具有原子催化中心的刺猬状催化材料及其在制备抗菌药物中的用途

1.本发明属于抗菌药物领域，具体涉及一种具有原子催化中心的刺猬状催化材料及其在制备抗菌药物中的用途。


背景技术：

2.众所周知，细菌耐药已成为全球范围的重大公共健康问题，抗生素的滥用是造成细菌耐药的重要原因。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin
‑
resistant staphylococcus aureus，简称“mrsa”)具有多重耐药性并伴有高发病率和高死亡率，是导致坏死性肺炎、严重败血症、坏死性筋膜炎等疾病的重要致病菌，是医院感染和社区感染的重要病原菌之一，给临床治疗带来了极大的困难。mrsa对绝大多数的抗菌药物或制剂耐药，甚至对目前临床抗耐药菌最为有效的万古霉素也开始出现耐药，一旦mrsa发展到对万古霉素普遍耐药的程度，感染mrsa的患者将面临无药可治的危险境地。因此，针对细菌耐药日趋严重的情况，亟需开发非抗生素类药物来对抗细菌。
3.有研究者提出可以通过化学、光动力或声动力材料产生活性氧(ros)来作为替代的抗菌策略。在各种ros产生材料中，仿酶催化剂(包括纳米脂质体，金属有机骨架和无机材料等)由于能够活化过氧化氢(h2o2)产生ros而获得了极大的关注。然而，当以非常低的浓度处理时，现有的仿酶催化剂往往表现出细菌杀灭能力不足的问题，而高浓度的使用又容易引起对细胞的毒性，存在生物相容性差的问题。因此，开发抗菌效果更好的、生物相容性优良的非抗生素类药物对于抗耐药细菌非常重要。
4.众所周知，巨噬细胞在消毒和伤口愈合中起关键作用。巨噬细胞可以通过连续捕获，吞噬和杀死细菌来有效地消灭病原细菌。巨噬细胞具有微褶，突出和识别受体的粗糙表面，这有助于细菌的检测和捕获；吞噬细菌后，溶酶体中的各种过氧化物酶(pod)可以产生丰富的局部ros，以迅速杀死细菌。研究发现，巨噬细胞中产生ros的酶主要由含血红素的催化位点组成，在cl
‑
和h2o2存在下，它们可产生高毒性的次氯酸(hclo)和其他类型的ros。虽然有报道称v2o5纳米棒显示出良好的hclo产生和仿卤代过氧化物酶(hpo)活性，但v2o5潜在的细胞毒性和较差的细菌捕获能力限制了其应用。因此，开发抗菌效果优良、生物相容性优良、可模仿巨噬细胞“捕获和杀死”细菌过程的材料对于抗耐药细菌具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种具有原子催化中心的刺猬状催化材料及其在制备仿酶制剂和抗菌药物中的用途。
6.本发明提供了一种刺猬状催化材料，它是将刺猬状金属有机骨架材料与金属盐、具有吡啶n的材料混合后热处理得到的。
7.进一步地，所述刺猬状催化材料将刺猬状金属有机骨架材料与金属盐、具有吡啶n的材料与溶剂混合后，干燥，热处理得到的；所述具有吡啶n的材料为1,10
‑
菲咯啉。
8.进一步地，所述金属盐、1,10
‑
菲咯啉的摩尔比为(1.2～4.0)：1；所述刺猬状金属有机骨架材料与金属盐的质量比为(0.1～1)：(0.1～1)；所述溶剂为醇类溶剂；所述热处理是在惰性气体氛围中进行的，热处理温度为500～800℃，时间为1～3小时。
9.进一步地，金属盐、1,10
‑
菲咯啉的摩尔比为2：1；所述刺猬状金属有机骨架材料与金属盐的质量比为27：1；所述溶剂为乙醇；所述热处理是在惰性气体氛围中进行的，热处理温度为600℃，时间为2小时。
10.进一步地，所述金属盐为fe
3+
盐或v
3+
盐；所述fe
3+
盐优选为三乙酰丙酮铁，所述v
3+
盐优选为三乙酰丙酮钒。
11.进一步地，所述刺猬状金属有机骨架材料的制备方法包括以下步骤：将金属有机骨架材料与尿素、水混合，水热处理，然后分离出沉淀，干燥后加热处理，即得。
12.进一步地，所述金属有机骨架材料为zn
‑
mof
‑
74；优选的，zn
‑
mof
‑
74的制备方法包括以下步骤：将zn
2+
盐、2，5
‑
二羟基对苯二甲酸与有机溶剂混合均匀，然后分离出固体，即得zn
‑
mof
‑
74。
13.进一步地，所述zn
2+
盐为二水合乙酸锌，所述有机溶剂为醇类溶剂，所述zn
2+
盐、2，5
‑
二羟基对苯二甲酸、尿素的摩尔比为1：(0.20～0.50)：(0.30～0.60)；所述zn
2+
盐与有机溶剂的质量体积比为1：(200～400)g/ml；所述尿素与水的质量体积比为1：(2～4)g/ml；所述混合均匀的方式为超声处理；
14.和/或，所述水热处理温度为150～200℃，时间为12～36小时；所述加热处理的温度为900～1300℃，时间为0.5～3小时。
15.进一步地，所述醇类溶剂为甲醇，所述zn
2+
盐、2，5
‑
二羟基对苯二甲酸、尿素的摩尔比为1：0.30：0.42；所述zn
2+
盐与有机溶剂的质量体积比为1：(300～350)g/ml；所述尿素与水的质量体积比为1：3g/ml；所述超声处理的时间为30分钟；
16.和/或，所述水热处理温度为175℃，时间为24小时；所述加热处理的温度为1100℃，时间为1小时。
17.本发明还提供了上述的刺猬状催化材料在制备仿酶制剂中的用途。
18.进一步地，所述仿酶制剂为仿酶制剂制剂、仿过氧化物酶制剂或仿卤素过氧化物酶制剂。
19.本发明还提供了上述的刺猬状催化材料与双氧水联用在制备抗菌药物中的用途。
20.进一步地，所述抗菌药物为抗革兰氏阳性菌的药物。
21.进一步地，所述抗菌药物为抗耐药细菌的药物。
22.进一步地，所述耐药细菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
23.本发明中，“刺猬状”是指形貌像刺猬，该形貌表面有很多从核心径向延伸出来的突起；这样的形貌有利于捕获大量的细菌。
24.zn
‑
mof
‑
74是一种金属有机骨架材料。
25.本发明提供了一类具有原子催化中心的刺猬状催化材料，该材料能够通过模仿巨噬细胞的“捕获和杀死”过程来杀灭耐药细菌mrsa，该材料能够作为一种人工巨噬细胞。
26.本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料具有良好的仿氧化酶活性、仿过氧化物酶活性和仿卤素过氧化物酶活性，能够用来制备高催化活性的仿酶制剂，在抗菌、抗肿瘤、废水处理、免疫印迹分析等领域具有广阔的应用前景。并且，在本发明提供的具有
原子催化中心的刺猬状催化材料中，fe
‑
art m的催化活性优于v
‑
art m。
27.实验结果表明，本发明刺猬状催化材料fe
‑
art m的高催化活性源于fe2n6o催化中心，fe
‑
art m可以通过其刺猬状形貌和fe2n6o催化中心大量生成
·
o2‑
和hclo来有效捕获和杀死mrsa。
28.本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料在体外对耐药细菌mrsa具有良好的抗菌活性，并且其中fe
‑
art m的抗菌活性(mic为8μg/ml)优于v
‑
art m(mic为32μg/ml)。
29.本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料能够在体内有效地杀死mrsa并快速促进mrsa细菌感染的动物皮肤伤口愈合，并且其中fe
‑
art m的治疗效果与万古霉素相当。
30.本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料是一种非抗生素材料，其能够解决抗生素滥用带来的细菌耐药问题，对非耐药细菌和耐药细菌均具有优良的杀灭性能。此外，本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料具有优良的生物相容性，在制备模仿巨噬细胞的仿生材料和抗菌药物中具有广阔的应用前景。
31.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
32.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
33.图1刺猬状人造巨噬细胞的设计示意图：a.该图显示天然巨噬细胞可以在人体中产生
·
o2‑
和hclo；b.以fe为催化位点的血红素铁基过氧化物酶(fe
‑
hpo)；c.以v为催化位的钒基卤代过氧化物酶(v
‑
hpo)；d.art m和v/fe
‑
art m的制备过程的示意图；e.fe
‑
art m的工作原理示意图：通过“捕获和杀死”功能进行mrsa根除。
34.图2不同刺猬状催化材料的特征及其细菌的“捕获和杀死”功能：fe
‑
art
‑
m的sem(a)和hrtem(b)图像；c.n2吸附/解吸等温线以及art m，fe
‑
art m和v
‑
art m的相应表面积；art m，fe
‑
art m和v
‑
art m的xrd光谱(d)、haadf
‑
stem图像(e)和fe
‑
art m的相应edx定位图；f.sem图像，显示了与mrsa孵育后fe
‑
art m的细菌捕获能力；g.根据sem图像计算出的不同材料捕获mrsa的数量，其中g的插图是被尖峰放大的捕获细菌；h.基于v
‑
art m(i)和fe
‑
art m(j)的荧光结果计算的活/死细菌比，数据从范围为1mm
×
1mm的三个荧光显微镜图像获得，并表示为平均值
±
sd，统计显著性通过t检验进行了评估：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
35.图3结构分析：a.art m和fe
‑
art m的曲线拟合高分辨率xps n1s光谱的比较；b.fe
‑
art m的高分辨率fe 2p xps光谱；xanes(c)和fefoil，fe2o3，fepc和fe
‑
art m在r空间中的fe k
‑
edge exafs的傅立叶变换(d)；f.r空间中fe
‑
art m的相应fe k
‑
edge exafs拟合曲线；g.fefoil，fe2o3，fepc和fe
‑
art m的wt
‑
exafs；h.fe
‑
art m的放大的haadf
‑
stem图像；i.在区域1中获得的强度分布图和相应的示意图显示了视平面上的fe
‑
fe投影距离；j.为exafs的理论拟合分析对fe
‑
art m的晶体结构进行建模，原子颜色：橙色，fe；灰色，c；蓝色，
n；红色，o。
36.图4刺猬状催化材料的仿酶活性：a.在art m和h2o2存在的情况下，通过基于tmb的uv
‑
vis光谱进行仿pod活性测试；b.典型的michaelis
‑
menten曲线；c.v
‑
art m或fe
‑
art m的v
max
，v0，k
m
和ton值；d.与报道的仿酶催化剂的ton和v
max
值进行比较，np：纳米粒子；mof：金属有机框架；e.epr光谱；f.具有不同自由基清除剂的fe
‑
art m在dmso溶液中的epr光谱；g.通过在ph为5.6的醋酸盐缓冲液中使用天青蓝作为卤过氧化物酶模拟活性试剂来检测活性；h.ph为5.6时各组的相对活性，其中相对活性是指强度512nm/强度648nm的比值，每组n＝3，数据表示为平均值
±
sd，统计显著性通过t检验进行了评估：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
37.图5刺猬状催化材料对耐药细菌的灭菌能力评估：a.fe
‑
art m通过刺猬状形貌和生成大量ros治疗感染伤口皮肤的示意图，显示了fe
‑
art m的“捕获和杀灭”功能；b.针对mrsa的10μg/ml的不同样品的实时od
600
值；c.在h2o2存在下，用不同浓度的v
‑
art m和fe
‑
art m处理mrsa的杀灭率；d.在不同日期的伤口的数码照片，e.在不同日期的伤口大小变化；在第15天，不同组的表皮组织学切片的h&e染色(f)，masson(g)，cd31染色图像(h，其中宽度：638.5μm，高度：638.5μm)，中性粒细胞数(i)，胶原蛋白指数(j)和血管数(k)，n＝3，数据表示为平均值
±
sd，与对照组相比，t检验评估了差异显著性：**p＜0.01，***p＜0.001，n.s.表示无显著差异。
38.图6实施例1碳化之前(即步骤1于管式炉中加热之前)的art m的sem图像和相应的平均尺寸。
39.图7实施例1碳化后(即步骤1于管式炉中加热之后)的art m的sem图像。
40.图8v
‑
art m的sem图。
41.图9fe
‑
artm的hrtem图。
42.图10v
‑
art m的hrtem图。
43.图11通过bet方法测量的art m，v
‑
art m和fe
‑
art m的孔分布。
44.图12v
‑
art m的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(haadf
‑
stem)图像和edx映射。
45.图13用mrsa处理的art m，v
‑
art m和fe
‑
art m的sem图像。
46.图14对照组和art m组的荧光显微镜图像。
47.图15各材料的仿oxd的活性：tmb在ph 4.5醋酸盐缓冲液中催化氧化后的典型吸收光谱。
48.图16art m，v
‑
art m和fe
‑
art m的曲线拟合高分辨率xps n 1s光谱的比较。
49.图17v
‑
art m的高分辨率v 2p xps光谱。
50.图18art m，v
‑
art m和fe
‑
art m中c1s的高分辨率xps光谱。
51.图19art m，fe
‑
art m和v
‑
art m中o1s的高分辨率xps光谱。
52.图20fe
‑
art m的放大的haadf
‑
stem图像(a)；在区域1中获得的强度曲线(b)，显示了fe
‑
fe在视觉平面上的投影距离。
53.图21推测的四种化学结构模型及相应的fe
‑
fe键长；a，c，e，g顶视图，b，d，f，h侧视图。
54.图22(a)在ph 5.6的乙酸缓冲液中用h2o2催化氧化后，tmb的典型吸收光谱；(b)不
同样品在652nm处的强度；每组n＝3，数据表示为平均值
±
sd，统计显著性是通过t检验进行评估的：*p＜0.05，**p＜0.01，n.s.表示无显著差异。
55.图23v
‑
art m和fe
‑
art m的双倒数图。
56.图24通过使用dmpo作为捕集剂，epr光谱可检测hoac/naoac溶液中不同系统生成的
·
oh。
57.图25temp原位1o2自由基检测的epr光谱。
58.图26催化生成的hocl氧化cb分子的示意图。
59.图27a.通过在ph为7.4的醋酸盐缓冲液中使用天青蓝作为卤过氧化物酶模拟活性试剂来检测活性；b.ph为7.4时各组的相对活性，其中相对活性指在512nm和648nm处强度的比值，每组n＝3，数据表示为平均值
±
sd，统计显著性是通过t检验进行评估的：**p＜0.01，***p＜0.001，n.s表示无显著差异。
60.图28纯l929和共培养的l929样品的代表性活细胞/死细胞染色结果(绿色：活的，红色：死的)
61.图29各组伤口构造，感染，消毒和愈合的照片。
62.图30 15天后不同处理方式的家兔内脏组织切片的h&e染色图像，将没有mrsa感染的健康兔作为标准组(normal)，将具有mrsa感染伤口的兔子用作对照组(control)。
63.图31 15天后用不同处理的兔子的内脏组织切片的masson染色图像，将没有mrsa感染的健康兔作为标准组(normal)，将具有mrsa感染伤口的兔子用作对照组(control)。
64.图32皮肤组织的免疫荧光染色，用于dapi，cd 31和cd31/dapi。
具体实施方式
65.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
66.其中，二水合醋酸锌(ar，99.0％)；2,5
‑
二羟基对苯二甲酸(98％)；尿素(≥99.5％)；3,3’，5,5
’‑
四甲基联苯胺(tmb，gc标准，≥99.0％)；5,5
‑
二甲基
‑1‑
吡咯啉n
‑
氧化物(dmpo，97％)；乙酰丙酮钒(iii)(又称三乙酰丙酮钒，金属含量99.98％)；乙酰丙酮铁(iii)(又称三乙酰丙酮铁，金属含量≥99.9％)购自阿拉丁有限公司。1，10
‑
菲咯啉(ar，99.9％)购自吉林省研伸科技有限公司。
67.实施例1制备具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m
68.1、制备刺猬状金属有机骨架材料atr m
69.将50ml含有二水合乙酸锌(0.22g，1mmol)的甲醇与20ml含有2，5
‑
二羟基对苯二甲酸(60mg，0.3mmol)的甲醇混合，并且将所得混合物超声处理30分钟。然后离心得到沉淀，用水洗涤3次后，得到zn
‑
mof
‑
74。
70.将所得zn
‑
mof
‑
74与75ml含有尿素(25mg，0.42mmol)的去离子水加入teflon高压釜，于175℃反应24小时。然后将所得沉淀物分别用水和乙醇洗涤后，在真空下于80℃干燥5h。然后，将所得产物转移到陶瓷舟皿中，并置于管式炉中，以5℃/min的升温速率加热到1100℃保持1h，然后自然冷却至室温，得到刺猬状金属有机骨架材料，即本发明非金属掺杂的人造巨噬细胞atr m。
71.2、制备具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m
72.将0.02g art m分散在2.5ml乙醇溶液中，添加30μl乙酰丙酮铁(iii)和1,10
‑
菲咯
啉的乙醇溶液(乙醇溶液中乙酰丙酮铁(iii)和1,10
‑
菲咯啉的摩尔比为2：1，乙酰丙酮铁(iii)的浓度为0.0245g/ml)，超声混合均匀，得到分散体。将分散体在真空烘箱中于60℃干燥过夜，并在n2气氛中加热至600℃并保持2小时，得到具有原子催化中心的刺猬状催化材料，即本发明具有原子催化中心的人造巨噬细胞fe
‑
art m。
73.实施例2制备具有原子催化中心的刺猬状催化材料v
‑
art m
74.参照实施例1的制备方法，区别仅在于将步骤2中的金属乙酰盐由乙酰丙酮铁(iii)替换为乙酰丙酮钒(iii)，制备得到具有原子催化中心的刺猬状催化材料，即本发明具有原子催化中心的人造巨噬细胞v
‑
art m。
75.以下通过实验例证明的有益效果。
76.实验例1结构表征
77.1、测试样品
78.实施例1制得的目标产物fe
‑
art m，实施例2制得的目标产物v
‑
art m，实施例1步骤1制得的atr m。
79.2、实验方法
80.在配备了自动表面积的tristar 3020加速表面积和孔隙率仪上，使用brunauer
‑
emmett
‑
teller(bet)进行n2的吸附分析，计算待测材料的表面积和孔径分布。通过xps设备(escal 250)获得x射线光电子能谱(xps)，以检测m
‑
art m的成分并确认金属的成功引入。扫描电子显微镜(sem)图像是通过使用apreo s hivoc(thermo fisher scientific，fei)获得的。透射电子显微镜(tem)图像和标测图是通过在200kv下操作的talos f200x tem显微镜(fei ltd.，美国)获得的。x射线衍射(xrd)模式通过bruker d8 focus x射线衍射仪显示了晶体相态。x射线吸收光谱在nsrrc的光束线bl07a1上收集，并由ceshigo research service提供技术支持。辐射通过si(111)双晶单色仪单色化。anes和exafs数据的减少和分析由athena软件处理。使用cs校正(s)tem(fei titan cubed themis g2 300)进行放大的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(haadf
‑
stem)。表面元素组成和所有结合能通过具有alkα单色x射线源的x射线光电子能谱(xps，escal 250)进行测量。
81.3、实验结果
82.通过扫描电子显微镜(sem)和高分辨率透射电子显微镜(hr
‑
tem)(图2a，2b，图9，图10)验证了测试样品的代表性刺猬形态和不同类型的尖峰。同时，通过brunauer
‑
emmett
‑
teller(bet)方法分析了待测材料的表面积和孔径分布。结果显示，测试样品都具有极高的表面积(高达1895.8m2/g，图2c)，且孔隙范围介于1.01至4.84nm之间(图11)。通过x射线衍射(xrd)模式检测测试样品的碳结构和金属相，并且现有的弱碳(002)和(101)衍射特征峰表明，这些多孔测试样品均显示出低石墨化度，hrtem图像中观察到具有大量缺陷且没有金属相关相的痕迹(图2d)。这种独特的多孔碳质结构可以极大地促进材料在ros催化反应过程中底物的运输。此外，高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(haadf
‑
stem)图像和相应的能量色散光谱(eds)元素映射图像显示，原子级的fe和v原子均匀分布在刺猬颗粒上(图2e和图12)。
83.表1：不同金属基催化剂中c，n，o，金属的元素原子鉴定结果(原子比％)
[0084][0085]
表2：单原子基催化剂中各种n物种的n1s光谱拟合结果
[0086][0087][0088]
表3：各种样品在fe k边缘的exafs拟合参数(s
02
＝0.729)
[0089][0090]
n
a
:配位数；r
b
:键长；σ2:debye
‑
waller factors；δe
0d
:the innerpotential correction；r factor:拟合度。
[0091]
本发明进一步对fe
‑
art m进行了结构分析：
[0092]
首先，利用xps揭示了金属
‑
菲咯啉配合物的成功掺杂及其具体的原子比(图3a，3b和图16
‑
19，表1～表2)。可以看出，fe
‑
art m中的n和fe含量分别为1.64和0.11原子％(表1)；此外，在图3a中，高分辨率n1s光谱显示fe
‑
art m(389.89ev)中的吡啶氮具有比art m(398.49ev)更高的结合能，证明了吡啶n与铁离子的成功结合。此外，在图3b中，fe 2p光谱可分为两个属于fe
2+
/fe
3+
离子物种的峰，而未检测到fe0和其他价态。此外，结合能在529
‑
530ev处不显示，这共同证明fe
‑
art m材料中的fe以络合态而不是氧化态的形式存在(图19)。
[0093]
其次，利用fe k边缘x射线吸收近边缘结构(xanes)和傅立叶变换的k3加权扩展x
射线吸收精细结构(ft
‑
exafs)光谱来表征fe中fe元素的原子配位结构。fe
‑
art m以fefoil，fe2o3，fepc为参考。在图3c中，位于约7114.6ev处的材料中的前边缘峰大约位于fepc和fe2o3之间。此外，放大的边缘xanes光谱表明，fe
‑
art m在fepc和fe2o3之间显示正价，表明类似的fen4结构(图3d)。根据exafs拟合的结果(图3e，f和表3)可以看出，位于fe k边缘的fe
‑
art m出现两个位于的不可忽略峰，这与fe
‑
n/o配位和fe
‑
fe配位高度一致。为了进一步验证上述结果，本发明进行了exafs小波变换(wt)分析(图3g)，这是一种用于在r空间中高分辨率分辨背向散射原子的强大工具。从图3g可以看出，与fefoil，fe2o3和fepc相比，fe
‑
art m的wt图显示的强度最大值在约和处，这与fe
‑
n/o和fe
‑
fe配位信号一致。
[0094]
最后，在放大的haadf
‑
stem图像(图3h)中显示的相邻亮点表示fe2结构，强度分布图中显示的距离在附近，与exafs的结果一致(图3i)。此外，图20所示的相对较远的fe
‑
fe距离解释了存在少数键长约为的fe
‑
fe。根据xps，xas测试和精细结构分析结果，在图4j中建立了fe
‑
art m的优化结构模型，与图21b,c,d中的其他结构形成对比。fe
‑
art m中，fe原子在石墨氮化物骨架中被两个n原子锚定，并且两个fe与一个o原子连接。进一步可以解释为fe
‑
fe的平均配位数为3.2；fe
‑
fe的平均配位数为3.2。
[0095]
上述测试结果表明，本发明成功制得了具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m和v
‑
art m。
[0096]
实验例2对细菌的“捕获和杀死”功能测试
[0097]
1、测试样品
[0098]
实施例1制得的目标产物fe
‑
art m，实施例2制得的目标产物v
‑
art m，实施例1步骤1制得的atr m。
[0099]
2、实验方法
[0100]
为了直接证明本发明制得的刺猬状催化材料可以通过其尖刻的形貌和生物粘附的碳质结构来捕获细菌，本发明进行了以下实验：
[0101]
(1)将待测样品与mrsa细菌充分混合2h后，在4
°
冰箱用戊二醛固定12小时后，再用20％
‑
100％梯度脱水，在扫描式电子显微镜(sem)下观察并拍照。
[0102]
(2)将待测样品与mrsa细菌充分混合2h后，通过live/dead baclight viability试剂盒(用于活细胞的syto
‑
9和用于死细胞的碘化丙啶)对细菌进行染色，并利用荧光显微镜观察，红的就是死菌，绿色就是活菌。
[0103]
耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(atcc 43300，革兰氏阳性)来源于四川大学华西医院天府生命科技园。
[0104]
3、实验结果
[0105]
根据sem和荧光显微镜图像可以观察到，各测试样品均可以有效捕获大量细菌，无明显差异(图2f
‑
j和图13
‑
图14)。但是，对于未掺杂fe或v的原始art m，死细菌的数量非常有限，这表明尖刺的物理渗透无法有效地杀死细菌。对于fe
‑
art m，捕获的大多数mrsa均已死亡，而fe
‑
art m周围的细菌均显示出良好的生存能力。这些数据表明fe
‑
art m和v
‑
art m对捕获的mrsa细菌表现出良好的接触杀灭活性，且fe
‑
art m的活性优于v
‑
art m。
[0106]
上述实验结果表明，非金属掺杂的刺猬状材料atr m对mrsa细菌不具备接触杀灭活性，但是，本发明制得的具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m和v
‑
art m对捕获
的mrsa细菌表现出良好的接触杀灭活性，且其中fe
‑
art m的活性优于v
‑
art m。本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料能够作为人工巨噬细胞以实现对细菌的“捕获和杀灭”。
[0107]
实验例3仿酶活性研究
[0108]
1、测试样品
[0109]
实施例1制得的目标产物fe
‑
art m，实施例2制得的目标产物v
‑
art m，实施例1步骤1制得的atr m。
[0110]
2、实验方法
[0111]
仿过氧化物酶(pod)活性测试：将500μl待测样品(0.1mg ml
‑1)，20μltmb(10mg ml
‑1)和25μlh2o2(1m)添加到2ml乙酸钠
‑
乙酸(naoac/hoac)缓冲液中[100mm(ph 4.5或5.6)]。通过测量tmb的氧化形式在λ
max
＝652nm(ε＝39,000m
‑1·
cm
‑1)处的吸收变化，研究了tmb的催化氧化(oxtmb)。除非另有说明，否则pod活性是在空气饱和的缓冲液中进行的。michaelis
‑
menten常数是使用michaelis
‑
menten方程v＝vmax
×
[s]/(km+[s])，ton＝vmax/[e]的双倒数的lineweaver
‑
burk图计算的，其中ton＝vmax/[e]，vmax是最大反应速度，[s]是h2o2的浓度，km是米氏常数，ton是转换数，[e]是纳米酶中金属的摩尔浓度。
[0112]
仿氧化酶(oxd)活性测试：仿氧化酶活性测试的方法，除了不加h2o2之外，检测过程与仿过氧化物酶活性检测方法一致。
[0113]
仿卤素过氧化物酶(hpo)活性测试：通过天青(cb)确定了卤代过氧化物酶模拟活性，将500μl待测样品(0.1mg ml
‑1)，5ml cb溶液(200μm)，10μlh2o2(1m)和500μlnacl(0.059g ml
‑1)添加到2ml naoac/hoac缓冲液[100mm(ph 5.6或7.4)]。通过测量cb的吸收变化来研究材料的催化能力。
[0114]
超氧自由基的检测：通过epr光谱仪使用在dmso溶剂中的dmpo自旋捕获加合物对
·
o2‑
的生成进行了评估。将500μl待测样品(0.1mg ml
‑1，dmso)和25μlh2o2(1m)添加到2ml dmso中，然后添加10μl dmpo。epr测量是通过bruker epr emx plus(美国北京布鲁克科技有限公司)以9.8ghz的频率(微波功率：1mw)进行的。使用苯醌(1mg，
·
o2‑
淬灭剂)，nan3(1mg，1o2淬灭剂)和叔丁醇(0.239ml，
·
oh淬灭剂)检测自由基淬灭实验；每个样品的浓度与上述步骤一致。
[0115]
3、实验结果
[0116]
本发明分析了各刺猬状催化材料的仿氧化酶(oxd)活性，结果图15所示，可以看出，对于未掺杂fe或v的原始art m，其基本无仿oxd活性；但是，v
‑
art m和fe
‑
art m均表现出催化氧转化为ros的能力，说明v
‑
art m和fe
‑
art m具有良好的仿oxd活性，并且其中fe
‑
art m的活性优于v
‑
art m。
[0117]
本发明通过经典的3,3,5,5
‑
四甲基联苯胺(tmb)比色法进一步测试并比较了各刺猬状催化材料的仿pod活性，fe
‑
art m以与ph相关的方式表现出最佳的仿pod酶活性(图4a和图22)。然后，计算最大初始速度(v
max
)，米氏常数(k
m
)和转换数(ton，即每单位活性催化中心的最大转化底物数)的值。与v
‑
art m(v
max
＝5.14和ton＝2.73)相比，fe
‑
art m表现出更高的v
max
(v
max
＝11.51)和ton值(ton＝7.49)以及更低的k
m
(k
m
＝2.53)(图4c)，从而表明fe2n6o活性中心对h2o2的催化动力学和亲和力效率更高。
[0118]
表4：v
‑
art m和fe
‑
art m以及其他已知纳米酶的动力学常数比较
[0119][0120]
ton＝v
max
/[e]，其中[e]是整个纳米材料中金属的摩尔浓度。
[0121]
将fe
‑
art m的催化活性与已经报道的具有仿pod活性的材料(包括金属氧化物，金属纳米粒子，单原子仿酶催化剂和金属有机骨架等)进行比较，发现fe
‑
art m表现出最高的ton值(图4d，表4)。
[0122]
电子顺磁共振(epr)分析结果显示，催化过程生成的ros为
·
o2‑
，fe
‑
art m生成的
·
o2‑
量比v
‑
art m和原始art m的要高得多(图4e)，与含天然血红素的pod相似。最后，本发明通过自由基猝灭实验进一步确认了
·
o2‑
的产生(图4f)。同时，没有检测到明显的
·
oh生成，并且发现1o2源自原始的art m颗粒(图24
‑
25)。
[0123]
天然的hpo可以催化卤化物被h2o2氧化生成ocl
‑
，该催化过程可以通过cb探针检测到(催化反应示意图如图26所示)。如图4g，h和图27所示，fe
‑
art m(1.05a.u.)在ph5.6和7.4下均显示出比v
‑
art m(0.56a.u.)和原始art m(0.38a.u.)更好的催化活性。上述结果表明，本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m和v
‑
art m具有良好的仿氧化酶活性、仿过氧化物酶活性和仿卤素过氧化物酶活性，并且，其中fe
‑
art m的活性优于v
‑
art m。
[0124]
实验例4细胞毒性实验
[0125]
1、测试样品
[0126]
实施例1制得的目标产物fe
‑
art m，实施例2制得的目标产物v
‑
art m。
[0127]
2、实验方法
[0128]
小鼠成纤维细胞(l929)在有10％胎牛血清(fbs)(hyclone，美国)，2mm l
‑
谷氨酰胺和1vol.％的抗生素混合物(10,000u青霉素和10mg链霉素)中生长。将培养物保持在37℃
的5％co2湿润气氛中。用无菌pbs和0.05％胰蛋白酶/edta溶液从培养瓶中分离融合细胞。每天更换培养基，将浓度为10μg
·
ml
‑1的v
‑
art m或fe
‑
art m系统溶解在有或没有h2o2(10mm)的培养基中。
[0129]
对于活/死荧光图像，在经过不同处理的1、2和3天后，分别进行了活/死染色。为了用fda/pi染色，将0.1ml的fda工作溶液和0.03ml的pi直接添加到培养基中。将细胞在37℃染色5分钟，然后用pbs洗涤。然后立即通过荧光显微镜(dmire2，leica)观察细胞。通过用氩激光激发(激发波长492nm，发射波长520nm)来监测fda荧光，用氦氖激光激发pi正电的样品(激发波长537nm，发射波长566nm)。
[0130]
3、实验结果
[0131]
本发明通过评估待测样品与l929s细胞的生物相容性发现，fe
‑
art m和v
‑
art m对l929s细胞的毒性小，尤其是在没有h2o2的情况下。并且移除fe
‑
art m和v
‑
art m材料后细胞可以很快恢复(图28)。
[0132]
上述实验结果表明，本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m和v
‑
art m对正常细胞的毒性小，具有良好的生物相容性。
[0133]
实验例5体外抗菌实验评估对mrsa的体外灭菌性能
[0134]
1、测试样品
[0135]
实施例1制得的目标产物fe
‑
art m，实施例2制得的目标产物v
‑
art m。以万古霉素(vancomycin)为阳性对照。
[0136]
2、实验方法
[0137]
以耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(atcc 43300，革兰氏阳性)为代表的致病菌，研究本发明刺猬状催化材料的细菌捕获和根除能力。通过od
600
和最小抑菌浓度(mic)值表征抑菌性能。将含有nacl(0.15mm)和h2o2(10mm)的v
‑
art m或fe
‑
art m系统(10μg
·
ml
‑1)分别与2ml细菌悬浮液(107cfu
·
ml
‑1)在37℃下培养14h。通过uv
‑
可见光谱仪(uv
‑
3600，shimadzu)监测处理过的悬浮液的od
600
值，以研究细菌在3、6、9、12、14h的生长情况。同时，将培养的悬浮液稀释104倍并用于琼脂平板计数。通过比较不同系统的cfu与对照的cfu来评估其抗菌性能。然后，记录经系统处理的不同浓度(4、8、16、32μg
·
ml
‑1)的细菌悬液的od
600
值，以计算mic值。
[0138]
上述测试系统的细菌捕获能力和杀菌性能通过sem和荧光显微镜(dmire2，leica)可视化：用不同的样品处理后，将细菌悬浮液用2.5wt％的戊二醛固定并用乙醇/水溶液的梯度脱水。然后，获得sem图像以观察细菌捕获能力及其形态。此外，还通过live/dead baclight生存力试剂盒(用于活细胞的syto
‑
9和用于死细胞的碘化丙啶)对细菌进行了染色，以使用荧光显微镜进行观察。
[0139]
3、实验结果
[0140]
前文的实验结果证实了fe
‑
art m具有刺猬状形貌和仿pod/hpo催化活性，说明fe
‑
art m可以催化ros生成同时捕获细菌，能够用作人造巨噬细胞。本实验例进一步检测了fe
‑
art m和v
‑
art m在体外对耐药性细菌mrsa的抗菌活性(图5a)。当将受试材料与mrsa一起孵育时，fe
‑
art m+h2o2组的od
600
值不随时间推移而增加，证明了fe
‑
art m卓越的抗菌活性(图5b)。值得注意的是，如图5c所示，fe
‑
art m+h2o2的最小抑菌浓度(mic)仅为8μg/ml，接近万古霉素(4μg/ml)，远低于v
‑
art m+h2o2(32μg/ml)。
[0141]
上述实验结果表明，本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m和v
‑
art m在体外对耐药细菌mrsa具有良好的抗菌活性，并且其中fe
‑
art m的抗菌活性优于v
‑
art m。
[0142]
实验例6体内实验评估对mrsa的灭菌性能
[0143]
1、测试样品
[0144]
实施例1制得的目标产物fe
‑
art m。以万古霉素(vancomycin)为阳性对照。
[0145]
2、实验方法
[0146]
选择兔子作为动物实验的模型，并根据中国四川大学华西医院动物伦理委员会的动物伦理标准对这些动物进行实验。为了评估本发明材料对动物伤口的消毒活性，本实验例引入了mrsa来感染兔子皮肤伤口。首先，通过以下两个主要步骤制作感染的伤口模型：i)去除表皮上直径约1cm的孔；ii)引入100μl mrsa悬浮液(1
×
108cfu
·
ml
‑
1)并孵育1天。之后，加入100μlfe
‑
art m(10μg
·
ml
‑1)，10μlh2o2(0.1m)和1μl稀释盐水(0.015m)来治疗感染的伤口，记录照片和伤口大小的变化。分别以生理盐水(control)，h2o2(10mm)和万古霉素(16μg
·
ml
‑1)作为对照，将没有mrsa感染的健康兔作为标准组(normal)。
[0147]
消毒处理后，分别从不同伤口收集5μl液体，用于琼脂平板计数。15天后，切掉治疗的伤口并用10％甲醛溶液固定，以进行组织学h&e，masson和cd31染色分析。he和masson图像通过光学显微镜(dmire2，leica)拍摄。通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm，n
‑
storm&a1，尼康)拍摄cd31免疫荧光图像。
[0148]
3、实验结果
[0149]
如图5d，e和补充图24所示，在第5天，生理盐水和h2o2处理组由于mrsa的繁殖而出现严重的肿胀和化脓，而用fe
‑
art m+h2o2组和万古霉素组的伤口肿胀明显减轻，伤口尺寸明显缩小。15天后，fe
‑
art m+h2o2组和万古霉素组伤口全部愈合，而生理盐水和h2o2处理组仍保持较大的伤口，且有脓肿。
[0150]
15天后进一步通过对苏木精
‑
曙红(h&e)，masson和cd31进行染色，以检查伤口组织和主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)损伤情况，结果如图6f
‑
k和图30
‑
32所示。可以看出，对照组感染的伤口显示出广泛的坏死性多形核白细胞区域和大量的中性粒细胞(1011
±
116)，h2o2处理组也有较多的中性粒细胞(912
±
139)，而fe
‑
art m+h2o2组与万古霉素组几乎没有嗜中性粒细胞，表明fe
‑
art m+h2o2组与万古霉素组的mrsa已被根除。此外，与健康组相比，fe
‑
art m+h2o2相在主要器官中未发现损伤或异常，表明用fe
‑
art m+h2o2的方法进行皮肤消毒治疗非常安全(图30、31)。此外，从图5g，j可以看出，fe
‑
art m+h2o2(92
±
5％)组和万古霉素(96
±
2％)组的胶原蛋白占组织切片的大部分，胶原蛋白纤维均匀且规则排列，表明伤口愈合效果优良。此外，如图5h，k和图32所示，fe
‑
art m+h2o2组(109
±
12)和万古霉素组(106
±
25)中伤口血管重建后新形成的血管面积远高于对照组(22
±
5)和h2o2处理组(32
±
5)的血管面积。
[0151]
上述实验结果表明，本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料fe
‑
art m能够在体内有效地杀死mrsa并快速促进伤口愈合，其治疗效果与万古霉素相当。
[0152]
综上，本发明提供了一种具有原子催化中心的刺猬状催化材料，该材料能够通过模仿巨噬细胞的“捕获和杀死”过程来杀灭耐药细菌mrsa，可以作为一种人工巨噬细胞。本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料具有良好的仿氧化酶活性、仿过氧化物酶
活性和仿卤素过氧化物酶活性，能够用来制备高催化活性的仿酶制剂，并且，在本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料中，fe
‑
art m的催化活性优于v
‑
art m。本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料在体外对耐药细菌mrsa具有良好的抗菌活性，并且其中fe
‑
art m的抗菌活性(mic为8μg/ml)优于v
‑
art m(mic为32μg/ml)；该材料还能在体内有效地杀死mrsa并快速促进mrsa细菌感染的动物皮肤伤口愈合，并且其中fe
‑
art m的治疗效果与万古霉素相当。本发明提供的具有原子催化中心的刺猬状催化材料是一种非抗生素材料，而且具有优良的生物相容性，其能够解决抗生素滥用带来的细菌耐药问题，在制备模仿巨噬细胞的仿生材料和抗菌药物中具有广阔的应用前景。