液或纯水而释放结合的核酸，并通过如本领域已知的施加空气压力或离心而将洗脱液收集在另一小容器中，或者更优选地通过向如本文所述的柱施加流体压力(注射rf)。在使用本文所述的流体压力技术之后，如果需要，所述过滤柱仍然可以进行空气吹扫或离心，以便进一步收集。
尽管不限于任何特定用途，但是上述收集系统可以特别适用于与如下文所述的感染性病原体如结核病的检测方法一起使用。然而，所述系统和方法可能特别适用于与使用cfna收集进行诊断的任何方法一起使用，例如，用于胎儿遗传疾病的早期诊断、肿瘤诊断和深部组织感染(如ltbi)的方法。总的来说，该系统和方法可以特别适用于基于na物质评估的任何方法，所述na物质包含与主体不同的na信息的改变。本文所述的系统和方法在提取和保存具有重要地位的领域中特别有用。检测血液中低浓度的cfna需要相当大的体积样本(2-5-10ml)，因为当加入试剂时，总体积容易达到20-50ml，这是先前存在的方法难以处理或难以实现自动化的。rna由于其稳定性而呈现出问题。因此，该方法和系统特别适用于依赖于体液中低浓度cfna(尤其是rna)的检测的处理。
在某些实施方案中，本发明包括如下编号的实施方案：
实施方案1：一种用于收集生物分子的系统，所述系统包括：
提取器组件，其包括顶盖、提取器芯、提取器芯适配器、具有内部容积的提取器主体、以及底盖环；
所述顶盖适于用所述底盖环可拆卸地固定到所述提取器主体上，所述顶盖具有内侧和外侧，所述内侧面向所述提取器主体的内部容积，所述外侧背对所述提取器主体，所述顶盖包括在所述内侧和外侧之间连通的样本连接端口，所述盖在所述内侧和外侧之间不含其他的连通孔，所述样本连接端口包括用于将其可释放地锁定到协作的第二互锁部件的第一互锁部件，所述盖的内侧包括与所述样本连接端口流体连通的连接接口；
所述提取器芯适于可移除地附接到所述顶盖的所述连接接口，所述提取器芯具有敞开的上游端、敞开的下游端以及位于其间的内部通道，所述内部通道容纳用于收集所述生物分子的基底；
所述提取器主体具有第一开口端和第二端，所述第一开口端构造成与所述顶盖配合，所述第二端包括构造成接纳所述提取器芯适配器的开口；并且
所述提取器芯适配器具有上游开口端、下游突起、下游开口端以及在所述上游开口端和所述下游开口端之间的内部通道，所述上游开口端用于与所述提取器芯的下游端配合，所述下游突起构造成突出穿过所述提取器主体中的开口。
实施方案2：根据实施方案1所述的系统，所述系统还包括注射器，所述注射器包括第二互锁部件，所述第二互锁部件适于连接到所述顶盖中的样本连接端口的第一互锁部件。
实施方案3：根据实施方案1所述的系统，所述系统还包括限定适于容纳所述提取器芯的体积的运输容器，所述运输容器适于可释放地接合所述提取器芯以使其从所述顶盖的连接接口分离，所述运输容器还包括用于将提取器芯暂时密封在该运输容器内的可拆卸盖。
实施方案4：根据实施方案1所述的系统，其中所述提取器芯包括基底、该基底下游的过滤器、以及该基底上游的保持环。
实施方案5：根据实施方案1所述的系统，其中所述样本连接端口从所述顶盖的外侧突起。
实施方案6：根据实施方案5所述的系统，其中所述样本连接端口的第一互锁部件包括鲁尔锁定配件的一端。
实施方案7：根据实施方案1所述的系统，其中所述提取器芯包括螺纹接口的第一部件，所述顶盖包括螺纹接口的第二部件。
实施方案8：根据实施方案3所述的系统，其中所述提取器芯还包括设置在其外表面上的第一构件，所述第一构件适于与设置在所述运输容器的内表面上的、配合的第二构件可释放地接合，所述第二构件适于在沿将所述提取器芯从其与所述顶盖的螺纹连接拧开的方向施加扭转力到所述提取器芯时将力传递到所述第一构件。
实施方案9：根据实施方案8所述的系统，其中所述第一构件和第二构件均包括突片。
实施方案10：根据实施方案1所述的系统，所述系统还包括一个或多个样本处理容器、试剂容器、或废物收集容器，一个或多个所述容器包括具有可膨胀容积的柔性容器。
实施方案11：根据实施方案10所述的系统，其中所述一个或多个所述柔性容器包括塑料袋。
实施方案12：根据实施方案11所述的系统，其中所述一个或多个柔性容器包括一个或多个整合到所述袋中以给所述袋提供结构强度的刚性加强件。
实施方案13：根据实施方案12所述的系统，其中所述刚性加强件提供足够的结构以使所述一个或多个柔性容器在充满或部分填充液体时保持在直立位置。
实施方案14：根据实施方案10所述的系统，其中所述一个或多个柔性容器包括样本处理容器，所述样本处理容器具有密封盖以及该盖中的开口，所述开口的尺寸被设置成接收穿过所述密封盖插入且与所述柔性容器的内侧流体连通的一段长度的管子。
实施方案15：根据实施方案14所述的系统，其还包括注射器，所述注射器包括第二互锁部件，所述第二互锁部件适于连接到所述顶盖中的样本连接端口的第一互锁部件，所述穿过柔性容器的密封盖插入的一段长度的管子具有第一端和第二端，所述第一端设置在所述柔性容器的内部，所述第二端包括第一互锁部件，所述第一互锁部件适于连接到所述注射器的所述第二互锁部件。
实施方案16：根据实施方案15所述的系统，其中所述密封盖中的开口的尺寸被进一步设置成接收所述提取器适配器的下游端。
实施方案17：一种用于收集生物分子样本的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供根据实施方案15所述的用于收集生物分子的系统；
(b)在所述注射器中收集一定体积的含样本的液体；
(c)通过所述样本连接端口将所述注射器连接到所述提取器组件，并将所述提取器适配器的下游端连接到所述样本处理容器的密封盖；并且
(d)使所述一定体积的含样本的液体从所述注射器穿过所述提取器芯，从而在所述基底上收集所述样本，并在所述样本处理容器中收集剩余物，并且可选地重复该步骤一次或多次，并且可选地实施一次或多次洗涤步骤。
实施方案18：根据实施方案17所述的方法，其中用于收集生物分子的系统还包括限定适于容纳所述提取器芯的体积的运输容器，所述运输容器适于可释放地接合所述提取器芯以使其从所述顶盖的连接接口分离，所述运输容器还包括用于将提取器芯临时密封在所述运输容器内的可拆卸盖，所述方法还包括以下步骤：
(e)将所述运输容器的开口端套在所述提取器芯上，使所述提取器芯与所述运输容器接合，并使所述提取器芯从所述顶盖分离；
(f)用所述可拆卸盖临时密封所述运输容器。
实施方案19：根据实施方案18所述的方法，所述方法还包括在周围无气候控制的条件下运输所述运输容器。
实施方案20：根据实施方案17所述的方法，所述方法还包括从所述基底收集样本，其中所述收集包括用洗脱缓冲液处理所述基底上的样本，将驱避剂注射到所述提取器芯中，以及收集洗脱缓冲液、驱避剂和生物分子所生成的组合物。
实施方案21：根据实施方案20所述的方法，其中所述驱避剂包括聚二甲基硅氧烷。
实施方案22：根据实施方案17所述的方法，所述方法包括处理收集在所述提取器芯中的生物分子，以用于检测疾病。
实施方案23：根据实施方案22所述的方法，其中所述疾病是结核感染。
实施方案24：根据实施方案22所述的方法，其中所述疾病是结核病。
实施方案25：根据实施方案22所述的方法，其中所述处理用于检测潜伏性结核感染。
实施方案26：根据实施方案17所述的方法，其中所述含样本的液体包含血浆或血清。
实施方案27：一种通过使用如实施方案1所述的系统从基底收集生物分子样本的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用水性洗脱缓冲液处理所述基底上的样本；
(b)将疏水性驱避剂注射到所述提取器芯中，以及
(c)收集洗脱缓冲液、驱避剂和生物分子所生成的组合物。
实施方案28：根据实施方案27所述的方法，其中所述驱避剂包括聚二甲基硅氧烷。
实施方案29：根据实施方案27所述的方法，所述方法包括在具有上游端口和下游开口端的装置中处理所述基底，使用连接到所述端口的注射器注入所述疏水性驱避剂，以及从所述下游开口端收集所生成的组合物。
实施方案30：根据实施方案29所述的方法，所述方法包括不用对所述基底进行离心处理而从所述下游开口端收集所生成的组合物。
实施例
实施例1-moe设备的构造
构建了如图2-4所示的过滤柱200的原型。从gf/d玻璃纤维滤纸(whatman，nj)冲压合适尺寸的基底212，并插入到惰性pp多孔过滤器214的顶部，然后将pp支撑环210紧紧地放置在基底212的顶部，以固定所述组件。将顶部具有鲁尔锁连接的盖101旋拧并密封在过滤柱上。然后将带有组装有过滤柱的盖子旋拧并密封成空的50ml塑料一次性离心管。如上所述的整个设备在本文中进一步被称为moe(手动操作提取)设备。可以以相同的方式构造以下实施例中使用的多个moe过滤设备。
实施例2
人类合并血浆的制备：将来自10个健康捐献者的新鲜抽取的血液在4000g下离心20分钟。从每个采血管中取出血浆部分，并将其汇集在50ml离心管中。将合并的血浆涡旋并在-20℃冷冻。
实施例3
从合并的血浆中提取cfdna：在该实施例中，仅使用所述moe过滤柱及以下缓冲液和方案：
缓冲液：裂解缓冲液(lb)：含有硫氰酸胍(gitc)、洗涤剂tritonx-100、蛋白酶k和edta。
结合缓冲液(bb)：含有gitc和异丙醇(ipa)，充分混合。
洗涤缓冲液(wb)：含有tris、edta、盐、乙醇，ph7.0。
洗脱缓冲液(eb)：含有tris和edta，ph7.5。
方案：
1.裂解：用具有长针头的10ml注射器将2ml解冻的合并血浆抽入含有2mllb的50ml塑料离心管中，通过涡旋充分混合，在60℃的加热块中孵育30分钟。在室温下冷却。
2.结合：将16mlbb抽入样本裂解液管中，通过涡旋混合，将其在室温下保持10分钟。
3.结合和提取：将50ml裂解管中的所有内容物用长针头抽入30ml的鲁尔锁注射器中，直到将约5ml的空气抽入所述注射器中，将所述鲁尔锁注射器拧到组装的moe设备的所述盖上的母鲁尔锁连接器上，所述moe设备牢固地安置在机架中。将所述注射器柱塞向下压，直到所述注射器中的所有液体和空气穿过所述过滤柱。将废物收集在所述moe装置的50ml管中。此过程可能需要1-2分钟。拧下所述30毫升注射器。
4.将4mlwb抽入10ml鲁尔锁注射器中，按压所述柱塞以允许wb穿过所述柱。拧下10ml注射器。
5.将4ml100％乙醇抽入10ml注射器中，按压所述柱塞使乙醇穿过所述柱。
6.从所述50ml离心管中拧下所述moe装置的盖子，放在新的50ml管上。使所述柱中的乙醇残留物完全晾干。
实施例4.用3种方法洗脱提取的cfdna
在该实验中，比较3种洗脱方法。将装有从合并血浆中提取的cfdna的12个moe装置分成3组(n＝4)：a)通过高速离心(hc)洗脱；b)通过空气吹扫(ap)洗脱；c)通过驱避液(rf)洗脱。
通过qpcr测定比较管家基因b2m的片段cfdna的回收效率与洗脱体积和洗脱液中的cfdna浓度。
提取方案hc：将所述过滤柱从moe装置的盖上分离，并将所述柱放入1.5ml收集离心管中，在所述基质上加入100μleb，在顶部用螺帽密封所述柱，等待10分钟以释放。然后将收集管以12,000g离心3分钟。
提取方案ap：通过移液器在所述moe装置中通过入口端口在所述基质上加入100μleb，并等待10分钟。将10毫升注射器连接到所述盖的端口上，将带有所述盖的过滤柱放在1.5毫升收集管上，并反复推动和拉出所述注射器柱塞以吹扫所述柱。将所述收集管离心以将吹扫的eb收集到所述管的底部。
提取方案rf：如方案ap中所述添加eb。10分钟后，将具有0.5mlrf(psf-10cstpuresiliconefluid，clearcoproducts，pa)的5ml注射器连接到所述盖的端口上，并将所述柱放置在所述收集管上。缓慢压下所述柱塞以吹扫eb和rf。未经离心就在eb(底层)和rf层之间快速地形成清晰的界面。
所述洗脱液中cfdna的定量。除掉10μl洗脱液作为qpcr测定(siboqpcrmix，occambiolabs，inc.，de)的模板。从收集管中小心地取出残留物洗脱液并用0.1mg级数字天平称重。其结果示于表1中。
表1
尽管本文参考具体实施方式来说明和描述了本发明，但本发明并不限于所示的细节。相反，可以在权利要求的等同的范围和区域内且不脱离本发明的基础上，对细节进行各种修改。
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