一种提高纳米材料类过氧化物酶活性的方法

1.本发明属于复合物纳米材料领域，尤其是涉及一种提高纳米材料类过氧化物酶活性的方法。


背景技术：

2.自然界中天然存在的酶作为一种生物催化剂能够高效地参与各种反应。由于天然酶通常具有高效性、高专一性以及相对温和的反应条件，使得酶在很多领域都有广泛的运用。但是较严苛的储存和使用条件、高昂的提纯成本以及其自身的不稳定性都限制了酶催化反应的应用范围。自2004年阎锡蕴课题组(lizeng gao,et al.,nature nanotechnology,2007,2:577
‑
583)发现fe3o4纳米颗粒具有类过氧化物酶活性以来，人工模拟酶逐渐被研究者所关注。人工合成的纳米材料具有类酶活性打破了以往只有天然酶才能催化类酶反应的认知，拓宽了研究者的研究思路。而且，相比于天然酶，人工合成的无机纳米材料具有制备简单、方便储存、活性可控、适用反应条件宽等优点，大大降低了酶催化反应的实验成本和人力成本。传统天然酶易于失活和高合成纯化成本限制了其应用，新型人工材料模拟酶虽然较为稳定不易失活且合成纯化成本低，但是其活性却与天然酶有较大的差距。设计合成具有优异催化活性、低合成成本的人工模拟酶是现阶段的一个挑战。
3.现阶段的具有类酶活性的纳米材料中，大量的研究聚焦于类过氧化物酶活性材料，许多材料，比如过渡金属氧化物、贵金属、无机碳材料等都具有类过氧化物酶活性。天然过氧化物酶在酶免疫分析中有广泛的应用。四甲基联苯胺(3，3’，5，5
’‑
tetramethylbenzidine，tmb)是一种过氧化物酶的常见显色底物，在分析化学中有广泛的应用。tmb相比于其他显色底物比如联苯胺和其他联苯胺衍生物而言要具有更高的安全性和低污染性，这使得tmb逐渐成为衡量过氧化酶活性的标准底物。
4.铁蛋白(ferritin,ftn)是一种由24个亚基组成的天然球状储铁蛋白，其内部天然的空腔结构可以作为金属纳米簇的合成反应器。以ftn为基础合成的纳米酶不仅具有纳米颗粒的催化能力，同时也带有ftn自身可以高效靶向肿瘤等疾病部位的能力。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明旨在提出一种提高纳米材料类过氧化物酶活性的方法，该种方法能高效地催化tmb显色反应，并且制备方法简单，原料经济，且所使用的贵金属原料钌源可以循环使用，得到的产物相比于普通纳米材料具有明显更高的类过氧化物酶活性，能够适用于更多的测试场合。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种提高纳米材料类过氧化物酶活性的方法，通过在纳米材料中掺入微量元素钌，以提高纳米材料类过氧化物酶的活性。
8.进一步的，通过在纳米材料的表面包覆微量元素钌或在纳米材料的内部嵌入微量元素钌。
9.进一步的，微量元素钌的掺入率为0.1％
‑
100％；
10.优选的，微量元素钌的掺入率为5
‑
50％；
11.更优选的，微量元素钌的掺入率为10％
‑
40％。
12.进一步的，通过添加钌源的方式，将微量元素钌掺入到纳米材料中，钌源为水溶性钌盐；纳米材料为纳米颗粒、基团修饰的纳米颗粒、有生物活性的大分子保护的金属纳米簇中的一种。
13.进一步的，在纳米颗粒或基团修饰的纳米颗粒表面包覆微量元素钌，在有生物活性的大分子保护的金属纳米簇的内部嵌入微量元素钌。
14.进一步的，所述水溶性钌盐为三氯化钌的水合物、亚硝酰硝酸钌、氯亚钌酸铵中的任意一种；
15.生物活性大分子为蛋白或dna中的一种。
16.进一步的，纳米颗粒为fe3o4纳米颗粒；fe3o4纳米颗粒的粒径为2
‑
5000nm；优选的，fe3o4纳米颗粒的粒径为100
‑
500nm；
17.基团修饰的纳米颗粒为羧基修饰的fe3o4纳米颗粒或氨基修饰的fe3o4纳米颗粒，羧基修饰的fe3o4纳米颗粒的粒径为200
‑
1000nm，氨基修饰的fe3o4纳米颗粒的粒径为10
‑
40nm。
18.优选的，羧基修饰的fe3o4纳米颗粒的粒径为500
‑
700nm，氨基修饰的fe3o4纳米颗粒的粒径为20
‑
25nm。
19.功能团氨基或羧基修饰后的fe3o4纳米颗粒能够通过与钌元素的配位作用提高钌元素的掺入效率，节约成本。
20.进一步的，在纳米材料中掺入微量元素钌包括以下步骤：
21.(1)取纳米材料与钌源分别加入无水乙醇后，混匀，超声得混合溶液；
22.(2)向步骤(1)所得混合溶液中缓慢滴加硼氢化钠溶液，反应结束后，磁力分离沉淀，洗涤，干燥，即得掺入钌元素的纳米颗粒。
23.进一步的，步骤(1)中，纳米材料与钌源的比例为0.001
‑
1000w/w；超声时间为30
‑
60分钟；
24.步骤(2)中，反应温度为室温，反应时间为4
‑
6h，洗涤方法为无水乙醇洗涤，洗液中含有的未反应的水溶性钌盐可以循环使用；
25.进一步的，铁蛋白保护的金属纳米簇的合成包括如下步骤：
26.一、铁蛋白的合成与纯化
27.(1)通过基因工程的方法将编码重链铁蛋白的基因导入pet21a质粒中，然后将重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中；
28.(2)向大肠杆菌菌液中添加异丙基硫代半乳糖苷(iptg)从而诱导铁蛋白的表达；
29.(3)收集菌液沉淀，用磷酸缓冲盐溶液(pbs)重悬菌液并通过超声破碎的方法将铁蛋白从大肠杆菌中释放出来，离心收取上清液并水浴加热除去大量杂蛋白，水浴加热温度为60
‑
65摄氏度，水浴时间为10分钟；
30.(4)浓缩铁蛋白溶液，通过akta蛋白纯化系统进一步纯化蛋白，得到铁蛋白溶液；
31.二、铁蛋白金属纳米簇的合成
32.金、铑、钌、铱、铂纳米簇以及有微量元素钌掺入的纳米簇通过在铁蛋白内部原位
矿化的方法在铁蛋白内部合成，具体合成方法为：
33.(5)将步骤(4)中得到的铁蛋白加到pbs缓冲液中，用氢氧化钠调整体系至弱碱性；
34.(6)铁蛋白与金属离子以合适的摩尔比向铁蛋白溶液中加入金属离子溶液，搅拌反应至反应结束，去除未包载的金属离子；
35.(7)向步骤(6)中滴加硼氢化钠水溶液搅拌至反应结束得混合溶液，其中，金属离子与硼氢化钠的摩尔比为1：5；
36.(8)经浓缩和进一步的纯化即得铁蛋白保护的金属纳米簇。
37.进一步的，dna保护的金属纳米簇合成包括如下步骤：
38.(1)dna金属纳米簇的合成：采取全基因合成的方法合成目标序列的dna链或通过细胞基因组试剂盒提取目标dna；
39.(2)将得到的dna加入到缓冲溶液中，调整ph至弱碱性形成dna的溶液，向dna溶液中加入金属离子溶液，反应结束后滴加硼氢化钠溶液，其中，金属离子与硼氢化钠的摩尔比为1：5；
40.(3)经浓缩和进一步的纯化即得dna保护的金属纳米簇。
41.相对于现有技术，本发明的有益效果为：
42.(1)本发明通过在纳米材料中掺入贵金属元素钌，提高了纳米材料类过氧化物酶的活性，相比于普通纳米材料具有明显更高的类过氧化物酶活性，能够适用于更多的测试场合，满足更低检出限的需求；
43.(2)本发明所述的在纳米材料的表面包覆钌通过在常温下的还原反应制备得到，合成fe3o4纳米颗粒的方法利用溶剂热合成法，制备过程中所用材料来源经济，制备工艺简单，产率高，重复性好。
44.(3)本发明所使用的贵金属元素钌掺入到纳米材料中进行反应后，通过无水乙醇洗涤，洗液中含有的未反应的水溶性钌盐，可以重新掺入到纳米材料中进行循环使用，降低了成本。
附图说明
45.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
46.图1是本发明采用的两种不同四氧化三铁纳米颗粒xrd谱图；
47.图2是实施例1中具有类过氧化物酶特性的钌表面包覆羧基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图；
48.图3是实施例5中具有类过氧化物酶特性的钌表面包覆氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图；
49.图4是实施例1中具有高类过氧化物酶特性的钌表面包覆羧基四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图和mapping元素分析；
50.图5是铁蛋白金属纳米酶的合成及表征；
51.a)铁蛋白金属纳米酶的合成示意图；
52.b)铁蛋白和铁蛋白保护的金属纳米簇的透射电子显微镜表征图；
53.图6是铁蛋白包裹不同金属纳米簇(ru、pt、rh、au、ir、mno2)催化羟自由基产生示
意图；
具体实施方式
54.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
55.以下结合附图和具体实施例，对本发明钌包覆或掺杂纳米颗粒或纳米簇及其制备方法和应用，做出进一步说明。
56.一、通过钌包覆纳米颗粒表面提高纳米颗粒类过氧化物酶活性的方法
57.实施例1
58.(1)羧基修饰的四氧化三铁的制备：
59.称取0.54g六水合三氯化铁，加入16ml乙二醇，磁力搅拌至溶液澄清，加入1.44g无水醋酸钠和0.1g聚丙烯酸。之后将混合溶液磁力搅拌30
‑
60分钟后，加入聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，200℃反应8
‑
12h。反应结束后，磁力分离混合液体，沉淀物用乙醇洗涤3次以上，60℃真空干燥4h得到有羧基修饰的四氧化三铁，密封保存备用(记为fe3o4‑
a)。
60.(2)钌表面包覆四氧化三铁纳米颗粒粉末的制备：
61.取0.05g步骤(1)中制备的羧基修饰的四氧化三铁和0.005g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中，将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液。上述混合溶液在室温下震荡4h后，磁力分离沉淀，用无水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4h后得到钌表面包覆四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保存备用(记为fe3o4‑
a1)。
62.图2是具有类过氧化物酶特性的钌表面包覆羧基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图。透射电镜图是通过透射电子显微镜(tem)(hitachi ht7700 exalens)和高分辨透射电子显微镜(hr
‑
tem)(jeol
‑
jem
‑
2800)完成的，图2a是羧基修饰的四氧化三铁颗粒；图2b是钌表面包覆羧基修饰的四氧化三铁纳米颗粒；图2c是钌表面包覆羧基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的粒径分布图(统计自透射电镜图)，从图2c可以看出四氧化三铁纳米颗粒呈现均匀的球形，平均粒径在633nm左右。
63.实施例2
64.实施例2与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：取0.05g步骤(1)制备的羧基修饰的四氧化三铁和0.01g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中。将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液。上述混合溶液在室温下震荡4小时后，磁力分离沉淀，用无水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4小时后得到钌表面包覆四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保存备用(记为fe3o4‑
a2)。
65.实施例3
66.实施例3与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：取0.05g步骤(1)中制备的羧基修饰的四氧化三铁和0.015g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中。将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液。上述混合溶液在室温下震荡4h后，磁力分离沉淀，用无水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4小时后得到钌表面包覆四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保
存备用(记为fe3o4‑
a3)。
67.实施例4
68.实施例4与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：取0.05g步骤(1)中制备的羧基修饰的四氧化三铁和0.02g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中。将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液。上述混合溶液在室温下震荡4h后，磁力分离沉淀，用无水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4小时后得到钌表面包覆四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保存备用(记为fe3o4‑
a4)。
69.实施例5
70.(1)氨基修饰的四氧化三铁的制备：
71.称取1g六水合三氯化铁、2g无水醋酸钠和6.5g 1,6
‑
己二胺于单口烧瓶中。加入30ml乙二胺，搅拌2h得到混合溶液。将前述得到的混合溶液加入聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，200℃反应8h，反应结束后，磁力分离混合液体，沉淀物用乙醇洗涤3次以上，60℃真空干燥4h得到有氨基修饰的四氧化三铁。密封保存备用(记为fe3o4‑
n)。
72.(2)钌表面包覆四氧化三铁纳米颗粒粉末的制备：
73.取0.05g步骤(1)中制备的氨基修饰的四氧化三铁和0.01g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中。将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液。上述混合溶液在室温下震荡4h后，磁力分离沉淀，用无水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4h后得到钌表面包覆的四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保存备用(记为fe3o4‑
n1)。
74.图3是对具有类过氧化物酶特性的钌表面包覆氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图，图3a是钌表面包覆氨基修饰的四氧化三铁颗粒；图3b是图3a的局部放大图；图3c是钌表面包覆氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的粒径分布图(统计自透射电镜图)，从图3c可以看出钌表面包覆氨基四氧化三铁纳米颗粒呈现良好的分散性，平均粒径在23nm左右。
75.图4是对具有高类过氧化物酶特性的钌表面包覆羧基四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图和mapping元素分析，如图4所示，ru元素均匀地覆盖在四氧化三铁表面。
76.实施例6
77.实施例6与实施例5的制备方法基本相同，不同之处在于：取0.05g步骤(1)中制备的氨基修饰的四氧化三铁和0.015g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中。将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液，上述混合溶液在室温下震荡4h后，磁力分离沉淀，用无水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4h后得到钌表面包覆的四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保存备用(记为fe3o4‑
n2)。
78.实施例7
79.实施例7与实施例5的制备方法基本相同，不同之处在于：取0.05g步骤(1)中制备的氨基修饰的四氧化三铁和0.02g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中。将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液。上述混合溶液在室温下震荡4h后，磁力分离沉淀，用无
水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4h后得到钌表面包覆的四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保存备用(记为fe3o4‑
n3)。
80.实施例8
81.实施例8与实施例5的制备方法基本相同，不同之处在于：取0.05g步骤(1)中制备的氨基修饰的四氧化三铁和0.025g三氯化钌水合物分别分散于无水乙醇中。将四氧化三铁和三氯化钌的乙醇溶液混合后超声40分钟。在混匀条件下，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液。上述混合溶液在室温下震荡4h后，磁力分离沉淀，用无水乙醇洗涤5次，60℃真空干燥4h后得到钌表面包覆的四氧化三铁纳米颗粒粉末，密封保存备用(记为fe3o4‑
n4)。
82.对实施例1
‑
8中的纳米颗粒进行x射线粉末衍射表征。粉末衍射数据收集采用日本理学rigaku smartlab衍射仪，管电压为40kv，管电流为150ma，使用石墨的单色化的cukα射线，扫描速度为15
°
/分钟，图1是两种不同的四氧化三铁纳米颗粒的x射线衍射谱图，不同基团修饰的四氧化三铁纳米颗粒x射线衍射谱图都表现出了相同的fe3o4(jcpds file cardno.77
‑
1517)结构的特征峰。这表明两种四氧化三铁纳米颗粒的成功合成。由于ru颗粒较小，难以通过xrd谱图形式表征。图4为实施例4中具有高类过氧化物酶特性的钌表面包覆羧基四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜图和mapping元素分析，如图4所示，ru元素均匀地覆盖在四氧化三铁表面。
83.实施例9
84.对实施例1
‑
8制得的样品fe3o4‑
a1、fe3o4‑
a2、fe3o4‑
a3、fe3o4‑
a4、fe3o4‑
n1、fe3o4‑
n2、fe3o4‑
n3、fe3o4‑
n4以及样品fe3o4‑
a、fe3o4‑
n进行类过氧化物酶活性测试。
85.测试方法为：在弱酸性条件下，检测被测试样品催化过氧化氢氧化tmb生成蓝色脱氢产物的速率，该速率以产物在波长为650nm处的前1min吸光度值变化量为准。然后按照公式：计算得到纳米酶比活力b
nanozyme
(nanozymeactivity)。
86.其中v是测试时反应体系的体积(μl)；
87.ε是摩尔消光系数(m
‑
1cm
‑
1)，
88.tmb的摩尔消光系数为39000m
‑
1cm
‑
1；
89.l是测试时的光程(cm)；
90.是吸光度的变化速率。
91.测试结果如表1所示，表1是实施例1
‑
8制备的纳米颗粒样品在37℃、ph为4.5的条件下测得的纳米酶比活力值数据。
92.表1是实施例1
‑
8中具有类过氧化物酶特性的钌表面包覆四氧化三铁纳米颗粒与未处理的氨基或羧基修饰的四氧化三铁催化能力对比，以明显观察到，在相同情况下，有钌元素掺杂的四氧化三铁的催化能力要明显高于未后处理的氨基或羧基修饰的四氧化三铁纳米颗粒。且随着钌元素投料的增多，所得纳米颗粒的催化活性明显增强。
93.相比于未经过ru包覆的fe3o4‑
a，实施例1经ru包覆处理后得到的
94.fe3o4‑
a1的类过氧化物酶活性提高25.63235倍，添加钌源前0.05gfe3o4‑
a成本6.87元，添加钌源之后fe3o4‑
a1的成本为0.438元，成本仅提高7.42％；
95.表1 实施例1
‑
8制得的样品类过氧化物酶活性测试结果
[0096][0097]
相比于未经过ru包覆的fe3o4‑
a，实施例2经ru包覆处理后得到的fe3o4‑
a2的类过氧化物酶活性提高58.58824倍，成本提高12.75％；
[0098]
相比于未经过ru包覆的fe3o4‑
a，实施例3经ru包覆处理后得到的fe3o4‑
a3的类过氧化物酶活性提高66.22426倍，成本提高19.17％；
[0099]
相比于未经过ru包覆的fe3o44
‑
a，实施例4经ru包覆处理后得到的fe3o4‑
a4的类过氧化物酶活性提高78.18382倍，成本提高25.50％；
[0100]
相比于未经过ru包覆的fe3o4‑
n，实施例5经ru包覆处理后得到的fe3o4‑
n1的类过氧化物酶活性提高144.0156倍；
[0101]
相比于未经过ru包覆的fe3o4‑
n，实施例6经ru包覆处理后得到的fe3o4‑
n2的类过氧化物酶活性提高233.8307倍，成本仅提高11.50％；
[0102]
相比于未经过ru包覆的fe3o4‑
n，实施例7经ru包覆处理后得到的fe3o4‑
n3的类过氧化物酶活性提高227.3497倍成本提高23.00％；
[0103]
相比于未经过ru包覆的fe3o4‑
n，实施例8经ru包覆处理后得到的fe3o4‑
n4的类过氧化物酶活性提高191.3942倍，成本提高34.51％；
[0104]
由此可见，采用ru包覆四氧化三铁纳米颗粒可以有效提高纳米颗粒类过氧化物酶活性的方法，掺入ru的比例越高，得到产物的类过氧化物酶活性得到提升越大，但同时成本也少量上升。
[0105]
二、通过钌掺杂蛋白保护的金属簇提高蛋白金属簇类过氧化物酶活性的方法
[0106]
实施例10
[0107]
(1)铁蛋白的合成与纯化
[0108]
步骤1、通过基因工程的方法将编码重链铁蛋白的基因导入pet21a质粒中，然后将重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中。
[0109]
步骤2、向大肠杆菌菌液中添加异丙基硫代半乳糖苷(iptg)从而诱导铁蛋白的表达。
[0110]
步骤3、收集菌液沉淀，用磷酸缓冲盐溶液(pbs)重悬菌液并通过超声破碎的方法将铁蛋白从大肠杆菌中释放出来，离心收取上清液并水浴加热除去大量杂蛋白，水浴加热温度为60
‑
65℃，水浴加热时间为10分钟。
[0111]
步骤4、浓缩铁蛋白溶液，通过akta蛋白纯化系统进一步纯化蛋白。
[0112]
(2)铁蛋白金属纳米簇的合成
[0113]
取2mg铁蛋白加到10ml pbs中，用氢氧化钠调ph至弱碱性；
[0114]
铁蛋白与金属摩尔比1：250的比例向铁蛋白溶液中加入二水合氯金酸钾溶液，常温搅拌反应一个小时，去除未包载的金属离子，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠溶液，搅拌反应两个小时；进一步纯化后，记为ftn
‑
au。
[0115]
实施例11
[0116]
实施例11与实施例10的铁蛋白的合成与纯化步骤一致；
[0117]
取2mg铁蛋白加到10ml pbs中，用氢氧化钠调ph至弱碱性；以铁蛋白与金属摩尔比1：250的比例向铁蛋白溶液中加入三水合氯化铑溶液，常温搅拌反应一个小时。去除未包载的金属离子，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠，搅拌反应两个小时。进一步纯化后，记为ftn
‑
rh。
[0118]
实施例12
[0119]
实施例12与实施例10的铁蛋白的合成与纯化步骤一致；
[0120]
取2mg铁蛋白加到10ml pbs中，用氢氧化钠调ph至弱碱性；以铁蛋白与金属摩尔比1：1000的比例向铁蛋白溶液中加入氯化铱水溶液，60摄氏度搅拌反应一个小时，去除未包载的金属离子，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠，搅拌反应两个小时。进一步纯化后，记为ftn
‑
ir。
[0121]
实施例13
[0122]
实施例13与实施例10的铁蛋白的合成与纯化步骤一致；
[0123]
取2mg铁蛋白加到10ml pbs中，用氢氧化钠调ph至弱碱性；以铁蛋白与金属摩尔比1：2000的比例向铁蛋白溶液中加入四氯铂酸钾水溶液，60摄氏度搅拌反应一个小时，去除未包载的金属离子，以金属与硼氢化钠1：5的摩尔比向铁蛋白溶液中滴加硼氢化钠，搅拌反应两个小时。进一步纯化后，记为ftn
‑
pt。
[0124]
实施例14
[0125]
实施例14与实施例10的制备方法基本相同，不同之处在于向铁蛋白溶液中加入的金属离子溶液包含氯金酸钾二水合物和三氯化钌水合物，产物记为ftn
‑
auru。
[0126]
实施例15
[0127]
实施例15与实施例10的制备方法基本相同，不同之处在于向铁蛋白溶液中加入的金属离子溶液包含三水合氯化铑和三氯化钌水合物，产物记为ftn
‑
rhru。
[0128]
实施例16
[0129]
实施例16与实施例10的制备方法基本相同，不同之处在于向铁蛋白溶液中加入的金属离子溶液包含氯化铱和三氯化钌水合物，产物记为ftn
‑
irru。
[0130]
实施例17
[0131]
实施例17与实施例10的制备方法基本相同，不同之处在于向铁蛋白溶液中加入的金属离子溶液包含四氯铂酸钾和三氯化钌水合物，产物记为ftn
‑
ptru。
[0132]
实施例18
[0133]
对本发明实施例10
‑
17制得的样品ftn
‑
auru、ftn
‑
rhru、ftn
‑
irru、ftn
‑
ptru、ftn
‑
au、ftn
‑
rh、ftn
‑
ir、ftn
‑
pt进行类过氧化物酶活性测试，测试方法为：在弱酸性条件下，检测被测试样品催化过氧化氢氧化tmb生成蓝色脱氢产物的速率，该速率以产物在波长为650nm处的前1min吸光度值变化量为准。然后按照公式计算得到纳米酶比活力b
nanozyme
(nanozymeactivity)。
[0134]
其中v是测试时反应体系的体积(μl)；
[0135]
ε是摩尔消光系数(m
‑
1cm
‑
1)；
[0136]
tmb的摩尔消光系数为39000m
‑
1cm
‑
1；
[0137]
l是测试时的光程(cm)；
[0138]
是吸光度的变化速率。
[0139]
表2 实施例10
‑
17制得的样品的类过氧化物酶活性测试结果
[0140]
[0141]
表2中的样品的类过氧化物酶活性测试在37摄氏度、ph为4.5条件下进行测定，得到纳米酶比活力值数据，如表2所示，对具有类过氧化物酶特性的钌掺杂的铁蛋白保护的金属纳米簇与未掺杂钌元素的样品催化能力对比，在相同情况下，钌元素的掺入极大程度地提高了铁蛋白保护的金属纳米簇的类过氧化物酶活性，且随着钌元素含量的增多，所得蛋白金属纳米簇的催化活性明显增强。
[0142]
钌表面包覆四氧化三铁和钌元素掺杂的金属簇均具有较高的类过氧化物酶特性，能够催化显色反应进行过氧化氢检测或反应过程中产生的过氧化氢检测。前述钌元素的掺入能够大幅度提高纳米颗粒过氧化物酶活性基于以下原理：
[0143]
(1)基于金属的价键理论，过渡金属的非键轨道上有一部分空的d轨道，d％指的是在成键轨道中，d轨道所占的百分数。d％越大，成键轨道中占用的d轨道越多，d空穴越少。
[0144]
(2)基于金属能带理论，在形成金属键时，s能带和d能带部分发生重叠，使得d能带的部分电子转移到s能带中，从而在d带出现了空穴。
[0145]
金属的d空穴百分数与化学吸附及催化活性之间有某种必然联系，实践表明，现有高活性的金属催化剂要求d％在40
‑
50之间，表3中列出了常见过渡金属的d％和d空穴。
[0146]
表3 常见过渡金属的d％和d空穴
[0147]
金属crmnfeconicumotcrud空穴4
‑
53
‑
52
‑
31
‑
30
‑
20
‑
14
‑
53
‑
42
‑
3d％3940.139.739.54036434650金属rhpdagwreosirptaud空穴1
‑
20
‑
20
‑
14
‑
63
‑
52
‑
41
‑
30
‑
10
‑
1d％3940.139.739.54036434650
[0148]
对于本文提到的类过氧化酶催化反应，其反应机理为：
[0149][0150][0151]
体系中催化剂催化羟自由基产生的步骤是速率决定步骤，前期实验(图6)表明ru催化剂在产生羟自由基方面具有绝对的优势。
[0152]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。