双深度热塑性微流体装置及相关系统和方法与流程

本发明涉及液体活检、用于固相提取生物标记(例如细胞外囊泡和核酸分析物)的微流体装置，和生物标记样品制备的领域。

背景技术：

1、液体活检利用在体液(例如尿液、脑脊液、血液或唾液等)中发现的疾病相关生物标记；并且提供了优于传统固体组织活检的多种优势力。液体活检创伤小，痛苦少，容易获得。例如，简单的抽血将优于需要将针插入骨中以取出骨髓组织的骨髓活检。液体活检将允许对转移部位进行频繁取样和改善对疾病进展的监测。

2、在液体活检样品(例如血液)中发现的生物标记包括循环肿瘤细胞(circulatingtumor cell，ctc)、细胞外囊泡(extracellular vesicle，ev)和核酸分析物(例如无细胞dna(cell free dna，cfdna))。从肿瘤细胞释放的生物标记具有疾病的重要特征，包括突变、拷贝数变异、甲基化改变和/或染色体重排。这些生物标记可用于监测疾病进展或定制个性化治疗方案。具体地，在某些生物标记中发现的遗传信息可以提供疾病的分子表征以实现精准医疗。

3、然而，对生物标记(例如ctc、ev和cfdna)的分离具有挑战性。检测到的ctc丰度相对较低(1-100/ml血液)，其丰度在疾病早期中极低。关于cfdna，循环肿瘤dna(circulatingtumor dna，ctdna)可占总cfdna含量的约0.01％。短片段大小的cfdna群体(70-300bp)通常也难以分离。此外，尽管ev以高丰度存在(1ml血浆中有107-1012个ev，在患病患者中其数量有所增加)，但是ev携带的分子货物的量是有限的，因为许多ev的体积小。例如wei等(“自然通讯”，nature communications,2017,8,1145.)发现单个ev携带约4.45ag的trna，而且只有1.9％的trna与mrna相关。

4、用于分离ctc、ev和cfdna的现有的微流体装置缺乏在高通量系统中的可操作性，并且缺乏与机器人流体工作站的高度集成。原型机通常局限于使用注射泵和毛细管连接来泵送液体的按比例缩小(scaled down)的工艺，并且由熟练技术人员手动操作。例如，先前由campos等(lab chip.2018november 06；18(22):3459–3470)描述的用于分离cfdna的微流体芯片由一个或多个具有不同排列的微柱床组成，这些不同的排列包括改变的床大小、床数目以及微柱的间隔和大小。然而，此类装置要么使用需要管道和毛细管连接的注射泵来进行测试，要么仅仅通过dna回收的蒙特卡罗模拟(monte carlo simulation)来运行。先前描述的微流体芯片在商业环境中的应用和集成到更大的系统中，在可操作性、分析物回收和产量方面都提出了挑战。

5、仍然需要对微流体分离平台进行改进，使其用于捕获生物标记，可以与高通量系统集成，同时提供显著的分析物回收。

技术实现思路

1、本公开的主题描述了一种双深度热塑性微流体装置，包括：热塑性基底，其包括入口通道、出口通道、分叉通道和一个或多个包括多个微柱的分离床，其中一个或多个分离床通过分叉通道连接至入口通道和出口通道；其中每个微柱的高度在约40μm至约60μm的范围内，宽度在约5μm至约15μm的范围内；其中至少一部分的微柱间隔约5μm至约15μm；其中分叉通道的横截面的高度在约40μm至约60μm的范围内；其中入口通道的横截面的高度在约40μm至约500μm的范围内，宽度在200μm至约500μm的范围内；其中出口通道的横截面的高度在约40μm至约500μm的范围内，宽度在200μm至约500μm的范围内；其中每个入口通道和出口通道的纵横比为约1∶4至约4∶1；其中入口通道、出口通道、分叉通道和一个或多个分离床是单一的双深度流体层。

2、在一些实施例中，热塑性基底是环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚碳酸酯(pc)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚苯乙烯(ps)、聚氯乙烯(pvc)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(petg)。在一些实施例中，热塑性基底是环烯烃共聚物(coc)。在一些实施例中，入口通道的横截面和出口通道的横截面各自具有矩形的形状或梯形的形状。在一些实施例中，入口通道的一部分横截面和出口通道的一部分横截面各自不具有半圆形或三角形的横截面。在一些实施例中，微柱包括捕获元件。在一些实施例中，捕获元件是抗体、抗体的抗原结合片段或者适配体。在一些实施例中，捕获元件是表面结合的富氧部分，例如羧酸基团、水杨酸酯或酯。在一些实施例中，微柱是uv(紫外线)激活的。在一些实施例中，微柱是uv/o3激活的。

3、本公开的主题描述了一种试剂盒，包括本文描述的双深度热塑性微流体装置，和至少一种试剂或缓冲液，该试剂盒用于使用双深度热塑性微流体装置处理液体样品。

4、本公开的主题描述了一种微流体系统，包括：本文描述的双深度热塑性微流体装置，其中该双深度热塑性微流体装置还包括入口端口以及与其连通的出口端口；第一自动移液通道，包括第一泵和耦接至入口端口的第一移液管吸头；第二自动移液通道，包括第二泵和耦接至出口端口的第二移液管吸头；和与第一泵和第二泵通信的非暂时性计算机可读介质，其被编程以命令第一自动移液通道的第一泵和第二自动移液通道的第二泵控制液体通过双深度热塑性微流体装置的流动。

5、本公开的主题描述了一种从液体样品中分离核酸分析物的方法，包括：提供本文描述的双深度热塑性微流体装置，其中微柱包括选择性结合核酸分析物的捕获元件；控制液体样品通过双深度热塑性微流体装置的流动；和将核酸分析物结合至捕获元件上，从而从液体样品中分离核酸分析物。

6、在一些实施例中，该方法包括提供本文描述的系统，以控制液体样品通过双深度热塑性微流体装置的流动。在一些实施例中，该方法包括提供注射泵以控制液体样品通过双深度热塑性微流体装置的流动。在一些实施例中，核酸分析物是无细胞dna(cfdna)、循环肿瘤dna(ctdna)、基因组dna(gdna)或rna。在一些实施例中，捕获元件是表面结合的羧酸基团，以及该方法包括控制与固定缓冲液混合的液体样品通过双深度热塑性微流体装置的流动。在一些实施例中，液体样品∶固定缓冲液的混合比例是1∶3。在一些实施例中，固定缓冲液包括盐和中性聚合物。在一些实施例中，固定缓冲液包括盐、中性聚合物和有机溶剂。在一些实施例中，固定缓冲液包括3％ peg、0.5m nacl和63％ etoh。在一些实施例中，固定缓冲液包括5％ peg、0.4m nacl和63％ etoh。在一些实施例中，液体样品是血液或其任何级分或组分、脑脊液、尿液、痰、唾液、胸膜积液、粪便和精液。在一些实施例中，液体样品是血浆。在一些实施例中，入口通道的横截面的高度在约225μm至约275μm的范围内，宽度在约375μm至约425μm范围内；和出口通道的横截面的高度在约225μm至约275μm的范围内，宽度在约375μm至约425μm的范围内。在一些实施例中，大于80％或大于90％的大小为50-750bp的核酸片段被分离和回收。在一些实施例中，大于70％的大小为50-750bp的核酸片段被分离和回收。

7、本公开的主题描述了一种从液体样品中分离细胞外囊泡的方法，包括：提供本文描述的双深度热塑性微流体装置，其中微柱包括选择性结合细胞外囊泡的捕获元件；控制液体样品通过双深度热塑性微流体装置的流动；和将细胞外囊泡结合至捕获元件上，从而从液体样品中分离细胞外囊泡。

8、在一些实施例中，该方法包括提供本文描述的系统以控制液体样品通过双深度热塑性微流体装置的流动。在一些实施例中，该方法包括提供注射泵以控制液体样品通过双深度热塑性微流体装置的流动。在一些实施例中，细胞外囊泡是外泌体。在一些实施例中，捕获元件是抗体、抗体的抗原结合片段或者适配体。在一些实施例中，捕获元件是单克隆抗体。在一些实施例中，捕获元件特异性地结合常见的外泌体标记。在一些实施例中，捕获元件特异性地结合疾病相关标记。在一些实施例中，捕获元件通过单链寡核苷酸双功能可切割连接子或光可切割连接子固定至微柱上。在一些实施例中，捕获元件通过表面结合的羧酸基团固定至微柱上。在一些实施例中，液体样品是血液或其任何级分或组分、骨髓、胸膜液、腹膜液、脑脊液、尿液、唾液、羊水、腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、母乳、汗液、泪液、关节液和支气管洗液。在一些实施例中，液体样品是血浆。在一些实施例中，入口通道的横截面的高度在约225μm至约275μm的范围内，宽度在约375μm至约425μm的范围内；和出口通道的横截面的高度在约225μm至约275μm的范围内，宽度在约375μm至约425μm的范围内。在一些实施例中，该方法还包括控制缓冲液通过双深度热塑性微流体装置的流动。在一些实施例中，缓冲液包括溶于pbs的牛血清白蛋白(bsa)、溶于pbs的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)-40或聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯。在一些实施例中，该方法还包括细胞外囊泡裂解、rna纯化、rna提取、逆转录和mrna表达谱分析。在一些实施例中，该方法还包括获得特有的mrna谱图，该mrna谱图指示细胞外囊泡起源的细胞的表型。在一些实施例中，该方法还包括细胞外囊泡释放和纳米颗粒跟踪分析。在一些实施例中，该方法还包括细胞外囊泡释放和透射电子显微镜分析。