用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片系统及检测方法

1.本发明属于光谱/质谱检测设备和分析技术领域，特别涉及一种用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片、系统及检测方法。


背景技术：

2.近些年，激光诱导荧光检测器(laser induce fluorescence，lif)作为新兴光谱检测技术，具有高测量信噪比、高时空分辨率、高通量信息采集等优势，已成为测量荧光寿命、量子脉冲频道等参数的重要检测手段。用于痕量元素检测的电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry，icp-ms)具有高灵敏度、低检出限、宽检测范围等优势，已于生物、化学、分析、医疗、材料等领域中扮演快速高效的元素检测的手段。作为一种新兴技术，微流控制芯片由于其高度集成化、低样品消耗量、流体精密控制等优势，使其在药物筛选、体外器官开发、单细胞分析中扮演重要角色。分析同种细胞中不同的单个细胞之间的异质性，对鉴别亚组多样性、分析表型差异性、研究药物特异性和个性化治疗具有长远意义。因此单细胞分析已成为近年来生物化学医疗领域的研究重点和热点领域。
3.癌症，即恶性肿瘤，已成为破坏人体组织器官的结构和功能的重大疾病，其治愈率极低，致死率极高，对人类生命健康构成极大威胁。部分器官病灶的恶性肿瘤细胞会表达蛋白酪氨酸激酶-7(protein-tyrosine kinase 7,ptk7)，它是一种缺乏催化活性的受体蛋白酪氨酸激酶，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，如急性髓细胞性白血病、结肠癌、肺癌和食管鳞状细胞癌等。研究表明ptk7蛋白的表达与肿瘤的发生和转移存在着密不可分的联系，而肿瘤转移是导致了癌症患者死亡的首要因素。目前癌症治疗的主要手段是通过抗癌药物进行化疗和放疗，其中奥沙利铂(oxaliplatin,oxa)作为新一代铂类抗肿瘤药物，对于多种癌症都表现出广谱的抗肿瘤活性作用，更能抑制ptk7的表达，从而降低恶性肿瘤细胞转移的可能性。因此研究不同肿瘤病症中oxa的剂量与ptk7的表达关系非常重要，但目前基于微流控制芯片与lif和icpms联用来同时在线检测单个肿瘤细胞的ptk7蛋白表达情况和oxa药物剂量的互作还鲜有报道。因此，设计一种能同时高通量在线评价单细胞二维表型分析的微流控制芯片-光谱/质谱系统对于阐明不同种类单细胞中金属抗癌药物对相关蛋白表达的影响非常关键。
4.目前，基于icpms或lif的在线单细胞检测方法的进样方式主要有细胞悬浮液直接进样、单细胞液滴/激光剥蚀进样、微流控/介观流控模块进样。然而这些方式在实际应用中均存在一定问题：
5.细胞悬浮液进样，通常将暴露于药物的细胞经过处理到所需浓度，采用注射泵或蠕动泵推进，通过常规商用雾化装置被引入检测器中，使得单个细胞在仪器检测的一个积分时间内被检测器检测到。随后利用统计学方法，处理所得的单细胞数据，在单个细胞分辨率本身下进行元素分析。该方法简便快捷直接，但传统细胞悬浮液进样的随机分布和随机分散性使得增加同一时间内检测到多个细胞的可能性，对于准确的单细胞检测提出了巨大
挑战，甚至在一定程度上违背了单细胞检测的初衷。
6.单细胞液滴/激光剥蚀进样，通过液滴或包埋实现单细胞之间区分。前者通过水-油两相无法互溶的原理，并通过调节细胞密度和两相流速，实现油相包裹水相，从而形成单液滴中含有单个细胞；后者通过石蜡或相关溶剂对生长于基底上的单个细胞进行包埋，使细胞在保留原本元素分布的同时实现硬化，利用高精度激光聚焦于所需样品表面使之气化，此时载气则会将气化的样品颗粒带入后续检测器中进行分析。然而，前者需要极为精密的油水两相流体条件控制才能实现单细胞封装，封装效率和检测效率较低，成本较高，对于实验稳定性、数据重现性、应用广泛性都造成严重的挑战；后者则因其不易制备标准品，需要特殊的单细胞制样设备，且样品稳定性无法得到保证，这都限制了其高通量、高效地单细胞定量检测。
7.微流控/介观流控模块进样，通过特有的管道设计或结构组装实现单细胞聚焦排列。二者分别通过软光刻技术和组装现有的微模块，制备得到可以实现单细胞排列的水平或螺旋微通道，利用惯性效应或二次流效应，可以将散乱的细胞悬浮液充分聚焦排列，以实现高通量单细胞束的操作和进样。然而，目前微流控/介观流控模块进样具有如下劣势：(1)需要较高的流速才能达到细胞聚焦的目的，这样的细胞聚焦过程会使细胞遭受较大的剪切力，可能会破坏细胞表面或内部的相关蛋白或探针，从而影响准确的单细胞定量分析；(2)螺旋通道外圈曲率较内圈小，这样会显著降低二次流效应以减弱单细胞排列效果；(3)此外商用的介观流控模块由于材质原因，无法对单细胞聚焦过程进行全方位的可视化评价，对高通量单细胞排列研究造成了一定影响；(4)冗长复杂的离心清洗过程，不仅对细胞样品造成不可避免的损失，还极有可能对细胞造成损伤。
8.最重要的是，上述单细胞分析方法无法在线、高通量、快速地完成同一个细胞的二维数据采集，上述问题极大地制约了在单细胞分辨率下高通量地评价药物剂量对不同细胞中的肿瘤标志物表达的相关表型分析。


技术实现要素：

9.针对现有基于lif和icpms的单细胞分析技术中存在的问题，本发明提供一种能够将细胞悬浮液转化成有序的单细胞束的微流控制芯片，并基于该微流控制芯片提出了一种可以同时匹配lif和icpms进行单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统，或者说高效微流控进样分析系统，及使用该系统进行检测的方法。所述系统的主要部分为一枚简易制造、经济友好的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，pdms)制备的微流控制芯片。通过将胰酶消化等方式制备的细胞悬浮液直接从进口处注入微流控制芯片，基于特殊设计的具有持续高曲率结构的微流控螺旋管道实现超温和流体条件下的高效单细胞聚焦；接着基于流体水动力过滤效应，单细胞通过微米级样品纯化通道快速地完成样品纯化过程，无需复杂的额外离心清洗步骤；单细胞束在极细的水平通道中保持稳定的细胞排列，并被垂直于通道下方的lif采集每个单细胞表面特定蛋白表达的荧光数据；通过水平进样结构(水平采样接口)，可以避免传统垂直插管进样方式，在不打乱单细胞束的情况下引入商用微量雾化系统和icpms中，实现超过90％的细胞检测效率，保证高通量单细胞内药物剂量的定量分析。基于上述可以同时匹配lif和icpms进行单细胞二维表型分析的高效微流控进样系统联用lif和icpms分析系统，可以实现一站式、超温和流体条件、高通量、无背景干扰、
高稳定性的单细胞分离进样，该方法可用于单细胞水平下的在线二维表型分析，样品所受最大剪切力0.043dyne cm-2
，单细胞样品聚焦效率达99.5％，检测采样效率达90.3％。
10.本发明采用的技术方案具体如下：
11.一种用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片，包括两个进口、一个废液出口、一个水平采样接口，两个进口分别为进口i和进口ii；还包括微米级单细胞聚焦通道、微米级纯化液通道、微米级样品纯化通道、微米级滤网。
12.所述进口i连通微米级单细胞聚焦通道入口，进口ii连通微米级纯化液通道入口，微米级单细胞聚焦通道出口和微米级纯化液通道的出口均连通微米级样品纯化通道入口，微米级样品纯化通道被微米级滤网分成a、b两部分，a部分连通水平采样接口，b部分连通废液出口。
13.所述微米级单细胞聚焦通道为缠绕若干圈的螺旋通道，螺旋通道内部设置微障碍物和高曲率弯道，微障碍物和高曲率弯道在螺旋通道内部均匀、交错分布。
14.进口i用于细胞悬浮液的进样，根据粒子二次流聚焦原理，细胞悬浮液通过进口i进入微米级单细胞聚焦通道，在微米级单细胞聚焦通道中添加的微障碍物和高曲率弯道的作用下，液流不断进行高强度的二次流加速，二次流产生的作用力不断作用到细胞上，细胞悬浮液中杂乱无章的细胞被排列为井然有序的单细胞束。细胞悬浮液只需以较低的流速注入(5～50μl/min)，即可形成上述有序单细胞束，因此单细胞所受到的流体剪切力极低，流体条件超温和。
15.通过微米级单细胞聚焦通道后，细胞悬浮液转变为载有持续稳定的有序单细胞束的液体，但液体中还会包含细胞悬浮液中的其他杂质。通过进口ii可以引入纯化液，纯化液通过微米级纯化液通道，和上述载有有序单细胞束的液体共同进入微米级样品纯化通道中，利用水动力过滤原理，比微米级滤网过滤孔小的杂质被纯化液清洗进入b部分，并从废液出口通过毛细管等方式排出，比微米级滤网过滤孔大的单细胞束留在原本流道内(即a部分)，并进入水平采样接口，可通过水平采样接口收集单细胞用于检测。
16.微流控制芯片各部分的参考尺寸如下：
17.微米级单细胞聚焦通道正常宽度(正常宽度是指螺旋通道内没有微障碍物和高曲率弯道阻碍的宽度)为50～750μm，总长为6.9～50.5cm，缠绕的螺旋通道圈数为5～10圈；微米级单细胞聚焦通道内的单个微障碍物长度40～900μm，宽度为40～600μm；微米级单细胞聚焦通道内的单个高曲率弯道的长度50～350μm，宽度30～150μm，曲率为2～3。
18.两个微障碍物之间的距离为600～5000μm，两个微障碍物之间设置一个高曲率弯道。微米级单细胞聚焦通道内的微障碍物总数和高曲率弯道总数均为36～216个。
19.高曲率弯道的宽度是微米级单细胞聚焦通道正常宽度的20％～60％，微障碍物宽度是微米级单细胞聚焦通道正常宽度的30％～80％，以实现足够强度的二次流加速。
20.微米级样品纯化通道长度为0.5～3.0cm，宽度为100～400μm；微米级滤网长度为0.35～3.5cm，宽度为5～500μm，微米级滤网的过滤孔尺寸为3～9μm，水平采样接口长度为0.5～3.0mm，宽度为50～400μm；微米级纯化液通道的尺寸不做具体限定，只要能满足需要的纯化液流速即可。
21.所述微流控制芯片中的各个通道，如微米级单细胞聚焦通道、微米级纯化液通道、微米级样品纯化通道、微米级滤网、水平采样接口等，高度均为20～50μm。
22.所述微流控制芯片的面积为0.5cm2～5.5cm2，以承载上述结构。
23.进一步地，所述微量控制芯片内还可以设置微米级荧光采集通道，用于单细胞的荧光信号收集。微米级荧光采集通道一端与微米级样品纯化通道a部分连通，另一端与水平采样接口连通。
24.优选地，微米级荧光采集通道长度为0.5～1.2cm，宽度为20～500μm。
25.如前文所述，本发明还包含一种用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统，或者说高效微流控进样分析系统，除了包括水平放置的上述微流控制芯片之外，还包括微量注射泵a、微量注射泵b、毛细软管a、毛细软管b、毛细软管c、peek毛细管，还包括微量雾化系统、电感耦合等离子体质谱仪(icpms)。
26.所述微量注射泵a通过毛细软管a连通微流控制芯片的进口i，毛细软管a作为细胞悬浮液进口通道；微量注射泵b通过毛细软管b连通微流控制芯片的进口ii，毛细软管b作为纯化液进口通道；所述peek毛细管一端连通微流控制芯片的水平采样接口，另一端通过微量雾化系统与电感耦合等离子体质谱仪相连，peek毛细管作为单细胞样品传输通道。
27.所述毛细软管c作为废液通道，一端与微流控制芯片的废液出口相连，另一端用于废液的排出。
28.所述微量雾化系统可以采用普通的商用微量雾化系统。
29.如果微流控制芯片内设置了微米级荧光采集通道，则所述用于单细胞二维表型分析的系统还可以包括设置于微米级荧光采集通道下方的激光诱导荧光检测器(lif)，用于单细胞上标记的荧光信号的检测。
30.作为本发明的另一个方面，还包括一种使用上述系统进行单细胞二维表型分析检测的方法，具体包括以下步骤：
31.步骤1，制备样品：通过胰酶消化等方式，将要检测的细胞，比如暴露于金属药物下的细胞，制备为细胞悬浮液，不需要进行离心清洗。
32.步骤2，准备进样：由微量注射泵a提供细胞悬浮液，通过毛细软管a连接到微流控制芯片进口ⅰ；由微量注射泵b提供进行样品清洗的纯化溶液，通过毛细软管b连接到微流控制芯片进口ⅱ。
33.步骤3，单细胞束形成：通过微量注射泵a和毛细软管a在低流速下将细胞悬浮液引入微流控制芯片的微米级单细胞聚焦通道中，细胞悬浮液在微米级单细胞聚焦通道中形成载有有序单细胞束的液体，离开微米级单细胞聚焦通道。
34.根据粒子二次流聚焦原理，细胞悬浮液由微量注射泵a通过毛细软管a在低流速下被引入微流控制芯片中，在添加的微障碍物和高曲率弯道的作用下，液流在微米级单细胞聚焦通道中不断地进行高强度的二次流加速，二次流产生的作用力不断作用到细胞上，细胞悬浮液中杂乱无章的细胞被排列为井然有序的单细胞束，且细胞悬浮液引入微流控制芯片中的流速较低，单细胞所受到的流体剪切力极低，流体条件超温和。
35.步骤4，单细胞束的纯化：在步骤3中载有有序单细胞束的液体离开微米级单细胞聚焦通道之前，使用微量注射泵b通过毛细软管b向微流控制芯片的微米级纯化液通道中注入纯化液，纯化液流入微米级样品纯化通道中。
36.载有有序单细胞束的液体进入微米级样品纯化通道后，利用水动力过滤原理，比微米级滤网过滤孔小的杂质被进入微米级样品纯化通道的纯化液清洗，进入微米级样品纯
化通道b部分，从废液出口通过毛细软管c排出，比微米级滤网过滤孔大的单细胞束留在微米级样品纯化通道a部分，并进入水平采样接口。
37.步骤5，单细胞水平进样和雾化：经过聚焦和纯化后的单细胞束通过与微米级水平采样接口相连的peek毛细管进入微量雾化系统，氩气等载气通过微量雾化系统的载气入口进入微量雾化系统，单细胞束被进入微量雾化系统中的载气雾化。
38.步骤6，单细胞的质谱分析：雾化产物随载气进入电感耦合等离子体质谱仪icpms，进行单细胞中待测元素的检测。
39.清洗上述用于单细胞二维表型分析的高效微流控进样分析系统后，可以重复上述步骤1～6进行多次检测。
40.如果上述分析检测方法中采用了微流控制芯片中包含微米级荧光采集通道的系统，则可以在步骤1中，对细胞标记荧光适配体金纳米粒子探针，在步骤4中，依次排列的单细胞束在进入水平采样接口之前会经过微米级荧光采样通道，置于微米级荧光采样通道下方的激光诱导荧光检测器可以收集单细胞上标记的荧光探针的荧光信号，得到单细胞上相关蛋白标志物的表达水平。激光诱导荧光检测器的频带宽度可以为10～20000hz。
41.所述步骤3中，细胞悬浮液引入微流控制芯片的进样流量为5～50μl/min，所述步骤4中，纯化液流入微米级样品纯化通道中的流量为20～1200μl/min；所述步骤5中用于雾化的载气流量为0.4～1.4l/min，载气可以为纯度99.999％的氩气。
42.优选地，所述步骤6中，具体检测方法如下：在时间分辨模式下进行检测；捕捉并记录待测元素的瞬时信号随时间响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号及高斯拟合获取信号强度-频率分布状况；最后，根据有效信号数值和高斯拟合结果定量化单细胞中待测元素。电感耦合等离子体质谱仪的功率可为1240～1580w，积分时间可为0.1～10ms。
43.用于上述步骤1中，含有标记了特定荧光适配体金纳米粒子探针并暴露于特定金属药物中的细胞的细胞悬浮液的一种制备方法为：
44.(1)在细胞培养孔板中，将第一培养基中培养细胞至对数生长期，去除第一培养基并清洗；
45.(2)在细胞培养孔板中，换入含有特定浓度待测金属药物溶液的第二培养基培养，孵育细胞；
46.(3)将孵育好的细胞从细胞培养孔板消化下来，等分成两部分；
47.(4)第一部分消化下来的细胞中加入过量特定荧光适配体金纳米粒子探针，冰浴30min，以标记细胞表面特定蛋白；
48.(5)第二部分消化下来的细胞进行离心清洗，用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液，其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/l po
43-，ph＝7.4；
49.(6)使用血球计数板对第二部分细胞悬浮液中的细胞进行计数，即等同于第一部分细胞的浓度；
50.(7)用磷酸缓冲溶液将第一部分标记特定荧光适配体金纳米粒子探针的细胞稀释至细胞数密度为103～108cells/ml。
51.与现有技术相比，本发明的优势在于：
52.1、与传统细胞悬浮液进样方式相比，本发明中的微流控制芯片及系统可以形成高稳定性的单细胞排列，提供更准确的单细胞数据；
53.2、与单细胞液滴/激光剥蚀进样系统相比，可以免除有机相干扰、无需多余的交叉管路设计、显著增加进样效率和通量；
54.3、与微流控/介观流控模块进样系统相比，可以在更为温和的流体条件下实现更大的二次流效应，进而使细胞悬浮液中杂乱的细胞形成稳定的单细胞束，并且低流速可以提供更高的雾化器匹配度和单细胞检测效率；
55.4、本发明的微流控制芯片中配有微米级样品纯化通道，由微量注射泵b提供纯化溶液引入进口ⅱ，无需传统进样前冗长的离心步骤，即可实现一站式物杂质干扰的单细胞进样；
56.5、本发明与传统微流控制芯片出口的垂直引出样品不同，水平方式引出样品可以维持液流本身的流线，保持单细胞束的稳定进样；
57.6、本发明的微流控制芯片由于具备微米级荧光采集通道和微米级水平采样接口，可以同时耦合lif和icpms两种检测器，实现对单个细胞光谱/质谱二维信息的采集，在单细胞分辨率下轻松完成金属药物剂量对细胞上相关蛋白表达量的生物效应影响和表型分析。
附图说明
58.图1、本发明实施例中用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片示意图；
59.图2、本发明实施例中用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/制谱系统示意图；
60.图3、本发明微流控制芯片中的尺寸示意图。
61.其中，1、微流控制芯片，2、毛细软管a，3、毛细软管b，4、毛细软管c，5、peek毛细管、6、进口ⅰ，7、进口ⅱ，8、废液出口，9、水平采样接口，10、微米级单细胞聚焦通道，11、微障碍物，12、高曲率弯道，13、微米级纯化液通道，14、微米级样品纯化通道，15、微米级滤网，16、微米级荧光采集通道，17、微量注射泵a，18、微量注射泵b，19、lif，20、微量雾化系统，21、icpms。
具体实施方式
62.下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式做详细说明。
63.实施例1
64.一种用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统如图1、2所示，能够实现高效微流控的进样和分析。系统包括水平放置的微流控制芯片1、微量注射泵a17、微量注射泵b18、毛细软管a2、毛细软管b3、毛细软管c4、peek毛细管5；所述微流控制芯片有两个进口(进口i6和进口ii7)、一个废液出口8和一个水平采样接口9；所述毛细软管a2和毛细软管b3一端分别与微量注射泵a17和微量注射泵b18出口端相连，另一端分别与微流控制芯片的进口ⅰ6和进口ⅱ7相连；所述毛细软管c4一端与微流控制芯片的出口8相连，另一端排出废液；所述peek毛细管5一端与微流控制芯片的水平采样接口9相连，另一端通过商用微量雾化系统20与icpms21相连；所述微流控制芯片的微米级荧光采集通道16正下方为lif19，微米级荧光采集通道以及lif的设置是为了本技术的系统功能更加完善，本领域技术人员可以根据实际使用需求，选择是否在芯片中设置微米级荧光采集通道；所述商用微量雾化系统20的型号为enyamist 42.534，icpms21的型号为8900；所述毛细软管a2、毛细软管b3、
毛细软管c4的外径均为1.6mm，内径均为160μm；所述peek毛细管外径均为110μm，内径均为30μm。
65.所述微流控制芯片的结构如图1所示，除了上述的两个进口(进口i6和进口ii7)、一个废液出口8和一个水平采样接口9之外，还包括微米级单细胞聚焦通道10、微米级纯化液通道13、微米级样品纯化通道14、微米级滤网15、微米级荧光采集通道16。
66.微米级单细胞聚焦通道10为特殊设计的缠绕六圈的盘状螺旋通道。微米级样品纯化通道14被微米级滤网15分成a、b两部分，微米级滤网总长度为0.8cm，宽度为10μm，用于将杂质和废液引入b部分并通过废液出口8及相连的毛细软管c4排出。细长型的微米级荧光采集通道16连通微米级样品纯化通道14的a部分和水平采样接口9，用于单细胞上标记的荧光探针的荧光信号的采集。
67.微米级单细胞聚焦通道10的螺旋通道内部设置微障碍物11和高曲率弯道12，微障碍物和高曲率弯道在螺旋通道内部均匀、交错分布。
68.在本实施例中，如图3所示，微米级单细胞聚焦通道的总长为18.7cm，正常宽度w1为300μm；其内部的单个微障碍物11的长度l2为750μm，宽度w2为150μm，微障碍物总个数为79个；单个高曲率弯道长度l3为350μm，宽度w3为50μm，曲率为2～3，高曲率弯道总个数为80个；微流控制芯片1内各个通道的整体高度均为20～50μm，微流控制芯片1的面积为0.51cm2。
69.微米级样品纯化通道长度为0.5cm，宽度为100μm；微米级滤网长度为0.65cm，宽度50μm，微米级滤网过滤孔尺寸6μm；水平采样接口长度为0.5mm，宽度为50μm；微米级荧光采集通道长度为0.5cm，宽度为20μm。
70.需要说明的是，上述尺寸和参数只是本实施例中的具体尺寸和参数，并不做为对本发明方案的限定。本领域技术人员可以根据具体的实用需求，比如细胞的实际尺寸等，在发明内容的参考范围中，选择微流控制芯片的各部分具体尺寸及参数。
71.实施例2
72.一种单细胞光谱/质谱二维表型分析检测的方法，采用与实施例1类似的用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统(高效微流控进样分析系统)，包括如下步骤：
73.步骤1，制备样品：通过胰酶消化作用，将暴露于金属药物下的细胞制备为细胞悬浮液并标记特定荧光适配体金纳米粒子探针，无需离心清洗；
74.细胞悬浮液的制备方法为：
75.(1)在细胞培养孔板中，将第一培养基中培养细胞至对数生长期，去除第一培养基并清洗；
76.(2)在细胞培养孔板中，换入含有特定浓度待测金属药物溶液的第二培养基培养，孵育细胞；
77.(3)将孵育好的细胞从细胞培养孔板消化下来，等分成两部分。
78.(4)第一部分消化下来的细胞中加入过量特定荧光适配体金纳米粒子探针，冰浴30min，以标记细胞表面特定蛋白。
79.(5)第二部分消化下来的细胞进行离心清洗，用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液，其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/l po
43-，ph＝7.4；
80.(6)使用血球计数板对第二部分细胞悬浮液中的细胞进行计数，即等同于第一部分细胞的浓度。
81.(7)用磷酸缓冲溶液将第一部分标记特定荧光适配体金纳米粒子探针的细胞稀释至细胞数密度为103cells/ml。
82.步骤2，准备进样：由微量注射泵a提供标记特定探针后细胞内含特定金属药物的细胞悬浮液，通过毛细软管a连接到微流控制芯片进口ⅰ；由微量注射泵b提供进行样品清洗的纯化溶液，通过毛细软管b连接到微流控制芯片进口ⅱ。
83.步骤3，单细胞束形成：通过微量注射泵a和毛细软管a在5μl/min的进样流量下将细胞悬浮液引入微流控制芯片的微米级单细胞聚焦通道中，细胞悬浮液在微米级单细胞聚焦通道中形成载有有序单细胞束的液体，离开微米级单细胞聚焦通道。
84.步骤4，单细胞束的纯化：在步骤3中载有有序单细胞束的液体离开微米级单细胞聚焦通道之前，使用微量注射泵b通过毛细软管b向微流控制芯片的微米级纯化液通道中注入纯化液，纯化液流量为20μl/min，纯化液流入微米级样品纯化通道中；载有有序单细胞束的液体进入微米级样品纯化通道后，利用水动力过滤原理，比微米级滤网过滤孔小的杂质被进入微米级样品纯化通道的纯化液清洗，进入微米级样品纯化通道b部分，从废液出口通过毛细软管c排出，比微米级滤网过滤孔大的单细胞束留在微米级样品纯化通道a部分，并进入微米级荧光采样通道。
85.步骤5，单细胞的荧光信号采集分析：依次排列的单细胞束通过微米级荧光采样通道，由于标记了荧光探针，被置于荧光采样通道正下方的lif收集单细胞上标记的荧光探针的荧光信号，得到单细胞上相关蛋白标志物的表达水平，激光诱导荧光信号采集器的频带宽度为10hz。
86.步骤6，单细胞水平进样和雾化：经过聚焦和纯化后的单细胞束通过微米级荧光采样通道后，通过与微米级水平采样接口相连的peek毛细管进入微量雾化系统，被进入微量雾化系统中的载气雾化，载气流量0.4l/min。
87.步骤7，单细胞的质谱分析：雾化产物随载气氩气进入icpms，在时间分辨模式下进行检测；捕捉并记录待测元素的瞬时信号随时间响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号及高斯拟合获取信号强度-频率分布状况；最后，根据有效信号数值和高斯拟合结果定量化单细胞中待测元素，载气氩气纯度均为99.999％；电感耦合等离子体质谱仪的功率为1240～1580w，积分时间为0.1ms。
88.清洗用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统，重复步骤1～步骤7，再次进样检测。
89.本实施例中，细胞悬浮液流量为5μl/min、纯化液流量为20μl/min，微米级单细胞聚焦通道的总长为6.9cm，正常宽度w1为50μm，缠绕的螺旋通道圈数为5圈；微米级单细胞聚焦通道内部的单个微障碍物11的长度l2为40μm，宽度w2为40μm，微障碍物总个数为36个；单个高曲率弯道长度l3为50μm，宽度w3为30μm，曲率为2，高曲率弯道总个数为36个；微流控制芯片1内各个通道的整体高度均为20μm。微米级样品纯化通道宽度为100μm，长度为0.5cm；微米级滤网微米级滤网长度为0.35cm，宽度5μm，微米级滤网过滤孔尺寸3μm；水平采样接口长度为0.5mm，宽度为50μm；微米级荧光采集通道宽度为20μm，长度为0.5cm。微流控制芯片的面积为0.5cm2。
90.样品所受最大剪切力0.012dyne cm-2
，单细胞样品聚焦效率达99.5％，检测采样效率达90.3％。
91.实施例3
92.一种单细胞光谱/质谱二维表型分析检测的方法，采用与实施例1类似的用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统(高效微流控进样分析系统)，包括如下步骤：
93.步骤1，制备样品：通过胰酶消化作用，将暴露于金属药物下的细胞制备为细胞悬浮液并标记特定荧光适配体金纳米粒子探针，无需离心清洗；
94.细胞悬浮液的制备方法为：
95.(1)在细胞培养孔板中，将第一培养基中培养细胞至对数生长期，去除第一培养基并清洗；
96.(2)在细胞培养孔板中，换入含有特定浓度待测金属药物溶液的第二培养基培养，孵育细胞；
97.(3)将孵育好的细胞从细胞培养孔板消化下来，等分成两部分。
98.(4)第一部分消化下来的细胞中加入过量特定荧光适配体金纳米粒子探针，冰浴30min，以标记细胞表面特定蛋白。
99.(5)第二部分消化下来的细胞进行离心清洗，用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液，其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/l po
43-，ph＝7.4；
100.(6)使用血球计数板对第二部分细胞悬浮液中的细胞进行计数，即等同于第一部分细胞的浓度。
101.(7)用磷酸缓冲溶液将第一部分标记特定荧光适配体金纳米粒子探针的细胞稀释至细胞数密度为105cells/ml。
102.步骤2，准备进样：由微量注射泵a提供标记特定探针后细胞内含特定金属药物的细胞悬浮液，通过毛细软管a连接到微流控制芯片进口ⅰ；由微量注射泵b提供进行样品清洗的纯化溶液，通过毛细软管b连接到微流控制芯片进口ⅱ。
103.步骤3，单细胞束形成：通过微量注射泵a和毛细软管a在20μl/min的进样流量下将细胞悬浮液引入微流控制芯片的微米级单细胞聚焦通道中，细胞悬浮液在微米级单细胞聚焦通道中形成载有有序单细胞束的液体，离开微米级单细胞聚焦通道。
104.步骤4，单细胞束的纯化：在步骤3中载有有序单细胞束的液体离开微米级单细胞聚焦通道之前，使用微量注射泵b通过毛细软管b向微流控制芯片的微米级纯化液通道中注入纯化液，纯化液流量为100μl/min，纯化液流入微米级样品纯化通道中；载有有序单细胞束的液体进入微米级样品纯化通道后，利用水动力过滤原理，比微米级滤网过滤孔小的杂质被进入微米级样品纯化通道的纯化液清洗，进入微米级样品纯化通道b部分，从废液出口通过毛细软管c排出，比微米级滤网过滤孔大的单细胞束留在微米级样品纯化通道a部分，并进入微米级荧光采样通道。
105.步骤5，单细胞的荧光信号采集分析：依次排列的单细胞束通过微米级荧光采样通道，由于标记了荧光探针，被置于荧光采样通道正下方的lif收集单细胞上标记的荧光探针的荧光信号，得到单细胞上相关蛋白标志物的表达水平，激光诱导荧光信号采集器的频带宽度为10000hz。
106.步骤6，单细胞水平进样和雾化：经过聚焦和纯化后的单细胞束通过微米级荧光采样通道后，通过与微米级水平采样接口相连的peek毛细管进入微量雾化系统，被进入微量雾化系统中的载气雾化，载气流量0.8l/min。
107.步骤7，单细胞的质谱分析：雾化产物随载气氩气进入icpms，在时间分辨模式下进行检测；捕捉并记录待测元素的瞬时信号随时间响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号及高斯拟合获取信号强度-频率分布状况；最后，根据有效信号数值和高斯拟合结果定量化单细胞中待测元素，载气氩气纯度均为99.999％；电感耦合等离子体质谱仪的功率为1240～1580w，积分时间为1ms。
108.清洗用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统，重复步骤1～步骤7，再次进样检测。
109.需要说明的是，此实例中2细胞悬浮液流量为20μl/min、纯化液流量为100μl/min，微米级单细胞聚焦通道的总长为25cm，正常宽度w1为300μm，缠绕的螺旋通道圈数为8圈；微米级单细胞聚焦通道内部的单个微障碍物11的长度l2为500μm，宽度w2为200μm，微障碍物总个数为120个；单个高曲率弯道长度l3为150μm，宽度w3为80μm，曲率为2.5，高曲率弯道总个数为120个；微流控制芯片1内各个通道的整体高度均为30μm。微米级样品纯化通道宽度为200μm，长度为1.5cm；微米级滤网微米级滤网长度为1.55cm，宽度100μm，微米级滤网过滤孔尺寸6μm；水平采样接口长度为1.5mm，宽度为200μm；微米级荧光采集通道宽度为200μm，长度为0.8cm。微流控制芯片的面积为1.5cm2。
110.样品所受最大剪切力0.023dyne cm-2
，单细胞样品聚焦效率达99.3％，检测采样效率达89.5％。
111.实施例4
112.一种单细胞光谱/质谱二维表型分析检测的方法，采用一种用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统(高效微流控进样分析系统)，包括如下步骤：
113.步骤1，制备样品：通过胰酶消化作用，将暴露于金属药物下的细胞制备为细胞悬浮液并标记特定荧光适配体金纳米粒子探针，无需离心清洗；
114.细胞悬浮液的制备方法为：
115.(1)在细胞培养孔板中，将第一培养基中培养细胞至对数生长期，去除第一培养基并清洗；
116.(2)在细胞培养孔板中，换入含有特定浓度待测金属药物溶液的第二培养基培养，孵育细胞；
117.(3)将孵育好的细胞从细胞培养孔板消化下来，等分成两部分。
118.(4)第一部分消化下来的细胞中加入过量特定荧光适配体金纳米粒子探针，冰浴30min，以标记细胞表面特定蛋白。
119.(5)第二部分消化下来的细胞进行离心清洗，用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液，其中磷酸根粒子浓度为0.01mol/l po
43-，ph＝7.4；
120.(6)使用血球计数板对第二部分细胞悬浮液中的细胞进行计数，即等同于第一部分细胞的浓度。
121.(7)用磷酸缓冲溶液将第一部分标记特定荧光适配体金纳米粒子探针的细胞稀释至细胞数密度为108cells/ml。
122.步骤2，准备进样：由微量注射泵a提供标记特定探针后细胞内含特定金属药物的细胞悬浮液，通过毛细软管a连接到微流控制芯片进口ⅰ；由微量注射泵b提供进行样品清洗的纯化溶液，通过毛细软管b连接到微流控制芯片进口ⅱ。
123.步骤3，单细胞束形成：通过微量注射泵a和毛细软管a在50μl/min的进样流量下将细胞悬浮液引入微流控制芯片的微米级单细胞聚焦通道中，细胞悬浮液在微米级单细胞聚焦通道中形成载有有序单细胞束的液体，离开微米级单细胞聚焦通道。
124.步骤4，单细胞束的纯化：在步骤3中载有有序单细胞束的液体离开微米级单细胞聚焦通道之前，使用微量注射泵b通过毛细软管b向微流控制芯片的微米级纯化液通道中注入纯化液，纯化液流量为1200μl/min，纯化液流入微米级样品纯化通道中；载有有序单细胞束的液体进入微米级样品纯化通道后，利用水动力过滤原理，比微米级滤网过滤孔小的杂质被进入微米级样品纯化通道的纯化液清洗，进入微米级样品纯化通道b部分，从废液出口通过毛细软管c排出，比微米级滤网过滤孔大的单细胞束留在微米级样品纯化通道a部分，并进入微米级荧光采样通道。
125.步骤5，单细胞的荧光信号采集分析：依次排列的单细胞束通过微米级荧光采样通道，由于标记了荧光探针，被置于荧光采样通道正下方的lif收集单细胞上标记的荧光探针的荧光信号，得到单细胞上相关蛋白标志物的表达水平，激光诱导荧光信号采集器的频带宽度为20000hz。
126.步骤6，单细胞水平进样和雾化：经过聚焦和纯化后的单细胞束通过微米级荧光采样通道后，通过与微米级水平采样接口相连的peek毛细管进入微量雾化系统，被进入微量雾化系统中的载气雾化，载气流量1.4l/min。
127.步骤7，单细胞的质谱分析：雾化产物随载气氩气进入icpms，在时间分辨模式下进行检测；捕捉并记录待测元素的瞬时信号随时间响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号及高斯拟合获取信号强度-频率分布状况；最后，根据有效信号数值和高斯拟合结果定量化单细胞中待测元素，载气氩气纯度均为99.999％；电感耦合等离子体质谱仪的功率为1240～1580w，积分时间为10ms。
128.清洗用于单细胞二维表型分析的微流控制芯片光谱/质谱系统，重复步骤1～步骤7，再次进样检测。
129.需要说明的是，此实例中3细胞悬浮液流量为50μl/min、纯化液流量为1200μl/min，微米级单细胞聚焦通道的总长为50.5cm，正常宽度w1为750μm，缠绕的螺旋通道圈数为10圈；微米级单细胞聚焦通道内部的单个微障碍物11的长度l2为900μm，宽度w2为600μm，微障碍物总个数为216个；单个高曲率弯道长度l3为350μm，宽度w3为150μm，曲率为3，高曲率弯道总个数为216个；微流控制芯片1内各个通道的整体高度均为50μm。微米级样品纯化通道宽度为400μm，长度为3cm；微米级滤网微米级滤网长度为3.5cm，宽度500μm，微米级滤网过滤孔尺寸9μm；水平采样接口长度为3.0mm，宽度为400μm；微米级荧光采集通道宽度为500μm，长度为1.2cm。微流控制芯片的面积为5.5cm2。
130.样品所受最大剪切力0.043dyne cm-2
，单细胞样品聚焦效率达99.0％，检测采样效率达87.2％。