一种低共熔溶剂及其制备方法和在提取刺五加中异嗪皮啶中的应用

1.本发明涉及异嗪皮啶的提取技术领域，尤其涉及一种低共熔溶剂及其制备方法和在提取刺五加中异嗪皮啶中的应用。


背景技术：

2.刺五加是一种被广泛使用的传统中草药，一直被用作功能性食品及制成各种药物制剂，在传统中医理论中，刺五加可以补气、健脾、养肾、补充身体活力，刺激食欲并改善记忆力。在过去的几十年中，全世界的研究人员对刺五加进行了大量的化学、药理和临床研究，发现刺五加对心血管、中枢神经和免疫系统具有药理作用，具有抗应激、抗溃疡、抗辐射、抗癌、抗炎和保肝等作用。研究发现刺五加中含有多种化合物，其中，紫丁香苷、刺五加苷e和异秦皮啶是刺五加的主要药理活性成分，其提取物已被用于治疗严重疾病后的恢复。
3.刺五加中各成分具有性质差异，根据不同的成分应用不同的提取、纯化及分析方法，传统的提取方法为有机溶剂提取法，通过相似相溶的原理，利用不同浓度的乙醇等有机溶剂对刺五加中不同成分进行提取，然而这种提取方法专属性不强，所得提取物成分复杂，收率不高。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种低共熔溶剂及其制备方法和在提取刺五加中异嗪皮啶中的应用，本发明提供的溶剂可以对刺五加中异嗪皮啶进行有效提取，提高异嗪皮啶的收率。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种低共熔溶剂，由氯化胆碱、酸和水制备得到；所述酸为柠檬酸或苹果酸；所述氯化胆碱、酸和水的用量比为(1～2)mol:2mol:(200～400)ml。
7.优选的，当所述酸为柠檬酸时，所述氯化胆碱、酸和水的用量比为(1～2)mol:2mol:(200～400)ml。
8.优选的，当所述酸为苹果酸时，所述氯化胆碱、酸和水的用量比为2mol:2mol:(200～400)ml。
9.本发明提供了上述方案所述低共熔溶剂的制备方法，包括以下步骤：将氯化胆碱、酸和水混合，将所得混合液在80～90℃条件下搅拌1.5～2h，形成低共熔溶剂。
10.优选的，所述搅拌的速率为200～500r/min。
11.本发明提供了上述方案所述低共熔溶剂或上述方案所述制备方法制备得到的低共熔溶剂在提取刺五加中异嗪皮啶中的应用。
12.优选的，所述应用的方法包括以下步骤：
13.将刺五加粉末与低共熔溶剂混合，进行超声破壁处理，然后于水浴条件下进行搅拌，得到初提取液；
14.将所述初提取液进行离心，得到上清液；
15.将所述上清液进行过滤，得到含异嗪皮啶的提取液。
16.优选的，所述超声破壁处理的功率为400～600w，时间为5～10min；所述水浴的温度为80～100℃，时间为1.5～3h。
17.优选的，所述刺五加粉末的制备方法包括：将刺五加在80～100℃干燥1～2h，然后粉碎过80～100目筛，将所得筛下物在80～100℃烘烤1～2h。
18.优选的，所述刺五加粉末与低共熔溶剂的用量比为1g：(10～20)ml。
19.本发明提供了一种低共熔溶剂，由氯化胆碱、酸和水制备得到；所述酸为柠檬酸或苹果酸；所述氯化胆碱、酸和水的用量比为(1～2)mol:2mol:(200～400)ml。
20.本发明的低共熔溶剂可以对刺五加中异嗪皮啶进行有效提取，提高异嗪皮啶的收率。实施例的结果表明，采用本发明的低共熔溶剂对刺五加中异嗪皮啶进行提取，相比乙醇提取，具有更高的收率。
附图说明
21.图1为异嗪皮啶标准品色谱图。
具体实施方式
22.本发明提供了一种低共熔溶剂，由氯化胆碱、酸和水制备得到；所述酸为柠檬酸或苹果酸；所述氯化胆碱、酸和水的用量比为(1～2)mol:2mol:(200～400)ml。
23.在本发明中，当所述酸为柠檬酸时，所述氯化胆碱、酸和水的用量比优选为(1～2)mol:2mol:(200～400)ml，更优选为2mol:2mol:(200～400)ml，进一步优选为2mol:2mol:200ml。
24.在本发明中，当所述酸为苹果酸时，所述氯化胆碱、酸和水的用量比优选为2mol:2mol:(200～400)ml，更优选为2mol:2mol:200ml。
25.在本发明中，所述酸优选为柠檬酸；所述水优选为超纯水。
26.本发明提供了上述方案所述低共熔溶剂的制备方法，包括以下步骤：将氯化胆碱、酸和水混合，将所得混合液在80～90℃条件下搅拌1.5～2h，形成低共熔溶剂。
27.本发明对所述混合的过程没有特殊要求，能够将各原料混合均匀即可。
28.本发明优选在80℃搅拌2h。本发明优选采用磁力搅拌。在本发明中，所述搅拌速率优选为200～500r/min，更优选为500r/min。本发明优选在恒温水浴条件下进行搅拌。
29.本发明采用恒温加热磁力搅拌法制备低共熔溶剂，该法灵敏度高、可控性强、操作简单、加热速度快、溶液温度均匀稳定、搅拌效率高，符合绿色化学指导原则。
30.本发明提供了上述方案所述低共熔溶剂或上述方案所述制备方法制备得到的低共熔溶剂在提取刺五加中异嗪皮啶中的应用。
31.在本发明中，所述应用的方法优选包括以下步骤：
32.将刺五加粉末与低共熔溶剂混合，进行超声破壁处理，然后于水浴条件下进行搅拌，得到初提取液；
33.将所述初提取液进行离心，得到上清液；
34.将所述上清液进行过滤，得到含异嗪皮啶的提取液。
35.本发明将刺五加粉末与低共熔溶剂混合，进行超声破壁处理，然后于水浴条件下进行搅拌，得到初提取液。
36.在本发明中，所述刺五加粉末的制备方法优选包括：将刺五加在80～100℃干燥1～2h，然后粉碎过80～100目筛，将所得筛下物在80～100℃烘烤1～2h，更优选将刺五加在80℃干燥1h，然后粉碎过80目筛，将所得筛下物在80℃烘烤2h。本发明通过烘烤除去自由水，保证后续提取率的计算。
37.在本发明中，所述刺五加粉末与低共熔溶剂的用量比优选为1g：(10～20)ml，更优选为1g：20ml。
38.在本发明中，所述刺五加粉末与低共熔溶剂的混合优选为涡旋混合，所述涡旋混合的时间优选为2min。
39.在本发明中，所述超声破壁处理的功率优选为400～600w，更优选为500w，时间优选为5～10min，更优选为5min；本发明通过超声破壁处理提高异嗪皮啶的溶出量。
40.在本发明中，所述水浴的温度优选为80～100℃，更优选为80℃，时间优选为1.5～3h，更优选为2h。本发明对所述搅拌的速率没有特殊要求，采用本领域熟知的搅拌速率即可。本发明通过在80℃水浴条件下搅拌2h使溶质和提取介质充分混匀，促使异嗪皮啶溶出。
41.得到初提取液后，本发明将所述初提取液进行离心，得到上清液。在本发明中，所述离心的转速优选为10000rpm，所述离心的时间优选为10min。本发明通过离心除去不溶性杂质，获得上清液。
42.得到上清液后，本发明将所述上清液进行过滤，得到含异嗪皮啶的提取液。
43.本发明优选采用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤。本发明通过过滤除去粒径较大的杂质，防止后续测异嗪皮啶的含量时堵塞色谱柱。
44.本发明所述含异嗪皮啶的提取液中除了含有异嗪皮啶之外，还含有多种刺五加的提取物，本领域技术人员可根据实际需求选择对所述含异嗪皮啶的提取液进行纯化，本发明对此不做特殊限定。
45.下面结合实施例对本发明提供的低共熔溶剂及其制备方法和在提取刺五加中异嗪皮啶中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
46.实施例1
47.精密称取氯化胆碱、柠檬酸各0.2000mol、超纯水20ml，放入搅拌子充分混合；将所得混合液采用80℃水浴进行恒温水浴加热，同时以500r/min的速度搅拌2h，制成低共熔溶剂。
48.应用例1
49.提取刺异嗪皮啶的方法，步骤如下：
50.a、采集刺五加样本并在空气中干燥后将样品置于烘箱中，在80℃干燥1小时，粉碎后过80目筛，随后在80℃的烘箱中烘烤2小时，得到刺五加粉末；
51.b、取刺五加粉末1.0g至锥形瓶中，加实施例1的低共熔溶剂20.00ml，涡旋2min后超声破壁处理5min，于80℃的水浴中搅拌2小时，得到初提取液；
52.c、取初提取液离心10min，离心后精密吸取上清液1ml，置于100ml容量瓶中，用超纯水稀释定容，混匀，过0.22μm微孔滤膜过滤，得到含异嗪皮啶的提取液。
53.实施例2
54.精密称取氯化胆碱、苹果酸各0.2000mol、超纯水20ml，放入搅拌子充分混合；将所得混合液采用80℃水浴进行恒温水浴加热，同时以500r/min的速度搅拌2h，制成低共熔溶剂。
55.应用例2
56.与应用例1的不同之处仅在于采用实施例2制备的低共熔溶剂进行提取。
57.实施例3
58.精密称取氯化胆碱0.1000mol、柠檬酸0.2000mol、超纯水20ml，放入搅拌子充分混合；将所得混合液采用80℃水浴进行恒温水浴加热，同时以500r/min的速度搅拌2h，制成低共熔溶剂。
59.应用例3
60.与应用例1的不同之处仅在于采用实施例3制备的低共熔溶剂进行提取。
61.实施例4
62.精密称取氯化胆碱0.2000mol、柠檬酸0.2000mol、超纯水40ml，放入搅拌子充分混合；将所得混合液采用80℃水浴进行恒温水浴加热，同时以500r/min的速度搅拌2h，制成低共熔溶剂。
63.应用例4
64.与应用例1的不同之处仅在于采用实施例4制备的低共熔溶剂进行提取。
65.实施例5
66.精密称取氯化胆碱0.2000mol、柠檬酸0.2000mol、超纯水20ml，放入搅拌子充分混合；将所得混合液采用80℃水浴进行恒温水浴加热，同时以500r/min的速度搅拌2h，制成低共熔溶剂。
67.应用例5
68.与应用例1的不同之处在于采用实施例5的低共熔溶剂进行提取，低共熔溶剂的用量为10ml。
69.对比例
70.与应用例1的不同之处在于采用70％乙醇进行提取。
71.测试：
72.采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法(u hplc
‑
esi
‑
orbitrap
‑
ms/ms)对应用例1～5及对比例获得的含异嗪皮啶的提取液进行检测，测试异嗪皮啶的含量。具体步骤如下：
73.a、异嗪皮啶提取液利用u hplc
‑
esi
‑
orbitrap
‑
ms/ms测定，异嗪皮啶质谱数据利用compound discoverer3.1
tm
软件鉴定。
74.色谱条件：
75.样品的化学成分用dionex ultimate 3000高效液相色谱仪分离。色谱仪由真空排气系统、泵系统、带温度控制系统的样品盘、自动进样器、色谱柱、柱温控制系统和dad检测器组成。该仪器与t hermo scientific hypersil gold aq(2.1mm
×
100mm，1.9μm)色谱柱(c18，4.6
×
150mm，5μm)联合使用。色谱条件如下：甲酸水(0.1％，v/v)和甲酸性乙腈(0.1％，v/v)分别为流动相a和b。洗脱梯度程序：0～2分钟，5％b；2～42分钟，5～95％b；42～47分钟，95％b；47.1分钟，5％b；47.1～50分钟，5％b。梯度流速保持在0.3ml
·
min
‑1，柱温40℃，进样量5μl。
76.质谱条件：
77.高分辨质量光谱参数设置如下：鞘气压力，40psi；辅助气体压力为20psi；吹扫气压力10psi；毛细电压，3kv；离子传输管温度为320℃。aug气体加热温度350℃；碰撞气体：氮气；归一化碰撞能量20、40、60ev；rf镜头振幅场强(s
‑
lens)：60。结合选择一次质谱全扫描自动触发二次质谱扫描模式(fullms
‑
ddms2)。分辨率：一级和二级高分辨率质谱分辨率分别为：70000f whm/17500f whm；离子扫描范围，m/z 50～1500；循环计数：3次；四级隔离窗，1.5m/z；动态排除时间5秒。
78.b、精密称取异嗪皮啶标准品2mg，置于10ml容量瓶，加甲醇稀释定容，制得0.2mg/ml的异嗪皮啶标准储备液。取异嗪皮啶标准储备液适量，以甲醇稀释制得浓度为0.007mg/ml、0.005mg/ml、0.003mg/ml、0.002mg/ml和0.001mg/ml的标准溶液。摇匀，按步骤a方法进行uhplc
‑
esi
‑
orbitrap
‑
ms/ms测定峰面积；所得异嗪皮啶标准品的色谱图如图1所示，图1中右上角为提取离子的质核比。
79.c、取步骤b测得的异嗪皮啶标准品溶液色谱峰面积，计算回归方程及线性系数；得y＝10060867517.63x+19976535.05,r2＝0.9812，其中，x为浓度，y为峰面积；以峰面积对浓度采用最小二乘法进行线性拟合，进行线性范围与回归分析。
80.d、取步骤b测得的异嗪皮啶标准品溶液色谱峰面积，计算得异嗪皮啶定量限为27.6407ng/ml。
81.e、取步骤b测得的异嗪皮啶标准品溶液色谱峰面积进行精密度考察，以重复性试验考察方法精密度，在0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.002mg/ml范围内异嗪皮啶标准品溶液浓度实测值为0.1083
±
0.0021mg/ml、0.0115
±
0.00017mg/ml、0.0019
±
0.00004mg/ml，rsd％值分别为1.93％、1.47％、2.11％，结果均在限定范围内，系统误差不影响实验测定结果。该方法精密度良好。
82.f、步骤a完成后，取步骤b异嗪皮啶标准品溶液0.2mg/ml、0.01mg/ml、0.002mg/ml，测试在不同浓度下的空白回收率和加样回收率，考察方法准确度。结果显示，浓度为0.2mg/ml的空白回收率为85.7％，加样回收率为93.1％；浓度为0.01mg/ml的空白回收率为90.0％，加样回收率为82.1％；浓度为0.002mg/ml的空白回收率为87.2％，加样回收率为80.7％，异嗪皮啶回收率实验结果均在80％～100％内，该检测方法准确度良好。
83.g、利用步骤c测得回归方程，计算提取液中异嗪皮啶含量。应用例1～5及对比例中异嗪皮啶含量结果见表1。
84.表1异嗪皮啶含量
[0085][0086]
由表1的结果可知，采用本发明的低共熔溶剂提取刺五加中异嗪皮啶相比乙醇具有更高的提取率。
[0087]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。