制备合成模板的方法与流程

制备合成模板的方法
1.优先权要求
2.本专利申请要求题为“methods for manufacturing asynthetic template”并于
2021
年2月8日提交的美国临时专利申请第
63/147,173
号的优先权，该专利申请通过引用以其整体并入本文
。
3.通过引用并入
4.本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被特定地和单独地指示为通过引用并入
。
5.背景
6.目前用于制备和配制多核苷酸治疗剂特别是
mrna
治疗剂的可用技术经常使产物暴露于污染和降解
。
目前可用的集中生产对于用于可能包括多种多核苷酸物类的治疗制剂来说可能成本太高
、
太慢
、
而且易受污染
。
开发可扩展的多核苷酸制备
、
单个患者剂量生产
、
消除接触点以限制污染
、
输入和过程跟踪以满足临床制备要求
、
以及在护理点
(point-of-care)
操作中的应用，可以促进这些有前途的治疗方式的使用
。
微流控仪器和过程可以针对这些目标提供主要优势
。
7.本公开内容的概述
8.本文描述了用于制备可解决上述需求的各种治疗剂的方法和设备
(
例如，系统
)。
9.本文描述了可用于制备各种各样的疫苗和治疗剂的设备和方法
。
例如，本文描述了用于制备个性化治疗剂
(
包括疫苗
)
的方法和设备
(
例如，系统
、
装置等
)。
在一个非限制性实例中，本文描述的方法和设备可用于产生针对在皮肤
t
细胞淋巴瘤中有活性的癌症特异性抗原的治疗性
mrna
疫苗
。
10.本公开内容涉及用于快速
、
高产率制备基于多核苷酸的治疗剂的方法和系统，并且可以具体地涉及治疗性
mrna (
包括疫苗
)
的自动化制备，其可以快速和高效地进行
。
这样的治疗剂可以考虑患者特定的信息，并且可以按需产生，并且完全或部分地在护理点
(
例如，医院
、
诊所等
)
产生
。
因此，本文描述了用于
mrna
治疗剂的自动化
、
高产率制备方法，任选地所述方法在护理点开展
。
11.本文所述的方法和设备可以包括在不使用细菌的情况下合成地形成用于
mrna
形成的模板
。
在一些实例中，这些方法和设备可以在不使用任何细菌组分的情况下使用
。
这些方法和设备可以使用聚合酶作为聚合酶链式反应
(pcr)
的一部分来合成
mrna
治疗剂，包括具有大于约
100bp(
例如大于约
150bp、
大于约
200bp
或更高
)
的单个多核苷酸重复
(
例如多
a)
尾的
mrna
治疗剂
。
12.例如，本文描述了使用包含多于一个流体贮库的系统形成
(
例如，制造
、
制备
、
合成等
)
治疗性多核苷酸的方法，所述流体贮库被配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法包括：在受保护而免于大气接触的密封且封闭的流控路径中，在多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库与一个或更多个微流控路径装置上的多于一个反应器之间输送试剂以实施以下操作：形成合成模板，从模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，并纯化治疗性多核苷酸
。
这些方法可以包括通过
pcr
形成合成模板
。
13.一种使用包含多于一个流体贮库的系统制备治疗性
mrna
的方法，所述流体贮库配置为与一个或更多个微流控路径板装置以密封流体连通固定，其中一个或更多个微流控路径板装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：将模板前体材料从一个或更多个流体贮库递送到多于一个反应器的第一一个或更多个反应器区域，并处理模板前体材料
(
例如，通过
pcr)
以从模板前体材料制备模板；将模板转移到多于一个反应器的第二一个或更多个反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性
mrna
；以及将治疗性
mrna
转移至多于一个反应器的第三一个或更多个反应器区域，并通过在第三一个或更多个反应器区域内的一维
(1d)
或二维
(2d)
纯化来纯化治疗性
mrna
；其中所有方法步骤都在不使模板和治疗性
mrna
暴露于大气接触的情况下实施
。
14.一种使用系统制备治疗性
mrna
的方法，所述系统包括与一个或更多个微流控路径板装置密封流体连通的多于一个流体贮库，其中一个或更多个微流控路径板装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：使用流体动力将模板前体材料从一个或更多个流体贮库递送到多于一个反应器的第一一个或更多个反应器区域，并处理模板前体材料
(
例如，通过
pcr)
以从模板前体材料制备模板；使用流体动力将模板转移到多于一个反应器的第二一个或更多个反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性
mrna
；使用流体动力将治疗性
mrna
转移到多于一个反应器的第三一个或更多个反应器区域，并通过在第三一个或更多个反应器区域内的二维
(2d)
纯化来纯化治疗性
mrna
；使用流体动力将治疗性
mrna
转移到多于一个反应器的第四一个或更多个反应器区域，并用递送媒介物包封治疗性
mrna
以形成治疗性
mrna
组合物；以及使用流体动力在第五一个或更多个流体贮库中浓缩治疗性
mrna
组合物，其中所有方法步骤在不使模板和治疗性
mrna
暴露于大气接触的情况下实施
。
15.本文描述了制备方法
(
例如，制备包含适于体外转录的合成
dna
模板的合成产物的方法
)
，该方法包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
具有对感兴趣的合成基因特异的第一区域的第一引物
、
和第二引物，其中第二引物包含
150
个碱基对
(bp)
或更长的多
t
序列
、
或
150bp
或更长的多a序列和对感兴趣的合成基因特异的第二区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述第一引物和所述第二引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含
150bp
或更长的多a序列的合成产物；以及将所述合成产物输送出所述第一反应器，其中所述合成产物包含适于体外转录的合成
dna
模板
。
16.例如，本文描述的方法可以包括制备用于体外转录的合成
dna
模板的自动化方法，该自动化方法包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
具有对感兴趣的合成基因特异的第一区域的第一引物
、
和第二引物，其中第二引物包含
150bp
或更长的多
t
序列
、
或
150bp
或更长的多a序列和对感兴趣的合成基因特异的第二区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述第一引物和所述第二引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含
150bp
或更长的多a序列的合成产物；以及将所述合成产物输送出所述第一反应器，其中所述合成产物包含所述合成
dna
模板
。
17.如本文所述用于制备合成
dna
模板的任何方法可以包括在微流控路径装置
(
例如，芯片
)
上对模板材料进行一维
(1d)
或二维
(2d)
纯化，以去除杂质
。
例如，这些方法中的任一
种可以包括在微流控路径装置内的一个或更多个专用纯化室中对合成的
dna
模板进行纯化
。1d
或
2d
纯化可以包括进行尺寸选择以从含有合成
dna
模板的溶液中除去较小
(
例如，
500bp
或更小
、400bp
或更小
、300bp
或更小
、200bp
或更小
、100bp
或更小等
)
的多核苷酸和
/
或核苷酸
。
例如，
2d
纯化可以包括将合成的
dna
模板传递到包含电荷转换珠
(charge-switch bead)
的室中，随后是包含
ampure
tm
珠
(
例如，
ampure xp,new england biolabs,u.s.)
的室中
。
一维纯化可以包括将溶液中的合成
dna
模板传递到包含
ampure
tm
珠的室中
。
18.第一引物可以是正向引物
(
例如包含与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸的第一区域杂交的5’
末端
)
或者反向引物
(
例如包含与感兴趣的合成基因的第一区域互补的3’
末端
)。
第二引物可以是反向引物
(
例如包含
150bp
或更长的多
t
序列和与感兴趣的合成基因的5’
末端互补的5’
区域
)
或者正向引物
(
例如包含
150bp
或更长的多a序列和与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸的第二区域杂交的3’
区域
)。
在本文所述的任何方法中，如果第一引物是正向引物，则第二引物是反向引物；相反，如果第一引物是反向引物，则第二引物是正向引物
。
19.例如，第一引物可以包含与感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列互补或包含该序列的末端
。
第二引物的第二区域可以包含包括感兴趣的合成基因的5’
末端区域或与感兴趣的合成基因的5’
末端区域互补的末端区域
。
第一引物可以包含启动子区域，诸如
(
但不限于
)t7
启动子区域
。
20.第一引物和第二引物的尺寸通常不对称；第二引物
(
包括
150
或更长长度的多a或多
t)
可以是第一引物的长度的约四倍或更多倍
(
例如，约五倍或更多倍
、
约六倍或更多倍
、
约七倍或更多倍
、
约八倍或更多倍等
)。
21.控制温度以通过
pcr
扩增感兴趣的合成基因可以包括生成约
0.5
μm或更多
(
例如，约1μm或更多
、
约2μm或更多
、
约3μm或更多
、
约4μm或更多
、
约5μm或更多
、
约
7.5
μm或更多
、
约
10
μm或更多
、
约
50
μm或更多
、
约
100
μm或更多等
)
的扩增
dna
模板
。
例如，本文所述的方法和设备可以在约1μ
l
和约
200
μ
l
的体积
(
例如，约1μ
l
和约
100
μ
l、
约
10
μ
l
和约
100
μ
l、
约
10
μ
l
和约
50
μ
l、
约
10
μ
l
和约
25
μ
l、
约
10
μ
l
和约
20
μ
l
等
)
中产生约1μg和约
200
μg之间
(
例如，约1μg和约
100
μg之间
、
约
10
μg和约
100
μg之间
、
约
10
μg和约
50
μg之间
、
约
10
μg和约
30
μg之间等
)。
例如，本文所述的方法和设备可以在约
10
μ
l
和约
20
μ
l
洗脱体积中产生约
10
μg和约
30
μg之间的合成
dna
模板
。
22.在这些方法中的任一种中，合成
dna
模板可以不含细菌
dna
并且不含内毒素
。
例如，这些方法中的任一种可以包括用甲基化敏感性限制性内切酶处理感兴趣的合成基因和
/
或合成产物，以去除任何细菌
dna。
23.可以控制通过
pcr
扩增感兴趣的合成基因的温度，以便进行约
20
个和约
25
个之间的退火和延伸循环的扩增
。
24.输送第二引物包括输送包含
200bp
或更长的多
t
序列
(
如果第二引物是反向引物
)
或
200bp
或更长的多a序列
(
如果第二引物是正向引物
)
的第二引物
。
25.与感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列互补或包含该序列的末端与感兴趣的合成基因的约
20bp
至约
40bp
之间
(
例如，约
25bp
和约
40bp
之间
、
约
25bp
和约
30bp
之间
、
约
25bp
和约
35bp
之间
、
约
20bp
和约
35bp
之间
、
约
20bp
和约
30bp
之间等
)
的序列互补或包含该序列
。
包含感兴趣的合成基因的5’
末端区域或与该区域互补的末端区域可以长约
20bp
和约
40bp
之间
(
例如，约
25bp
和约
40bp
之间
、
约
25bp
和约
30bp
之间
、
约
25bp
和约
35bp
之间
、
约
20bp
和约
35bp
之间
、
约
20bp
和约
30bp
之间等
)。
26.这些方法中的任一种可以包括从封闭路径系统的一个或更多个传感器接收
(
例如在控制器中
)
光学传感器数据，其中控制器至少使用光学传感器数据来控制微流控路径装置
(
例如，封闭路径系统
)
的操作
。
这些方法还可以包括在微流控装置中纯化合成产物
。
例如，纯化可以包括去除低于最小长度阈值的多核苷酸
。
最小长度阈值可以是低于约
800bp(
例如，低于约
700bp、
低于约
600bp、
低于约
500bp、
低于约
450bp、
低于约
400bp、
低于约
350bp
等
)。
27.输送可以包括使用一个或更多个流体动力回路在多于一个流体贮库和微流控路径装置之间或在微流控路径装置内移动试剂
。
由此，输送可以包括使用一个或更多个流体动力回路在多于一个流体贮库和微流控路径装置之间或在微流控路径装置内移动试剂
。
28.本文描述的任何方法可以包括使用合成
dna
模板进行体外转录以形成治疗性多核苷酸
。
在一些实例中，治疗性多核苷酸可以至少部分地用递送媒介物包封
。
29.这些方法中的任一种可以包括使用微流控路径装置上的
uv
产率检测窗
(uv
产率检测室的
uv
产率检测窗
)
来确定合成产物的产率
。
当样品保持在装置中时，可以用分光光度法估计产率信息
。
产率信息可以被控制器
(
例如，系统的控制器
)
使用
。
例如，这些方法中的任一种可以包括基于所确定的产率自动稀释微流控路径装置中的合成产物
。
30.在本文描述的任何方法中，控制温度可以包括在微流控路径装置内的聚合酶链式反应期间添加另外的酶
。
31.例如，制备
(
例如，制备包含
dna
模板的合成产物
)
的方法可以包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
包含与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸的第一区域杂交的5’
末端的正向引物
、
和反向引物，其中反向引物包含
150bp
或更长的多
t
序列和与感兴趣的合成基因的5’
末端互补的5’
区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述正向引物和所述反向引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含
150bp
或更长的多a序列的合成产物；以及将所述合成产物输送出所述第一反应器，其中所述合成产物包含所述合成
dna
模板
。
32.一种制备用于体外转录的合成
dna
模板的自动化方法可以包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
包含与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸的第一区域杂交的5’
末端的正向引物
、
和反向引物，其中反向引物包含
150bp
或更长的多
t
序列和与感兴趣的合成基因的5’
末端互补的5’
区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述正向引物和所述反向引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含
150bp
或更长的多a序列的合成产物；以及将所述合成产物输送出所述第一反应器，其中所述合成产物包含所述合成
dna
模板
。
33.在一些实例中，制备
(
例如，制备包含
dna
模板的合成产物
)
的方法可以包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
核苷酸
、
包含与感兴趣的合成基因的第一区域互补的3’
末端的反向引物
、
和正向引物，其中正向引物包含
150bp
或更长的多a序列和与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸的第
二区域杂交的3’
区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述正向引物和所述反向引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含
150bp
或更长的多a序列的合成产物；以及将所述合成产物输送出所述第一反应器，其中所述合成产物包含所述合成
dna
模板
。
34.例如，制备用于体外转录的合成
dna
模板的自动化方法可以包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
核苷酸
、
包含与感兴趣的合成基因的第一区域互补的3’
末端的反向引物
、
和正向引物，其中正向引物包含
150bp
或更长的多
t
序列和与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸的第二区域杂交的3’
区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述正向引物和所述反向引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含
150bp
或更长的多a序列的合成产物；以及将所述合成产物输送出所述第一反应器，其中所述合成产物包含所述合成
dna
模板
。
35.本文还描述了一种制备方法，包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
核苷酸
、
包含与感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列互补或包含感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列的末端的第一引物
、
和第二引物，其中所述第二引物包含
150bp
或更长的多
t
序列
、
或
150bp
或更长的多a序列，以及包含感兴趣的合成基因的5’
末端区域或与感兴趣的合成基因的5’
末端区域互补的末端区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以使所述微流控路径装置的至少一个第一流体反应器热循环，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述第一引物和所述第二引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含启动子区域和
150bp
或更长的多a序列的合成产物，以生成1μm或更多的合成产物；以及将所述合成产物输送至所述微流控路径装置中的第二一个或更多个反应器，其中所述合成产物包含所述合成
dna
模板
。
36.例如，一种制备用于体外转录的合成
dna
模板的自动化方法，该方法包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
包含与感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列互补或包含感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列的末端的第一引物
、
和第二引物，其中所述第二引物包含
150bp
或更长的多
t
序列和包含感兴趣的合成基因的5’
末端区域或与感兴趣的合成基因的5’
末端区域互补的末端区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以使所述微流控路径装置的至少第一流体反应器热循环，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(pcr)
，以使用所述第一引物和所述第二引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含启动子区域和
150bp
或更长的多a序列的合成产物，以生成约
0.5
μm或更多
(
例如，约1μm或更多
、
约2μm或更多
、
约3μm或更多
、
约4μm或更多
、
约5μm或更多
、
约
7.5
μm或更多
、
约
10
μm或更多
、
约
50
μm或更多
、
约
100
μm或更多等
)
的合成产物；以及将所述合成产物输送至所述微流控路径装置中的第二一个或更多个反应器，其中所述合成产物包含所述合成
dna
模板
。
37.纯化所述治疗性多核苷酸可以包括在所述多于一个反应器中的一个或更多个反应器内对所述治疗性多核苷酸进行二维
(2d)
纯化
。2d
纯化可以在本文所述的基本上平坦的微流控路径装置
(
例如，微流控路径板装置
)
内实施，并且可以包括使用材料从治疗性多核苷酸中去除材料
(
例如，双链
rna
等
)。
与其他技术相比，微流控路径装置中
2d
纯化多核苷酸
可能特别有利，其他技术可能涉及使用柱并且可能涉及在如本文所述的封闭路径环境和
/
或小体积中难以或不可能实施的操作
。
在一些实例中，纯化治疗性多核苷酸包括在一个或更多个反应器内使用纤维素材料去除双链
mrna。
38.这些方法中的任一种可以包括在一个或更多个微流控路径装置上的一个或更多个反应器中用递送媒介物配制治疗性多核苷酸以形成治疗性多核苷酸组合物
。
治疗性多核苷酸
(
例如，
mrna)
可以用本文所述的递送媒介物包封，并且在一些实例中，除了治疗性
mrna
之外，还可以包括另外的
mrna
，包括辅助
mrna (
例如，增强免疫应答的
mrna
包封蛋白
)。
递送媒介物可以包含两亲性纳米颗粒，例如氨基脂化类肽
。
39.该系统可以自动且连续地实施以下操作：形成合成模板
、
从模板实施体外转录以及用来自系统的一个或更多个传感器的光学反馈来纯化治疗性多核苷酸
。
40.通常，治疗性多核苷酸可以是
mrna。
例如，治疗性多核苷酸可以是
mrna、
环状
rna
或自我复制的
rna
等
。
41.如上所述，本文所述的方法可以完全或部分地在本地
(
例如，在护理点
)
实施
。
有利地，本文所述的方法可以允许按需制备治疗性
mrna
，而无需在治疗性
mrna
中使用可能降低功效和
/
或引起并发症风险的防腐剂或添加剂
。
在本地将递送媒介物与治疗性多核苷酸
(
例如，治疗性
mrna)
一起配制可能是特别有益的，因为包含治疗性
mrna
和递送媒介物的治疗性组合物可能会随时间聚集和聚簇
。
此外，与现有方法相比，这些方法可以快速实施
。
例如，本文描述的系统可以自动且连续地实施以下操作：形成合成模板
、
从模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸
、
以及在少于5天
(
例如少于4天
、
少于3天等
)
内纯化治疗性多核苷酸
。
42.这些方法中的任一种可以包括将流体贮库密封到一个或更多个微流控路径装置，并在流体贮库和一个或更多个微流控路径装置上的多于一个反应器之间输送试剂之前对流体贮库加压
。
控制器可以控制对流体贮库的加压
。
43.通常，这些方法和设备可以对制备进行部分或全部记录，并且该记录可以是光学的
(
例如，显示流体在微流控路径装置内的移动，包括影片
、
视频等
)
和
/
或非光学的传感器数据
(
压力读数
、
温度读数等
)。
可以保存
、
存储和
/
或传输该制备数据以供以后审查，包括用于质量控制和测试
。
因此，这些方法中的任一种可以包括在实施过程期间以与所制备的治疗性多核苷酸相关联的数据结构
(
例如，数字文件
、
记录等
)
记录一个或更多个微流控路径装置内的流体移动
。
44.本文所述的任一种方法可以通过系统自动或半自动地实施，该系统包括执行软件的计算机
(
例如处理器
)
，该软件配置为实施这些方法中的全部或一些
(
例如，编码这些指令的非暂时性计算机可读介质
)。
例如，包含
(embody)
用于制备治疗性多核苷酸的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包括多于一个流体贮库
(
所述流体贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定
)
的系统的控制器执行时导致控制器实施以下方法：对与一个或更多个微流控路径装置流体连通的多于一个流体贮库加压；在受保护而免于大气接触的密封且封闭的流控路径中，在多于一个流体贮库的一个或更多个流体贮库与一个或更多个微流控路径装置上的多于一个反应器之间输送试剂以实施以下操作：形成合成模板，从模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，以及纯化治疗性多核苷酸
(
例如，全部在一个或更多个微流控路径装置中
)。
45.指令还可以导致控制器自动且连续地实施以下操作：形成合成模板
、
从模板实施
体外转录
、
以及基于来自系统的一个或更多个光学传感器的光学反馈纯化治疗性多核苷酸
。
指令还可以导致控制器控制在多于一个反应器中的一个或更多个反应器中通过二维
(2d)
纯化来纯化治疗性多核苷酸，和
/
或在一个或更多个微流控路径装置上的一个或更多个反应器中用递送媒介物配制治疗性多核苷酸以形成治疗性多核苷酸组合物，和
/
或在一个或更多个微流控路径装置中透析和
/
或浓缩治疗性多核苷酸组合物，等等
。
46.本文还描述了使用本文描述的任一种封闭路径系统制备用于
mrna
合成的合成双链
dna
模板的自动化方法
。
例如，使用封闭路径系统制备用于
mrna
合成的合成双链
dna
模板的方法，该封闭路径系统包括配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个流体贮库，该方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库与一个或更多个微流控路径装置上的多于一个反应器之间输送试剂以组合试剂；并形成用于治疗性
mrna
的体外转录的合成双链
dna
模板
。
47.所形成的合成模板
(
合成双链
dna
模板
)
可以不含细菌
dna
并且不含内毒素
。
48.这些方法可以包括在用于封闭路径系统的控制器中接收来自封闭路径系统的一个或更多个传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制封闭路径系统的操作
。
49.所述方法可以包括对流体贮库加压，和
/
或输送试剂包括将感兴趣的合成基因和合成体外转录促进子
(facilitator)
盒从多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库输送到微流控路径装置中的第一一个或更多个反应器中，连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒以创建合成产物，从合成产物中去除未反应的材料，并扩增合成产物以生成合成双链
dna
模板
。
一个或更多个微流控路径装置包含位于封闭路径系统中的微流控路径板装置
。
50.有利地，与其他系统
(
其通常仅产生
fm(femtomolar)
量
)
相比，这些方法可以包括制备大量的模板
(mm
量
)。
本文所述的方法和设备可以产生大量模板
。
51.一种使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的自动化方法，该封闭路径系统包括与微流控路径装置密封流体连通的多于一个流体贮库，该方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，将包括感兴趣的合成基因和合成体外转录促进子盒的试剂从多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库输送到微流控路径装置中的第一一个或更多个反应器；连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒以创建合成产物；在微流控路径装置中输送合成产物以从合成产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒；以及在微流控路径装置中输送合成产物，并扩增合成产物以生成双链
dna
模板
。
如提及的，扩增合成产物可以包括生成大于约
0.5
μm或更多
(
例如，约1μm或更多
、
约2μm或更多
、
约3μm或更多
、
约4μm或更多
、
约5μm或更多
、
约
7.5
μm或更多
、
约
10
μm或更多
、
约
50
μm或更多
、
约
100
μm或更多等
)
的扩增
dna
模板
。
52.本文还描述了使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的自动化方法，该封闭路径系统包括与微流控路径装置密封流体连通的多于一个流体贮库，该方法包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，将包括感兴趣的合成基因和合成体外转录
(ivt)
促进子盒的试剂从多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库输送到微流控路径装置中的第一一个或更多个反应器；在第一一个或更多个反应器中连接感兴趣的合
成基因与合成
ivt
促进子盒，以创建合成产物；将合成产物输送到微流控路径装置中的第二一个或更多个反应器，以从合成产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成
ivt
促进子盒；以及将合成产物输送到微流控路径装置中的第三一个或更多个反应器，并扩增合成产物以生成大于约
0.5
μm或更多
(
例如，约1μm或更多
、
约2μm或更多
、
约3μm或更多
、
约4μm或更多
、
约5μm或更多
、
约
7.5
μm或更多
、
约
10
μm或更多
、
约
50
μm或更多
、
约
100
μm或更多等
)
的扩增
dna
模板；以及在用于封闭路径系统的控制器中接收来自封闭路径系统的一个或更多个传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制封闭路径系统的操作
。
53.例如，使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的自动化方法，该封闭路径系统包括与微流控路径装置密封流体连通的多于一个流体贮库，该方法可以包括：使用第一流体动力回路，在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，将感兴趣的合成基因和合成体外转录
(ivt)
促进子盒从多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库输送到微流控路径板装置的一个或更多个连接反应器中，并连接感兴趣的合成基因与
ivt
促进子盒以创建合成产物；使用第二流体动力回路，从微流控路径板装置中的合成产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒；使用第三流体动力回路，将合成产物转移到微流控路径装置的一个或更多个扩增反应器中，并扩增合成产物以生成大于约
0.5
μm或更多
(
例如，约1μm或更多
、
约2μm或更多
、
约3μm或更多
、
约4μm或更多
、
约5μm或更多
、
约
7.5
μm或更多
、
约
10
μm或更多
、
约
50
μm或更多
、
约
100
μm或更多等
)
的扩增
dna
模板；以及在用于封闭路径系统的控制器中接收来自封闭路径系统的一个或更多个光学传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制第一
、
第二和第三流体动力回路，并将多于一个流体贮库和微流控路径装置保持在封闭路径和密封环境中
。
54.在这些方法中的任一种中，合成双链
dna
模板不含细菌
dna
并且不含内毒素
。
55.这些方法中的任一种可以包括在用于封闭路径系统的控制器中接收来自封闭路径系统的一个或更多个传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制封闭路径系统的操作
。
光学传感器数据可以是来自相机或其他成像传感器的数据
。
本文所述的方法可以使用一个或更多个流体动力回路在多于一个流体贮库和微流控路径装置之间或在微流控路径装置内移动材料
。
控制器可以协调流体动力回路的操作，包括使用光学信息来协调
。
例如，控制器可以确定流体在封闭路径系统的一个或更多个部分
(
例如，微流控路径传感器的贮库
、
流体管线和
/
或区域
)
内
。
56.这些方法中的任一种可以包括将扩增的
dna
模板转移到微流控路径装置的一个或更多个消化反应器中，并酶促修饰扩增的合成产物以生成双链
dna
模板
。
57.如本文所用，连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒以创建合成产物可以包括创建合成的线性或环状连接产物
。
连接可以经由连接和
/
或杂交和
/
或退火和
/
或引物延伸实施
。
在一些实例中，扩增合成产物包括生成线性
、
分支或环状扩增的
dna
产物，还包括将扩增的
dna
产物线性化以生成双链
dna
模板
。
连接可以包括用
dna
连接酶连接或通过引物延伸连接
。
在一些实例中，扩增包括多重置换扩增
(mda)。
可选地，扩增可以包括聚合酶链式反应
(pcr)
扩增
。
58.在一些实例中，合成体外转录促进子盒可以包含含有以下的双链
dna
模板：启动子
、5’utr、
可裂解的接头
、3’utr、
以及编码包含至少连续
200
个腺嘌呤残基或
200
个胸苷残
基的多a区域的部分
。
双链
dna
模板可以包含在感兴趣的合成基因的3’
末端至少
300bp
长的多a区域
。
通常，体外转录促进子盒的长度可以小于
l kb。
在一些实例中，合成体外转录促进子盒不编码抗生素抗性基因，和
/
或不具有复制起点
(ori)。
59.本文还描述了使用模板材料
(
包括但不限于上述模板材料
)
实施体外转录
(ivt)
以形成治疗性
mrna
的自动化方法和设备
。
例如，本文描述了使用系统自动实施体外转录
(ivt)
反应的方法和设备，该系统包括配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个流体贮库，该方法包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个流体储库中的一个或更多个流体储库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施从模板体外转录治疗性
mrna
，并纯化治疗性多核苷酸
。
60.例如，使用系统实施体外转录
(ivt)
反应的自动化方法，该系统包括配置为与微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个流体贮库，该方法包括：将
dna
模板
、
聚合酶和核苷酸从多于一个流体贮库中的流体贮库和微流控路径装置上的部位中的一个或更多个递送到微流控路径装置的一个或更多个
ivt
反应器中；在一个或更多个
ivt
反应器中处理
dna
模板和核苷酸以形成治疗性
mrna
；以及将治疗性
mrna
转移到微流控路径装置的一个或更多个纯化反应器区域中，并在一个或更多个纯化反应器区域内通过二维
(2d)
纯化来纯化治疗性
mrna
，其中微流控路径装置和多于一个流体贮库形成封闭路径和密封环境，防止大气暴露
。
61.通常，该系统可以包括控制器以实施这些方法，这些方法包括例如通过偏转微流控路径装置内的一个或更多个弹性层来实施输送试剂的操作
。
这些方法可以包括在系统的控制器中接收来自系统的一个或更多个传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制系统的操作
。
控制器还可以控制对流体贮库的加压
。
在本文所述的方法中的任一种中，该系统可以包括位于系统中的微流控路径装置
。
62.通常，
dna
模板可以包含感兴趣的合成基因的双链
dna
模板和合成体外转录促进子盒
。
63.这些方法中的任一种可以包括使用由控制器控制的一个或更多个流体动力回路来递送和输送，以在多于一个流体贮库和微流控路径装置之间或在微流控路径装置内移动
dna
模板
、
聚合酶
、
核苷酸和治疗性
mrna
材料
。
例如，递送和输送操作可以在控制器的控制下通过偏转微流控路径装置内的一个或更多个弹性层来实施，以便在该方法过程中避免大气接触
。
64.在一些实例中，使用
ivt
反应器；该
ivt
反应器可以包含一对连接的室，每个室具有液体接收部分和压力接收部分，其中液体接收部分通过弹性层与压力接收部分分开，该弹性层可以被压力接收部分偏转以调节液体接收部分的体积
。dna
模板可以包含感兴趣的合成基因的双链
dna
模板和合成体外转录促进子盒
。
65.这些方法中的任一种可以包括将多于一个流体贮库密封为与微流控路径装置上的多于一个接收端口流体连通
。
66.例如，一种使用系统实施体外转录
(ivt)
反应的自动化方法，该系统包括配置为与微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个流体贮库，该方法可以包括：对多于一个流体贮库加压；使用一个或更多个第一流体动力回路以亚微升精度计量的量将
dna
模板
、
聚
合酶和核苷酸从多于一个流体贮库的流体贮库和微流控路径装置上的位点中的一个或更多个递送到微流控路径装置的一个或更多个
ivt
反应器中；在一个或更多个
ivt
反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；并且使用第二流体动力回路将治疗性
mrna
转移到微流控路径装置的一个或更多个纯化反应器区域中，并在一个或更多个纯化反应器区域内通过二维
(2d)
纯化来纯化治疗性
mrna
，其中微流控路径装置和多于一个流体贮库形成封闭路径和密封环境，防止大气暴露
。
67.如提及的，本文还描述了配置为实施本文描述的这些方法中的任一种的软件和
/
或固件
。
例如，本文描述了包含用于实施体外转录
(ivt)
反应的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由系统
(
该系统包括配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个流体贮库
)
的控制器执行时导致控制器实施以下方法：在反应期间的任何时间以亚微升精度计量的量将模板材料
、
聚合酶和核苷酸从多于一个流体贮库气动递送到微流控路径装置的第一反应器中；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；以及通过微流控路径装置将治疗性
mrna
气动转移出第一反应器，其中第一微流控路径装置和多于一个流体贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
68.如以上提及的，在一些实例中，本文所述的方法和设备可以用于通过自动组合治疗性多核苷酸
(
例如治疗性
mrna)
与递送媒介物来配制
(
例如复合
)
治疗性组合物，例如以用递送媒介物包封治疗性
mrna。
这可以在如本文所述的设备内完成，并且在一些实例中，可以包括形成模板和
/
或治疗性多核苷酸
。
例如，使用系统制备治疗性
mrna
组合物的方法，该系统包括与一个或更多个微流控路径板装置密封流体连通的多于一个流体贮库，其中一个或更多个微流控路径板装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：将模板前体材料从多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库递送到多于一个反应器中的第一反应器，并处理模板前体材料以从模板前体材料形成
dna
模板；将
dna
模板转移到多于一个反应器中的第二反应器，并通过体外转录处理
dna
模板以形成治疗性
mrna
；将治疗性
mrna
转移到多于一个反应器中的第三反应器，并处理治疗性
mrna
以将其与递送媒介物组合，以形成治疗性
mrna
组合物；以及将治疗性
mrna
组合物转移到与第三反应器流体连通的浓缩器
。
将治疗性
mrna
转移到第三反应器可以包括转移多于一种不同的治疗性
mrna
与递送媒介物以形成
mrna
组合物
。
递送和转移操作可以通过系统中由控制器控制的一个或更多个流体动力回路实施
。
例如，控制器可以通过偏转一个或更多个微流控路径板装置内的一个或更多个弹性层来控制流体动力回路
。
该方法可在护理点实施
。
69.这些方法
(
和实施它们的系统
)
中的任一种可以配置为自动地且在同一微流控路径装置中透析治疗性组合物
(
例如，用递送媒介物包封的
mrna)
以去除材料和
/
或浓缩治疗性组合物
。
例如，这些方法中的任一种可以包括在一个或更多个微流控路径板装置中透析
mrna
治疗性组合物以纯化
mrna
治疗性组合物
。
可以使用任何合适的纳米颗粒
(
例如，两亲性纳米颗粒，诸如氨基脂化类肽
)。
70.此外，这些方法中的任一种可以包括在与第二反应器流体连通的多于一个反应器中的一个或更多个反应器内的二维
(2d)
纯化
。
71.制备治疗性
mrna
组合物的方法可以是快速的，特别是与己知的工艺和技术相比
。
例如，本文所述的方法可能需要约5天或更短时间
(
例如，约4天或更短时间
、
约
72
小时或更短时间等
)
来形成治疗性组合物
(
治疗性
mrna
和递送媒介物
)
，包括形成合成模板
(
例如，从
头合成而不使用细菌前体
)。
72.例如，使用系统制备治疗性
mrna
的方法，该系统包括与一个或更多个微流控路径板装置密封流体连通的多于一个流体贮库，其中一个或更多个微流控路径板装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：对多于一个流体贮库加压；控制第一流体动力回路，从而将模板前体材料以亚微升精度且不与大气接触地从多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库递送到多于一个反应器中的第一反应器；处理模板前体材料以从模板前体材料形成
dna
模板；控制第二流体动力回路，从而将
dna
模板以亚微升精度且不与大气接触地转移至多于一个反应器中的第二反应器；通过体外转录处理
dna
模板以形成治疗性
mrna
；控制第三流体动力回路，从而将治疗性
mrna
以亚微升精度且不与大气接触地转移至多于一个反应器中的第三反应器；处理治疗性
mrna
以将其与递送媒介物组合，以形成治疗性
mrna
组合物；控制第三流体动力回路以将治疗性
mrna
组合物转移至与第三反应器流体连通的浓缩器；以及浓缩治疗性
mrna
组合物
。
73.本文所述的方法和设备可用于提供治疗性多核苷酸组合物的按需合成
。
在一些实例中，这些方法可以包括远程合成一些组分并使用该设备以本地合成治疗性多核苷酸组合物，随后可以将其递送给患者
。
例如，按需产生治疗性多核苷酸组合物的方法，该方法包括：在本地设施接收己在远程设施中合成的治疗性多核苷酸；通过在受保护而免于大气接触的自动化系统中实施以下操作在本地设施配制治疗性多核苷酸组合物：在保持在系统中的微流控路径装置中将治疗性多核苷酸与递送媒介物组合以形成治疗性多核苷酸组合物，在微流控路径装置中透析治疗性多核苷酸组合物；以及提供治疗性多核苷酸组合物
。
74.合成治疗性多核苷酸可以包括使用远程设施处的微流控系统通过在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径装置中实施以下操作来合成治疗性多核苷酸：形成合成模板
、
从合成模板实施体外转录以形成治疗性多核苷酸；以及纯化治疗性多核苷酸
。
75.例如，按需产生治疗性
mrna
组合物的方法，该方法包括：在远程设施合成治疗性
mrna
；将治疗性
mrna
输送到本地设施；在本地设施通过在受保护而免于大气接触的自动化封闭的流控路径装置中实施以下操作来配制治疗性
mrna
组合物：在微流控路径装置中将治疗性
mrna
与递送媒介物组合以形成治疗性
mrna
组合物，在微流控路径装置中透析治疗性
mrna
组合物；并提供治疗性
mrna
组合物
。
本地设施是医院或诊所，并且通常包括一个或更多个微流体控制系统，如本文所述
。
在一些实例中，远程设施可以是制备设施，其包括一个或更多个例如，如本文所述的多于一个微流体控制系统
。
76.本文所述的方法还可以包括浓缩治疗性多核苷酸组合物
。
77.这些方法中的任一种可以包括使用如本文所述的系统合成治疗性多核苷酸，然后将它们储存
(
例如，冷藏和
/
或冷冻
)
并在冷藏储存时将它们从远程设施转移
(
例如，运输它们
)
到本地设施，以及在本地设施接收治疗性多核苷酸
(
例如，
mrna)。
例如，治疗性多核苷酸组合物可以包含
mrna
疫苗
。
这些方法中的任一种可以包括使用该系统配制治疗性多核苷酸，其中该系统包括多于一个流体贮库，该贮库被配置为与该微流控路径装置以密封流体连通固定
。
78.第一流体动力回路可用于将治疗性多核苷酸和递送媒介物以亚微升精度且不与大气接触地从多于一个流体贮库递送至微流控路径装置中的一个或更多个反应器，以便将治疗性多核苷酸与递送媒介物组合
。
79.如提及的，这些治疗性组合物中的任一种可以包括用相同
(
或不同
)
递送媒介物包封的多于一种
mrna(
包括但不限于多于一种治疗性
mrna)。
例如，在本地设施形成治疗性多核苷酸组合物还可以包括将一种或更多种另外的治疗性多核苷酸与治疗性多核苷酸和递送媒介物组合
。
可以使用任何合适的递送媒介物，其包括本文所述的那些
。
治疗性多核苷酸可以是
mrna
，诸如线性
mrna、
环状
rna
或自我复制
rna
等
。
80.治疗性多核苷酸可以在冷
(
例如，约4度
、
约0度
、
约-10
度等
)
温度稳定达数月
(
例如，约1个月或更长
、
约2个月或更长
、
约3个月或更长
、
约6个月或更长
、
或约8个月或更长
、
约9个月或更长
、
约1年或更长等
)
并且可以远程或本地储存
。
例如，这些方法可以包括在配制治疗性组合物之前将治疗性多核苷酸储存在本地设施中
。
81.例如，使用封闭路径系统制备
mrna
治疗性组合物的方法，该封闭路径系统包括多于一个储存贮库，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施以下操作中的每一步：形成
dna
模板
、
从模板实施治疗性
mrna
的体外转录
、
纯化治疗性
mrna
以及将
mrna
与递送媒介物组合
。
82.一种使用封闭路径系统制备
mrna
治疗性组合物的方法，该封闭路径系统包括多于一个储存贮库，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置
(
其中一个或更多个微流控路径装置包含多于一个反应器
)
以密封流体连通固定，该方法可以包括：将模板前体材料从一个或更多个储存贮库递送到多于一个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；将模板转移到多于一个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性
mrna
；以及将治疗性
mrna
转移到多于一个反应器的第三反应器区域，并处理治疗性
mrna
以将其与递送媒介物组合，以形成
mrna
治疗性组合物，其中包括模板前体材料和递送媒介物的材料在不与大气接触的情况下从储存贮库递送到多于一个反应器中
。
83.一种使用封闭路径系统制备
mrna
治疗性组合物的方法，该封闭路径系统包括与一个或更多个微流控路径装置
(
例如，其中一个或更多个微流控路径装置包含多于一个反应器
)
密封流体连通的多于一个储存贮库，该方法可以包括：诱导流体流动以将模板前体材料从一个或更多个储存贮库递送到多于一个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；将模板转移至多于一个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成
mrna
；将
mrna
转移至多于一个反应器的第三反应器区域并处理
mrna
，以将其与递送媒介物组合以形成
mrna
治疗性组合物；以及转移一个或更多个储存贮库的
mrna
产物贮库，其中将材料以亚微升精度且不与大气接触地从储存贮库递送到微流控路径装置的反应器中
。
在本文所述方法的任一种中，可以气动地实施任何操作，例如，可以气动地诱导流体流动
、
可以气动地转移流体等
。
可选地或另外，可以通过机械
、
液压等方式驱动流体
。
84.在这些方法
(
和用于实施它们的设备
)
的任一种中，封闭路径系统可以自动且连续地实施以下步骤：形成模板
、
从模板实施治疗性
mrna
的体外转录
、
纯化治疗性
mrna
以及将
mrna
和递送媒介物组合
。
封闭路径系统可以气动控制以下操作的实施：形成模板
、
从模板实施治疗性
mrna
的体外转录
、
纯化治疗性
mrna
以及将
mrna
和递送媒介物组合
。
在一些实例中，
封闭路径系统气动控制以下操作的实施：形成模板
、
从模板实施治疗性
mrna
的体外转录
、
纯化治疗性
mrna
以及通过偏转在一个或更多个微流控路径装置内的一个或更多个膜，将
mrna
和递送媒介物组合
。
85.本文所述的任何方法和设备都可以配置为在护理点
(
诸如医院
、
诊所等
)
设置和操作
。
这可以允许为特定的患者定制制备即时
/
按需的患者特异性治疗剂
。
可选地或另外，对特定患者不是特异性的治疗分子可以以“患者个体化”的方式用递送媒介物配制
。
由于本文描述的方法和设备，这些方法中的任一种都可以非常快速地实施
。
例如，封闭路径系统可以在少于约5天的时间内自动并连续地实施以下过程：形成模板
、
从模板实施治疗性
mrna
的体外转录
、
纯化治疗性
mrna
以及将
mrna
和递送媒介物组合
。
可选地，系统可以使用预先制备的模板作为输入，并在更短的时间内实施剩余的操作
。
86.将
mrna
和递送媒介物组合
(
配制治疗剂
)
还可以包括在一个或更多个微流控路径装置中透析
mrna
治疗性组合物以纯化
mrna
治疗性组合物
。
87.这些方法中的任一种还可以包括在一个或更多个微流控路径装置上浓缩
mrna
治疗性组合物，和
/
或透析治疗剂
。
88.可以使用任何合适的递送媒介物，包括例如两亲性纳米颗粒
。
例如，两亲性纳米颗粒可以包含氨基脂化类肽
。
89.可选地或另外，在本文所述的任何方法和设备中，
mrna
可以预先制备并储存
(
例如，在约
10
摄氏度
、
约4摄氏度
、
约0摄氏度
、
约-10
摄氏度等
)
一段时间
。
例如，这些方法和用于实施它们的设备中的任一种可以包括治疗性
mrna
文库，治疗性
mrna
可以单独或共同地
(
例如，可以将
2、3、4、5、6
等或更多个单独的治疗性
mrna
组合，以及
)
复合以形成
mrna
治疗性组合物
。
如本文所述，
mrna
治疗性组合物因此可以按需制备，并且可以以单一或多于一种
mrna
治疗性组合物“鸡尾酒”的方式适时配制
。
90.本文还描述了用于形成模板
(
例如，
dna
模板
)
的方法
。
例如，使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的方法，该封闭路径系统包括与微流控路径装置密封流体连通的多于一个储存贮库，该方法可以包括：连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物；从合成的线性或环状连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒；扩增环状连接产物以生成线性
、
分支或环状扩增的
dna
；以及将扩增的
dna
连接产物线性化以生成双链
dna
模板，其中连接
、
去除
、
扩增和线性化操作中的每一步都是通过封闭路径系统在微流控路径装置中实施的
。
91.例如，制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的高效
、
自动化方法可以包括：将感兴趣的合成基因和合成体外转录促进子盒中的每一种从与微流控路径装置流体连通的多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库气动递送到微流控路径装置的连接反应器中，以通过连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒来创建合成的线性或环状连接产物；将一种或更多种核酸外切酶剂从多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库气动引入到连接反应器中，以通过从合成的线性或环状连接物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒来去除未反应的材料；将合成的线性或环状连接产物气动递送到微流控路径装置的扩增反应器中，以与一种或更多种扩增剂组合用来扩增线性或环状连接产物以生成线性
、
分支或环状扩增的
dna
；以及将扩增的
dna
连接产物气动转移到微流控路径装置的消化反应器中，以通过将扩增的
dna
连接产物线性化来生成不含任何未
反应输入材料的完全合成的双链
dna
模板，其中连接反应器
、
扩增反应器和消化反应器以及多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境
。
92.一种制备用于
mrna
治疗性组合物的合成双链
dna
模板的方法
(
使用包含多于一个储存贮库的封闭路径系统，所述储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定
)
，该方法可以包括：在受保护而免于与大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中形成用于治疗性
mrna
的体外转录的模板
。
93.通常，本文所述的方法和设备可以产生可以不含细菌
dna
和
/
或不含内毒素的双链
dna
模板
。
本文所述的模板生成方法和设备可以不涉及细菌培养
。
此外，如本文所述制备的治疗性
mrna
可以从模板合成而不使用细菌多核苷酸
。
因此，本文所述的方法中的任一种可以是用于在不使用细菌
dna
和
/
或与内毒素分离的情况下产生治疗性
mrna
的方法
。
特别地，本文描述了制备不含细菌
dna
和
/
或内毒素的双链
dna
模板的方法
。
本文所述的方法中的任一种可以是无菌制备方法
。
94.这些方法中的任一种可以包括用
iis
型限制性内切酶和
/
或甲基化敏感性限制性内切酶消化合成体外转录模板
。
连接可以包括用
dna
连接酶连接，或通过
dna
合成连接，或通过引物延伸连接
。
去除可以包括用核酸外切酶或通过甲基化敏感性限制性内切酶消化线性
dna。
核酸外切酶可以包括核酸外切酶
v。
扩增可以包括多重置换扩增
(mda)。
扩增可以包括用
φ
29dna
聚合酶扩增
。
扩增可以包括生成分支的扩增
dna。
扩增可以包括聚合酶链式扩增
(pcr)。
扩增可以包括用热稳定
dna
聚合酶扩增
。
95.线性化可以包括用
iis
型限制性内切酶消化
。
线性化可以包括用
bsai
限制性内切酶消化
。
合成体外转录模板的消化可以包括用甲基化敏感性限制性内切酶诸如
dpni
消化
。
感兴趣的合成基因可以是线性的
。
在一些实例中，合成体外转录促进子盒包含含有以下的双链
dna
模板：启动子
、5’utr、
可裂解的接头
、3’utr、
以及编码包含至少连续
200
个腺嘌呤残基或
200
个胸苷残基的多a区域的部分
。
合成体外转录促进子盒可以作为单个单元或作为两个或更多个单元递送
。
编码多a区域的部分可以是至少
300bp
长
。
在一些实例中，编码多a区域的部分可以是至少
350bp
长
。
96.感兴趣的合成基因可以包含
t
细胞受体的至少一部分
。
感兴趣的合成基因可以包含互补决定区
(cdr)。
97.体外转录促进子盒的长度可以小于约
2kb。
体外转录促进子盒的长度可以小于约
1kb。
体外转录促进子盒的长度可以小于约
700
个碱基对
。
合成体外转录促进子盒可以不编码抗生素抗性基因
。
98.合成的线性或环状连接产物可以不具有复制起点
(ori)。
体外转录促进子盒可以不具有复制起点
(ori)。
99.如提及的，本文描述的任何方法的操作可以在封闭的微流控路径装置中进行
。
这些操作可以在封闭的微流控路径装置中实施，并且连接操作可以在与扩增操作不同的模块
(
例如，不同的微流控路径装置
)
中实施，并且扩增操作在与线性化操作不同的模块中实施
。
100.这些方法中的任一种可以包括在一个或更多个微流控路径装置的封闭路径中纯化模板
。
101.本文还描述了使用本文描述的封闭路径方法和设备实施体外转录的方法
。
例如，使用封闭路径系统
(
例如，包含配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个储存贮库
)
实施体外转录
(ivt)
反应的方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间的输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中从模板实施治疗性
mrna
的体外转录
。
102.一种实施体外转录
(ivt)
反应的方法可以包括：通过定向流体流动以亚微升精度计量的量将
dna
模板
、
聚合酶和核苷酸从多于一个储存贮库自动递送到微流控路径装置的第一反应器中；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；以及通过微流控路径装置将治疗性
mrna
气动转移出第一反应器，其中第一微流控路径装置和多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
103.封闭路径系统可以自动连续操作
。
封闭路径系统可以气动控制从模板体外转录治疗性
mrna
的性能
。
104.这些方法中的任一种也可以包括在一个或更多个微流控装置中纯化治疗性
mrna。
输送试剂可以包括从多于一个储存贮库输送试剂到微流控路径装置的第一反应器
。
105.本文还描述了配制
(
例如，与递送媒介物组合
)
治疗性
mrna
的方法
。
例如，制备
mrna
治疗性组合物的方法
(
例如，使用包含多于一个储存贮库的封闭路径系统，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定
)
可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和在一个或更多个微流控路径装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中通过将治疗性
mrna
与递送媒介物组合来配制
mrna
治疗性组合物
。
封闭路径系统可以自动且连续地将
mrna
与递送媒介物组合
。
封闭路径系统可以气动控制
mrna
与递送媒介物组合
。
例如，封闭路径系统可以通过偏转一个或更多个微流控路径装置内的一个或更多个膜来气动控制
mrna
与递送媒介物组合
。
106.例如，本文描述了使用包括多于一个储存贮库的系统制备
mrna
的方法，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定
。
这些方法中的任一种可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施
mrna
的体外转录，以及纯化
mrna。
107.一种使用包括多于一个储存贮库的系统制备治疗性
mrna
组合物的方法，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，纯化治疗性
mrna
，以及用递送媒介物配制
mrna。
108.一种使用包括多于一个储存贮库的系统制备治疗性
mrna
组合物的方法，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库
和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，纯化治疗性
mrna
，用递送媒介物配制
mrna
，以及对所配制的治疗性
mrna
进行纯化和浓缩
。
109.一种使用包括多于一个储存贮库的系统制备治疗性
mrna
组合物的方法，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法可以包括：遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的用于形成治疗性
mrna
组合物的操作顺序，其中这些操作包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，纯化治疗性
mrna
，以及将
mrna
和递送媒介物组合
。
110.本文还描述了使用包括多于一个储存贮库的系统制备治疗性
mrna
组合物的方法，该储存贮库配置为与微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法包括在微流控路径装置上从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，以及在微流控路径装置上的一个或更多个流体连接的反应器中纯化治疗性
mrna。
111.本文还描述了通过这些方法中的任一种制备的治疗剂，尤其包括
mrna
治疗剂
。
例如，本文描述了使用包括多于一个储存贮库的系统制备的治疗性
mrna
，所述储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该
mrna
通过以下方式制备：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施
mrna
的体外转录，以及纯化治疗性
mrna。
112.例如，本文描述了使用包括多于一个储存贮库的系统制备的治疗性
mrna
，所述储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该
mrna
通过以下方式制备：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，纯化治疗性
mrna
，以及用递送媒介物配制
mrna。
113.例如，本文描述了使用包括多于一个储存贮库的系统制备的治疗性
mrna
，所述储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该
mrna
通过以下方式制备：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，纯化治疗性
mrna
，用递送媒介物配制
mrna
，以及对配制的治疗性
mrna
实施纯化和浓缩
。
114.本文描述了使用包括多于一个储存贮库的系统形成的治疗性
mrna
组合物，所述储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该治疗性
mrna
组合物通过以下形成：遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的用于形成治疗性
mrna
组合物的操作顺序，其中这些操作包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库与一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间
输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，纯化治疗性
mrna
，以及将
mrna
和递送媒介物组合
。
例如，治疗性
mrna
可以是使用包括多于一个储存贮库的系统形成的治疗
mrna
组合物，该储存贮库配置为与微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法包括在微流控路径装置上从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，以及在微流控路径装置上的一个或更多个流体连接的反应器中纯化治疗性
mrna。
115.本文描述的任何系统可以包括被配置成实施这些方法中的任一种的控制器
。
因此，本文还描述了被配置成实施本文描述的任何方法的软件
、
固件或硬件
。
例如，本文描述了包含用于制备
mrna
的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包括多于一个储存贮库的系统的控制器执行时导致控制器实施以下方法，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，以及纯化治疗性
mrna。
116.例如，本文描述了包含用于制备
mrna(
包括治疗性
mrna
组合物
)
的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包括多于一个储存贮库的系统的控制器执行时导致控制器实施本文所述方法中的任一种，该储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定
。
117.本文还描述了使用封闭路径系统制备用于
mrna
的合成双链
dna
模板的方法，该封闭路径系统包括配置成与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个储存贮库，该方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以组合试剂；并形成用于治疗性
mrna
的体外转录的模板
。
118.例如，一种使用封闭路径系统制备合成双链
dna
模板以用作
mrna
体外转录反应的输入的方法，该封闭路径系统可以包括多于一个储存贮库，这些储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，所述方法包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂；并形成用于治疗性
mrna
的体外转录的模板
。
119.一种使用包括多于一个储存贮库的系统制备
mrna
组合物的方法，所述储存贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，其中一个或更多个微流控路径装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：将模板前体材料从一个或更多个储存贮库递送到多于一个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；将模板转移至多于一个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成
mrna
；以及将
mrna
转移至多于一个反应器的第三反应器区域，并处理
mrna
以将其与递送媒介物组合以形成
mrna
组合物，其中在不与大气接触的情况下将包括模板材料和递送媒介物的材料从储存贮库递送到多于一个反应器中
。
120.一种使用系统制备
mrna
组合物的方法，所述系统包括与一个或更多个微流控路径装置密封流体连通的多于一个储存贮库，其中一个或更多个微流控路径装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：将模板前体材料从一个或更多个储存贮库气动输送到多于一个
反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；将模板气动转移至多于一个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成
mrna
；将
mrna
气动转移至多于一个反应器的第三反应器区域，并处理
mrna
以将其与递送媒介物组合，以形成治疗性
mrna
组合物；以及将
mrna
产物转移至一个或更多个储存贮库，其中以亚微升精度将材料从储存贮库递送至微流控路径装置的反应器中，而不与大气接触
。
121.一种使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的方法，该封闭路径系统包括与微流控路径装置密封流体连通的多于一个储存贮库，该方法可以包括：连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物；从合成的线性或环状连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒；扩增线性或环状连接产物以生成线性
、
分支或环状扩增的
dna
；以及将扩增的
dna
连接产物线性化以生成双链
dna
模板，其中连接
、
去除
、
扩增和线性化操作中的每一步都是通过封闭路径系统在微流控路径装置中实施的
。
122.这些方法中的任一种都可以是高效自动化方法，其包括制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的高效自动化方法
。
例如，方法可以包括：将感兴趣的合成基因和合成体外转录促进子盒中的每一种从与微流控路径装置流体连通的多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库气动递送至微流控路径装置的连接反应器中，以通过连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒创建合成的线性或环状连接产物；将一种或更多种核酸外切酶剂从多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库气动引入到连接反应器中，以通过从合成的线性或环状连接物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒来去除未反应的材料；将合成的线性或环状连接产物气动递送到微流控路径装置的多重置换扩增
(mda)
反应器或聚合酶链式反应
(pcr)
反应器中，以与一种或更多种扩增剂组合用来扩增线性或环状连接产物以生成线性
、
分支或环状扩增的
dna
；以及将扩增的
dna
连接产物气动转移至微流控路径装置的消化反应器，以通过将扩增的
dna
连接产物线性化来生成双链
dna
模板，其中连接反应器
、mda
反应器或
pcr
反应器和消化反应器以及多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境
。
123.一种制备用于体外转录的合成双链
dna
模板的方法，该方法包括遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的操作顺序，该方法可以包括：将感兴趣的合成基因和合成体外转录促进子盒中的每一种从与微流控路径装置流体连通的多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库递送至微流控路径装置的连接反应器中，以通过连接感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒创建合成的线性或环状连接产物；将一种或更多种核酸外切酶剂从多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库引入到连接反应器中，以通过从合成的线性或环状连接物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒来去除未反应的材料；将合成的线性或环状连接产物递送到微流控路径装置的多重置换扩增
(mda)
反应器或聚合酶链式反应
(pcr)
反应器中，以与一种或更多种扩增剂组合用来扩增线性或环状连接产物以生成线性
、
分支或环状扩增的
dna
；以及将扩增的
dna
连接产物转移至微流控路径装置的消化反应器，以通过将扩增的
dna
连接产物线性化来生成双链
dna
模板，其中连接反应器
、mda
反应器反应器和消化反应器以及多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境
。
124.一种使用包括多于一个储存贮库的系统实施体外转录
(ivt)
反应的方法，该储存
贮库配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施治疗性
mrna
从模板的体外转录
。
125.本文还描述了实施体外转录
(ivt)
反应的方法，该方法包括遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的操作顺序，其中这些操作包括：在反应期间的任何时间以亚微升精度计量的量将模板材料
、
聚合酶和核苷酸从多于一个储存贮库气动递送到微流控路径装置的第一反应器中；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；以及通过微流控路径装置将治疗性
mrna
气动转移出第一反应器，其中第一微流控路径装置和多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
126.本文还描述了实施体外转录
(ivt)
反应的方法，该方法包括遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的操作顺序，其中这些操作包括：遵循操作顺序，通过诱导的流体流动以由控制器控制的量将模板材料
、
聚合酶和核苷酸从多于一个储存贮库递送到微流控路径装置中；在一个或更多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；并且通过微流控路径装置将治疗性
mrna
转移出一个或更多个反应器，其中第一微流控路径装置和多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
127.本文还描述了实施体外转录
(ivt)
反应的方法，该方法包括：通过诱导的流体流动以由预编程的软件命令控制的量将模板材料
、
聚合酶和核苷酸从多于一个储存贮库递送到微流控路径装置中；在微流控路径装置中的第一一个或更多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；并且通过微流控路径装置将治疗性
mrna
转移出第一一个或更多个反应器到适于纯化
mrna
的第二一个或更多个反应器中，其中微流控路径装置和多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
128.本文还描述了实施体外转录
(ivt)
反应的方法，该方法包括遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的操作顺序，其中这些操作包括：通过诱导的流体流动以由操作顺序控制的量将模板材料
、
聚合酶和核苷酸从多于一个储存贮库递送到第一微流控路径装置的第一一个或更多个反应器中；在第一一个或更多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；并且通过第一微流控路径装置将治疗性
mrna
转移出第一一个或更多个反应器到适于纯化
mrna
的第二一个或更多个反应器中；并且转移如此纯化的
mrna
以完成
mrna
治疗剂的配制，其中第一微流控路径装置和多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
129.本文还描述了实施体外转录
(ivt)
反应的方法，该方法包括遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的操作顺序，其中这些操作包括：将模板材料
、
聚合酶和核苷酸从多于一个储存贮库气动递送到第一微流控路径装置的第一一个或更多个反应器中；在第一一个或更多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；并且通过第一微流控路径装置将治疗性
mrna
转移出第一一个或更多个反应器到适于纯化
mrna
的第二一个或更多个反应器中；以及将纯化的
mrna
转移到第三一个或更多个反应器中，以将纯化的
mrna
和一种或更多种递送媒介物组合以形成
mrna
治疗剂，其中第一微流控路径装置和多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
130.例如，本文还描述了实施体外转录
(ivt)
反应的方法，该方法包括遵循编码在非暂
时性计算机可读介质中的操作顺序，其中这些操作包括：将模板材料
、
聚合酶和核苷酸从多于一个储存贮库气动递送到第一微流控路径装置的第一一个或更多个反应器中；在第一一个或更多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性
mrna
；并且通过第一微流控路径装置将治疗性
mrna
转移出第一一个或更多个反应器到包含纤维素并适于纯化
mrna
的第二一个或更多个反应器中；以及将纯化的
mrna
转移到第三一个或更多个反应器中，以将纯化的
mrna
和一种或更多种递送媒介物组合以形成
mrna
治疗剂，其中第一微流控路径装置和多于一个储存贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露
。
131.本文还描述了使用系统制备治疗性
mrna
组合物的方法，该系统包括配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个个储存贮库，所述方法包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控路径装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以通过在一个或更多个微流控路径装置中将一种或更多种治疗性
mrna
与递送媒介物组合来配制治疗性
mrna
组合物
。
132.一种使用系统按需制备治疗性
mrna
组合物的方法，该系统包括配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定的多于一个储存贮库，该方法可以包括：在受保护而免于大气接触的封闭的流控路径中，在多于一个储存贮库中的一个或更多个储存贮库和一个或更多个微流控装置上的多于一个反应器之间输送试剂，以在一个或更多个微流控路径装置中实施一个或更多个以下操作：形成模板，从模板实施治疗性
mrna
的体外转录，纯化治疗性
mrna
，以及用递送媒介物配制
mrna。
133.这些方法和设备中的任一种可以在护理点操作
(
例如，制备治疗性
mrna)。
这些方法和设备中的任一种可以快速且连续地进行，例如，在少于约
72
小时内制备治疗剂
。
134.如提及的，在这些方法和设备中的任一种中，形成的多核苷酸
(
例如，通过
ivt)
可以在与递送媒介物组合之前和之后，在微流控路径装置内在微流体控制装置的自动控制下进行纯化
。
135.特别地，本文描述了方法和设备，其可以包括适于与可渗透插入材料一起使用的一个或更多个微流控路径装置，所述可渗透插入材料可以去除一种或更多种靶材料
(
例如，双链
rna
等
)
和
/
或可以将一种或更多种另外的材料
(
例如，冻干材料
)
添加到治疗性材料中，作为制备过程的一部分
。
可渗透插入材料可以配置为保持在微流控路径装置的一个或更多个流体接触室中，并且可以适配成使得正在形成的治疗性溶液通过可渗透插入材料
。
可渗透插入材料可以是可压缩的和
/
或可变形的和
/
或弹性的，从而它可以由室内的弹性膜操纵
。
可渗透插入物可以包括可渗透并含有为固体
、
粒状
、
凝胶等的修饰材料的覆盖物
(
例如，外覆盖物
)。
在一些实例中，可渗透插入材料是配置为从溶液中选择性去除
dsrna
的纤维素材料
。
136.可渗透材料可以是多孔的
(
例如，可以包括孔
)。
在一些实例中，可渗透材料可以是纤维状的或分层的
。
例如，可渗透材料可以是纤维状的，并且可以包括流体可以移动通过的通道
。
在一些实例中，通道可以通过可渗透材料形成以允许其对流体是可渗透的
。
例如，可渗透材料可以具有由激光或任何其他手段形成的通道，使得流体可以通过所述通道可进出内部体积
。
在一些实例中，可渗透材料可以由布置成允许流体在层之间或层中通过的多于一个层形成
。
仅有表面可进出的多于一个材料薄层可以堆叠在一起
。
例如，功能化的石墨烯
可以是分层的
(
例如，在极端情况下，是单个原子层
)。
作为另一个实例，可以对气凝胶薄片进行处理或以其他方式变得有吸收性并堆叠以形成插入物的可渗透材料
。
137.在本文描述的可渗透材料的任一种中，材料可以是预成型材料
(
例如，预成型插入物
)
，其被配置为允许流体的通过，在一些情况下以预定的流速和
/
或流动阻力通过
。
可以选择材料的渗透性，以便当以本文所述的处理流速和流体压力保持在装置室或通道内时，允许流过可渗透插入物
。
如以上提及的，预成型的可渗透材料可以是多孔的
、
纤维状的，可以是堆叠的层；这些材料中的任一种可以被功能化以结合材料
。
如本文所用，功能化材料可以包括通过添加特异性结合目标材料的化合物
、
剂或官能团而对材料表面进行修饰的任何材料
。
材料还可以或替代地通过表面处理来功能化，通过表面处理可以连接特定的原子分子基团以改变材料的特定特性
。
功能化可以通过各种表面修饰技术实施，诸如湿化学，或蒸汽
、
气体和
/
或等离子体化学，和
/
或微波辅助化学技术等，包括利用表面化学将所需材料结合到表面的技术
。
类似的技术可用于修饰材料，例如“激活”材料
。
138.可渗透材料可以配置为使设备内的插入物的总表面积最大化，从而允许选择性结合不需要的杂质和
/
或靶产物
。
这些可渗透材料中的任一种都可以配置为使溶液充分渗透到预成型材料的内部，以有效地结合溶液中的物质
。
在一些实例中，可渗透材料可以包含多于一种预成型材料，每种预成型材料可以大于微流控路径装置内的通道或室，并且这些预成型材料中的每一种仍然可以允许内部的溶液渗透，以使溶液对功能活性材料的暴露最大化
。
139.如以上提及的，本文所述的可渗透植入插入物可以配置为从溶液中去除杂质
(
例如，不需要的材料
)
；可选地或另外，可渗透植入物可以配置为可释放地结合所需材料，因此所需材料可以被洗脱
(
例如，在洗涤等之后
)。
140.如以上提及的，本文描述的方法和设备可以包括使用微流控路径装置，该装置包括一个或更多个可渗透插入物，该插入物配置为修饰形成治疗剂的溶液
。
可渗透插入物可以适于在本文所述的微流控路径装置内使用
。
141.例如，本文描述了可渗透插入物，其被配置成装配在室的流体接触侧内
。
因此，可渗透插入物的尺寸和
/
或形状可以与室的流体接触侧的全部或一部分
(
例如，横截面区域
)
内的体积基本一致
。
如以上提及的，可渗透材料可以是单个预成型插入物，或者它可以是多种预成型材料的组合，从而形成可渗透植入物
。
可渗透植入物通常可以允许溶液流入并穿过材料
。
在一些实例中，可渗透植入物也可以是可压缩的
(
例如，“可挤压的”)
以允许在微流控路径装置压缩插入可渗透植入物的室时从可渗透植入物内去除流体
。
在一些实例中，可渗透植入物有足够的弹性以在被压缩后恢复扩展的形状
。
142.可渗透插入物和微流控路径装置可以配置为使得流体，特别是用于生成治疗性组合物的材料，在处理期间必须通过可渗透插入物
。
在一些实例中，可渗透插入物是可压缩材料和
/
或可弹性变形材料
(
例如，弹性的
)
，其当通过偏转将室的流体接触侧与室的压力接收侧分开的弹性材料
(
例如，弹性层
)
来改变流体接触室的体积时可以变形
。
在一些实例中，可渗透插入物是可压缩的，但不一定是可弹性变形的
。
在一些实例中，可渗透插入物是可溶胀材料，其当被激活时
(
例如，通过添加流体，诸如缓冲液
、
水等
)
可以在室的流体接触侧内溶胀
。
可渗透插入物可以通过偏转在室的压力接收侧和室的流体接触侧之间的弹性材料
(
层
)
来压缩
。
在一些实例中，处理治疗剂可以包括在包括可渗透插入材料的多于一个
(
例如，
2、
3、4
等
)
室之间传输用于配制治疗性材料的溶液
。
在一些实例中，该方法可以包括将溶液驱入和驱出包括可渗透插入材料的室
。
143.在本文所述的方法和设备中的任一种中，可以压缩治疗性插入材料以将包括治疗性材料
(
或其中正在形成治疗性材料
)
的溶液驱出室的流体接触侧，例如通过调节室压力接收侧的压力以使将室分为流体接触侧和压力接收侧的弹性膜偏转
。
144.可渗透插入物可以是可用于修饰和进一步处理和
/
或修饰治疗性材料的任何适当材料
。
例如，在一些实例中，可渗透插入物可以包括配置为保留
dsrna
的纤维素材料，以便在溶液通过可渗透材料时从溶液中去除
dsrna。
可选地或另外，可渗透插入物可以包括一种或更多种材料，这些材料可以从可渗透插入物添加到溶液中
。
145.例如，本文所述的任何可渗透插入物可以包括一种或更多种吸附在可渗透插入物中或上的另外的材料
。
在这些实例的任一种中，可渗透插入物可以包括用于释放的材料
。
在一些实例中，例如，可渗透插入物可以包括纤维素插入物，该纤维素插入物可以用
dna
酶预处理以将
dna
酶捕获在纤维素中
。
这可以允许插入物同时去除
dsrna(
如本文所述
)
并消化
dna
材料，诸如来自体外转录操作的
dna
模板
。
146.本文所述的可渗透插入物的任一种可配置为表面功能化插入物，其包括附接
、
吸附或以其他方式包含在可渗透插入物上或中的一种或更多种另外的试剂
。
例如，在一些实例中，这样包含在可渗透插入物中或上的另外的材料可以包括共价拴系的材料
(
例如，抗体或适体
)、
静电拴系的材料
、
吸附的酶
(
例如，在一些实例中，其可以选择性地降解杂质，诸如如以上提及的
dna
酶
)、
共价或非共价连接的传感器
(
例如，检测待去除的材料，诸如双链
rna、
杂质等
)。
在一些实例中，另外的一种或更多种材料可以包括多
(dt)
序列以捕获多腺苷酸化的
rna
分子，例如，结合到可渗透植入物的表面
/
结合到可渗透植入物中
(
例如，可以在可渗透的植入物内使用多
(dt)
序列来分离
mrna)。
在一些实例中，一种或更多种另外的材料可以包括小分子以增强结合特性
(
例如，
dsrna
嵌入剂诸如溴化乙锭可以选择性地结合
dsrna
材料而不结合
ssrna)。
在一些实例中，可渗透插入物可以至少部分地用材料包覆
。
例如，在一些实例中，涂层可以是羧酸酯
/
盐涂层
(carboxylate coating)。
147.在一些实例中，可渗透插入物可以包括可以立即或以定时释放方式释放到溶液中的冻干材料
。
例如，在一些实例中，当溶液接触可渗透插入物时，溶液可以将冻干材料溶解到溶液中
。
冻干材料的实例可以包括一种或更多种缓冲材料
(
例如，盐
、
鳌合剂
、
去污剂
、
多核苷酸
、
酶
、
蛋白质等
)。
在一些实例中，可渗透插入物可以包括剂，诸如粘合剂，用于结合溶液中的一种或更多种材料
。
例如，可渗透插入物可以包括结合的免疫剂，例如抗体，或其部分，包括
fab
片段等，其可以选择性地从溶液中去除材料
。
148.通常，可渗透插入物可以配置为跨越室的流体接触侧，使得流体经过和
/
或通过可渗透插入物
。
可渗透插入物可以是纸
(paper)
，例如材料片
。
可渗透插入物可以折叠以跨越和
/
或至少部分地填充室的流体接触侧
。
因此，折叠形状可以跨越室的流体接触部分，同时被配置为用于偏转
(
包括弹性偏转
)。
折叠可以包括简单的折叠
(
例如，扇形折叠
)
或更复杂的折叠；通常，折叠可以包括一个或更多个弯曲区域，这些区域可以作为铰接
(
例如，活动铰接
)
区域操作和
/
或在被弹性膜的移动压缩或以其他方式偏转之后可以倾向于返回展开的形状，所述弹性膜将室分为流体接触室和压力接收室
。
在一些实例中，可渗透插入物可以形成海绵
。
可渗透插入物可以形成为泡沫或膨化材料
。
149.在本文所述的可渗透插入物的实例的任一种中，可渗透插入物内的通道
(
例如，孔
、
通道
、
室等
)
的尺寸可以配置为基于尺寸通过或排除材料
。
因此，本文所述的可渗透插入物可以配置为实施尺寸排阻
(
例如，尺寸排阻色谱法
)。
例如，具有未反应单核苷酸的大
mrna
分子可以被传递到含有纳米孔插入物的室中，未反应的
dntp
可以扩散到插入物中并被物理捕获在其中，而通道
(
例如，孔
)
的尺寸可以排除大分子
。
150.例如，在可渗透插入物包括纤维素
(
例如，用于去除
dsrna)
的实例中，纤维素可以是纸
(
例如，滤纸
)
的形式，纸可以被折叠或分层，包括配置为保持在室的流体接触部分内
。
在一些实例中，纤维素可以是膨化的或泡沫的
。
在一些实例中，纤维素可以是海绵的形式
。
151.可渗透插入物通常可以具有任何合适尺寸的孔
。
孔径可以是均匀的或不均匀的；在一些实例中，孔径可以分布在一定尺寸范围内
。
152.在本文所述的方法和设备中的任一种中，如本文所述，可以控制微流控路径装置的温度
。
特别地，可以控制含有可渗透插入物的室的温度
。
例如，当包括治疗性材料的溶液
(
或在其中正在形成治疗性材料的溶液
)
接触可渗透插入物时，微流控路径装置中含有可渗透插入物的室可以保持在目标温度
。
温度可以保持在例如约2摄氏度和约
20
摄氏度之间
、
约
2℃
和约
5℃
之间
、
约
2℃
和约
10℃
之间
、
约
2℃
和约
15℃
之间
、
约
5℃
和约
10℃
之间
、
约
5℃
和约
15℃
之间
、
约
5℃
和约
20℃
之间
、
约
10℃
和约
15℃
之间
、
约
10℃
和约
20℃
之间
、
约
10℃
和约
30℃
之间
、
约
10℃
和约
25℃
之间
、
约
15℃
和约
20℃
之间
、
约
15℃
和约
25℃
之间
、
约
15℃
和约
30℃
之间
、
约
20℃
和约
25℃
之间
、
约
20℃
和约
30℃
之间
、
约
25℃
和约
30℃
之间
、
约
25℃
和约
40℃
之间
、
约
25℃
和约
35℃
之间
、
约
30℃
和约
35℃
之间
、
约
30℃
和约
40℃
之间
、
约
35℃
和约
40℃
之间
、
约
30℃
和约
50℃
之间
、
约
30℃
和约
45℃
之间
、
约
35℃
和约
40℃
之间
、
约
35℃
和约
45℃
之间
、
约
35℃
和约
50℃
之间
、
约
40℃
和约
45℃
之间
、
约
40℃
和约
50℃
之间
、
约
45℃
和约
50℃
之间
、
约
40℃
和约
60℃
之间
、
约
40℃
和约
55℃
之间
、
约
45℃
和约
55℃
之间
、
约
45℃
和约
60℃
之间
、
约
50℃
和约
55℃
之间
、
约
50℃
和约
60℃
之间
、
约
55℃
和约
60℃
之间
、
约
50℃
和约
70℃
之间
、
约
50℃
和约
65℃
之间
、
约
55℃
和约
65℃
之间
、
约
55℃
和约
70℃
之间
、
约
60℃
和约
70℃
之间
、
约
60℃
和约
75℃
之间
、
约
65℃
和约
70℃
之间
、
约
65℃
和约
75℃
之间
、
约
65℃
和约
80℃
之间
、
约
70℃
和约
80℃
之间
、
约
75℃
和约
80℃
之间
、
约
60℃
和约
80℃
之间
、
约
65℃
和约
75℃
之间
、
约
65℃
和约
80℃
之间
、
约
75℃
和约
80℃
之间
、
约
70℃
和约
90℃
之间
、
约
75℃
和约
90℃
之间
、
约
80℃
和约
90℃
之间
、
约
85℃
和约
85℃
之间
、
约
85℃
和约
90℃
之间等
。
温度可以是恒定的，或者温度可以在暴露于可渗透插入物之前
、
期间和
/
或之后改变
(
例如，增加
、
降低等
)。
153.在一些实例中，可渗透插入物可以称为固体可渗透插入物；可渗透的
(
例如，固体可渗透的
)
插入物可以配置成使其保持完全包含在室的流体接触侧内
。
在一些实例中，如以上提及的，在一些实例中，可渗透插入物可以配置为由容纳的外部包封的可渗透包装，例如，可渗透覆盖物，该可渗透覆盖物包封材料并将材料限制在可渗透覆盖物内
。
例如，可渗透覆盖物可以包封粒状材料或凝胶
(
例如，水凝胶
)
等
。
可渗透覆盖物可由诸如膜材料的材料形成，该材料具有足够的渗透性以允许流体通过覆盖物并进入由覆盖物所包含的体积中
。
因此，可渗透插入物可以形成能够可压缩和
/
或可弹性变形的枕状形状
。
154.通常，可渗透插入物可以插入微流控路径装置的流体接触室中，并且可以配置为装配在如以上提及的流体接触室中
。
在一些实例中，可渗透插入物配置为紧贴装配在室的
流体接触侧中；例如，可渗透插入物可以具有与室的流体接触侧的形状互补的形状
(
例如，椭圆形
、
圆形
、
方形
、
圆角方形等
)。
如提及的，可渗透插入物可以配置为跨越和
/
或填充体积，并且特别地，在垂直于流过流体接触侧的体积的流动方向的方向上跨越体积，使得流体通过可渗透插入物
。
155.例如，本文描述了微流控路径装置，其可以包括：用于在微流控路径装置内诱导溶液的流体流动的工具
(means)
；多于一个室；以及在多于一个室的第一室内的可渗透插入物，其中该插入物配置为被压缩
。
用于诱导溶液的流体流动的工具可以包括任何合适的工具，特别是微流控路径装置上的多于一个压力端口，其配置为接收正压或负压以偏转微流控路径装置内的膜
。
例如，本文描述了微流控路径装置，其包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；和形成在第一板和第二板之间的多于一个室，其中弹性材料的一部分将每个室分为流体接触侧和压力接收侧
。
这些微流控路径装置中的任一个都可以包括在第一室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物
。
156.例如，本文描述了微流控路径装置，其包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；形成在第一板和第二板之间的多于一个室，其中弹性材料的一部分将每个室分为流体接触侧和压力接收侧；以及在多于一个室中的第一室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物，其中插入物配置为当向第一室的压力接收侧施加压力时通过弹性材料的偏转而压缩
。
157.在一些实例中，微流控路径装置包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；形成在第一板和第二板之间的多于一个室，其中弹性材料的一部分将每个室分为流体接触侧和压力接收侧；以及在多于一个室中的第一室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物，其中插入物包含配置为纯化
rna
的纤维素材料，其中分开第一室的弹性材料配置为通过向压力接收侧施加压力而偏转，以将流体移入或移出第一室
。
158.微流控路径装置可以包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；形成在第一板和第二板之间的多于一个室，其中弹性材料的一部分将每个室分为流体接触侧和压力接收侧；多于一个流体端口，其配置为与多于一个室的流体接触侧流体连通；多于一个压力端口，其与多于一个室的压力接收侧流体连通；以及在多于一个室中的第一室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物，其中该插入物配置为当从一个或更多个压力端口向第一室的压力接收侧施加压力时通过弹性材料的偏转而压缩
。
159.在一些实例中，并且特别地，在可渗透插入物配置为从溶液中去除不需要的材料
(
例如
dsrna)
的实例中，诸如包括纤维素的实例，室可以称为分离室
。
160.如提及的，在这些设备
(
例如，系统
、
装置等
)
的任一种中，固体且可渗透的插入物可以包含配置为纯化
rna
的纤维素材料
。
例如，固体且可渗透的插入物可以包含纤维素材料片
。
可选地或此外，固体且可渗透的插入物可以包含冻干材料
。
161.固体且可渗透的插入物可以具有与第一室的轮廓相匹配的轮廓
。
如提及的，固体且可渗透的插入物可以是弹性的
。
162.固体且可渗透的插入物可以包括含有颗粒材料的可渗透外部覆盖物
。
在一些实例中，固体且可渗透的插入物包括折叠结构
。
163.在一些实例中，微流控路径装置可以包含与第一室流体连接的第二室
。
该装置可以配置为通过偏转材料而在第一室和第二室之间转移流体
。
在一些实例中，流体可以在第
一室和第二室之间往复移动
。
164.微流控路径装置可以包括多于一个可独立寻址的压力端口，所述压力端口延伸穿过第一板并且配置成递送压力到多于一个室的压力接收侧以移动流体接收侧中的流体
。
165.本文还描述了使用本文描述的任一种设备的方法
。
例如，处理流体中的治疗性材料
(
例如，
rna
样品
)
的方法可以包括：将微流控路径装置偶联到压力源；施加压力以将样品输送到微流控路径装置的分离室的流体接触侧；使样品通入分离室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物中，其中样品被固体且可渗透的插入物修饰；并且施加压力以将样品输送出分离室的流体接触侧
。
166.例如，从含有双链
rna (dsrna)
和单链
rna(ssrna)
两者的
rna
样品中去除
dsrna
的方法可以包括：将微流控路径装置偶联到压力源；施加压力以将
rna
样品输送到微流控路径装置的分离室的流体接触侧；使
rna
样品通入分离室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物中，其中固体和可渗透的插入物包含纤维素，使得
dsrna
被插入物保留；并施加压力以将
rna
样品输送出分离室的流体接触侧
。
167.从含有双链
rna(dsrna)
和单链
rna(ssrna)
两者的
rna
样品中去除
dsrna
的方法可以包括：将微流控路径装置偶联到压力源；施加压力以将
rna
样品输送到微流控路径装置的分离室的流体接触侧，使得
rna
样品通过分离室的流体接触侧内的包含纤维素的固体且可渗透的插入物，使得
dsrna
被插入物保留；并向分离室的压力接收侧施加压力以将
rna
样品输送出分离室的流体接触侧
。
168.该方法可以包括在微流控路径装置中通过体外转录来合成
rna
样品
。
在一些实例中，该方法可以包括将微流控路径装置偶联到
rna
样品的来源
。
169.施加压力以将
rna
样品输送出流体接触侧可以包括向分离室的压力接收侧施加压力以偏转弹性材料，该弹性材料将分离室的压力接收侧与分离室的流体接触侧分开
。
向分离室的压力接收侧施加压力可以包括将
rna
样品输送出分离室的流体接触侧并且进入混合室的流体接触侧，还包括向混合室的压力接收侧施加压力以将
rna
样品输送回分离室的流体接触侧中
。
施加压力以将
rna
样品输送出分离室的流体接触侧可以包括通过弹性材料压缩固体且可渗透的插入物，该弹性材料将分离室的压力接收侧与分离室的流体接触侧分开
。
170.本文还描述了微流控路径装置
(
例如，用于制备包含合成
dna
模板的产物的微流控路径装置
)
，其包括：夹在具有第一表面的第一板区域和具有第二表面的第二板区域之间的弹性层；由一个或更多个通道连接的多于一个
pcr
室，每个
pcr
室具有固定体积，其中每个
pcr
室形成在第一表面和第二表面之间，其中弹性层的一部分将每个室分成第二表面中的流体接触侧和第一表面中的压力接收侧，其中压力接收侧进一步由一个或更多个流体连接的蛇形路径分隔；多于一个流体通道，每个流体通道从流体端口延伸穿过第一板区域并进入第二板区域，以与多于一个室中的一个或更多个室的流体接触侧流体连接；多于一个压力通道，每个压力通道从一个或更多个压力端口延伸，穿过第一板区域和弹性层，进入第二板区域，并返回穿过弹性层，并进入第一板区域，其中多于一个压力通道中的每个压力通道在第一板区域内延伸，并与多于一个室中的一个或更多个室的一个或更多个压力接收侧流体连接；以及与一个或更多个
pcr
室流体连通的
uv
产率检测室，其中所述
uv
产率检测室包括
uv
产率检测窗，所述
uv
产率检测窗被配置为使
uv
光从其穿过，用于对所述
uv
产率检测室内
的多核苷酸进行定量
。
171.在本文描述的任何微流控路径装置中，每个
pcr
室的流体接触侧可以具有
1.5cm
或更小的厚度
(
例如，
1.4cm
或更小
、1.3cm
或更小
、1.2cm
或更小
、1.1cm
或更小
、1.0cm
或更小
、0.9cm
或更小
、0.8cm
或更小
、0.7cm
或更小
、0.6cm
或更小
、0.5cm
或更小等
)。
172.这些微流控路径装置中的任一个可以包括与纯化基质流体连通的纯化室
。
所述微流控路径装置可以被配置为可移除的盒
(cartridge)
，所述可移除的盒被配置为与流体贮库和气动驱动器接合
。
173.本文描述的任何微流控路径装置可以包括真空帽
(vacuum cap)
，其中真空帽包括形成在第一表面和第二表面之间的气泡去除室，其中透气弹性层将气泡去除室分成第二表面中的气泡去除室的流体接触侧和第一表面中的真空接收侧，另外，其中气泡去除室的流体接触侧与至少一个
pcr
室的流体接触侧流体连通
。
174.第二表面中的流体接触侧和压力接收侧可以是凹形的，并且架构配置成使得当压力接收侧的正压驱动弹性层抵靠流体接触侧时，弹性层与第二表面中的流体接触侧齐平且没有间隙地安置
。
所述一个或更多个压力端口和流体端口可以布置在所述第一板的上表面上，邻近所述微流控路径装置的外围
。
175.微流控路径装置还可以包括插入到通道的流体接触侧中的材料
。
所述材料可以包括配置成选择性吸收双链
mrna
的纤维素材料
。
176.第一板和第二板可以由刚性材料形成，其中刚性材料是聚合物或玻璃
。
聚合物可以是环烯烃共聚物
。
177.这些方法中的任一种可以包括预润湿固体且可渗透的插入物
。
178.本文中设想了本文描述的所有方法和设备
(
以任何组合
)
，并且可以用于实现本文描述的益处
。
179.附图简述
180.通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述以及附图，将获得对本文描述的方法和设备的特征和优点的更好理解，在附图中：
181.图
1a
示意性显示了制备
mrna
治疗剂的方法的一个实例
。
182.图
1b
示意性显示了用于制备患者特异性
t
细胞淋巴瘤疫苗药物产物的示例性过程的一个实例
。
183.图
2a
显示了如本文所述的微流控路径装置控制系统的一个实例
。
184.图
2b
示意性显示了可以如本文所述使用的微流控路径装置控制系统的一个实例
。
185.图
3a-图
3c
显示了如本文所述的微流控路径装置的实例
。
186.图4是穿过如本文所述的微流控路径装置的一个实例的一部分的截面
。
187.图5是可用于如本文所述的方法中的任一种中的类肽递送媒介物的一个实例
。
188.图
6a
显示了可用于制备双链
dna
模板的体外转录促进子盒的实例
。
189.图
6b
显示了如本文所述生成的双链
dna
模板的实例
。
190.图7示出了一种通过如本文所述的
pcr
制备用于体外转录的合成
dna
模板的方法
。
191.图8显示可用于制备用于疫苗或治疗剂的双链
dna
的
t
细胞受体的实例的一个区域
。
192.图9显示了用于生成双链
dna
的微流控路径装置反应器的架构的一个实例的概览
。
193.图
10
示意性显示了可用于本文所述的方法和装置中任一种中的密码子优化过程的一个实例
。
194.图
11
示意性显示了配置为实施本文所述的
ivt
的微流控路径装置的功能图的一个实例
。
195.图
12
示意性显示了配置为如本文所述的配制微流控路径装置的微流控路径装置的功能图的一个实例
。
196.图
13
示意性显示了配置为如本文所述的配制微流控路径装置的微流控路径装置的功能图的另一个实例
。
197.图
14
示意性显示了如本文所述的配制微流控路径装置的功能图的另一个实例
。
198.图
15
描述了使用如本文所述的
mrna
治疗剂的示例性模型检查体内
mrna
表达和生物分布的实验的一个实例
。
199.图
16a-图
16d
是显示如本文所述的示例性治疗性
mrna
疫苗的治疗功效的图
。
200.图
17a
显示了注射如本文所述制备的储存的模型
mrna
治疗剂后的全身萤光素酶表达
。
201.图
17b
显示了来自图
17a
的模型
mrna
治疗剂的表达的定量实例
。
202.图
18
示意性显示了可以在本文所述的方法和装置中应用过滤的不同时间
。
203.图
19a
是在室的流体接触侧内包括可渗透插入物的微流控路径装置的实例的俯视图
。
204.图
19b
是穿过微流控路径装置的实例的一个区域的截面的实例，该微流控路径装置包括在室的一侧中的可渗透插入物
。
205.图
19c
显示了微流控路径装置的一部分的一个实例，其示意性地显示了用于去除气泡的真空帽
。
206.图
19d
是微流控路径装置
(“芯片”)
的实例的顶视图，该微流控路径装置
(“芯片”)
特别适于合成本文所述治疗性材料的模板
。
207.图
20a
示意性地显示了制备包含适于体外转录的合成
dna
模板的合成产物的一种方法，包括使用包括如本文所述的可渗透插入物的微流控路径装置处理流体中的治疗性材料
(
例如，
rna
样品
)。
208.图
20b
示意性地显示了制备包含适于体外转录的合成
dna
模板的合成产物的一种方法，包括使用包括如本文所述的可渗透插入物的微流控路径装置从治疗性材料中去除
dsrna。
209.图
20c
示意性地说明了使用本文所述的微流控路径装置
(
例如“芯片”)
制备合成产物的方法，所述合成产物包含适于体外转录的合成
dna
模板
。
210.图
21a
显示了系统的一个实例，该系统包括在7级空间
(class 7space)
内的5级隔离柜
(class5isolation cabinet)
中的微流控设备
。
该系统可以配置为微型工厂
。
211.图
21b
阐述了5级柜内的微流控设备
。
212.图
22a
是琼脂糖凝胶电泳的图像，显示使用本文所述的基于
pcr
的技术成功生成用于体外转录的合成
dna
模板
。
在该实例中，
dna
模板是萤光素酶报告基因的合成模板，包括
t7
启动子和
200bp
多a尾
。
213.图
22b
是与图
22a
相同的基于
pcr
的模板的毛细管电泳的实例
。
214.图
23a-图
23c
显示了与细菌生成的
mrna
模板相比，使用本文所述的基于
pcr
的技术合成产生的
mrna
模板的质量
。
图
23a
显示了使用细菌模板生成的
mrna
的毛细管电泳
。
图
23b
是使用如本文所述的合成模板生成的
mrna
的毛细管电泳
。
图
23c
显示了转染图
23a
和图
23b
中所示的
mrna
后6小时小鼠树突状细胞系
(jawsii)
中萤光素酶生物活性的比较，合成生成的模板显示出更大的生物活性
。
215.详述
216.本文描述了用于制备治疗剂的方法和设备，其可以包括使用全自动
、
软件控制的微流控装置
。
特别地，本文描述了用于或包括制备用于体外转录的合成
dna
模板的自动化方法和设备
。
这些方法和设备可以包括使用基于聚合酶链式反应
(pcr)
的方法
。
217.这些方法和设备可用于个性化或个体化治疗
。
本文还描述了设备
(
例如，系统
、
装置等
)
和方法，其包括对本文描述的任何制备操作的软件控制，这些制备操作包括形成模板
、
体外转录
、
治疗性
mrna
的纯化
、mrna
的浓缩
、
以及将
mrna
与一种或更多种递送媒介物复合
。
软件控制可以允许这些方法自动化，从而可以准确和精确地快速实施制备一种或更多种治疗性
mrna
的任何
、
一些或所有这些操作
。
软件控制以及微流控精确递送和转移反应组分提供了提高过程控制
、
效率和可重复性的机会，而大大减少或消除了手动操作，减少了设施需求并缩短了生产周期时间，如果需要，最终导致适时生产的成本更低的治疗
。
218.在本文所述的一些设备
(
例如，系统
、
装置等
)
中，每批治疗性材料可以在专用的
、
一次性的
、
可丢弃的微流控路径装置
(
在本文中也称为生物芯片
)
中生产，该微流控路径装置可以被容纳在微流控路径装置控制系统
(
本文也称为控制系统
)
内
。
整个生产过程可以按照设计无菌
、
封闭路径的过程进行，而不与大气接触
。
所有生产操作都可以自动化，由控制系统控制以实现复制精确的过程，而无论容纳系统的设施的特质如何
。
生产参数
、
原材料和环境数据
(
包括完整的可视记录
)
可以成为在云中保护并与每次生产运行相关联的广泛加密电子文件的一部分
。
此外，纯化操作以及许多
qc
测定可以在生产过程中以单一流体流动在线
(in-line)
实施，通过在半导体产业中开发的过程控制概念，允许在早期阶段检测到异常情况
。
通过驾驭全自动化
、
软件控制的方法来制备，可以以成本有效的方式制备个性化和个体化的
mrna
治疗剂，以造福于患者
。
219.这些方法和设备可以在人体外通过称为体外转录
(ivt)
的合成技术合成地产生
mrna
治疗剂
。
通常，裸
mrna
分子是大的多阴离子分子，其不会穿过细胞膜，并且其在体内被细胞外核酸酶快速降解
。
本文所述的方法和设备可以产生含有一种或更多种递送媒介物的
mrna
分子制剂，递送媒介物被设计为用于将
mrna
输送至靶
(
组织
、
身体
、
组织区域等
)。
例如，在一些实例中，递送媒介物可以是含有脂质的两亲性递送媒介物，其在循环期间提供对
mrna
货物的包装和保护，避免免疫识别，并且可以促进细胞摄取和释放
。
220.在一些实例中，所有或一些生产步骤，包括模板合成
、ivt、
纯化和用递送媒介物进行配制，可以在一个或更多个微流控装置的高度受控环境中实施，从而允许优化稳健
、
高质量和高度可重复的制备过程
。
221.定义
222.如本文所用，递送媒介物可以指任何合适的纳米颗粒
。
这样的纳米颗粒的实例可以包括但不限于两亲性纳米颗粒，诸如氨基脂化类肽
。
223.如本文所用，“扩增”可以指多核苷酸
(
例如，
dna)
扩增
。
例如，扩增可以完全在本文
描述的微流控路径板装置内进行
。
扩增可以包括但不限于多重置换扩增
(mda)、
聚合酶链式反应
(pcr)
扩增
、
环介导的等温扩增
、lamp、
基于核酸序列的扩增
、
链置换扩增
、
滚环扩增
、
连接酶链式反应等
。
224.如本文所用，自动化和半自动化可以指在很大程度上无需人工干预而实施的方法和过程，并且可以在一个或更多个计算机处理的控制下实施
。
自动化方法可以由人工输入来监督和
/
或引导
。
225.如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用并且指脱氧核糖核苷酸
(dna)、
核糖核苷酸
(rna)
及其功能类似物，诸如呈线性或环状构象的互补
dna(cdna)。
本文提供的核酸分子可以是单链或双链的
。
核酸分子包括核苷酸碱基腺嘌呤
(a)、
鸟嘌呤
(g)、
胸腺嘧啶
(t)、
胞嘧啶
(c)。
在
rna
分子中尿嘧啶
(u)
替代胸腺嘧啶
。
本文还提供了天然核苷酸碱基的类似物，以及在碱基
、
糖和
/
或磷酸盐部分中修饰的核苷酸碱基
。
符号“n”可用于表示任何核苷酸碱基
(
例如，
a、g、c、t
或
u)。
226.如本文所用，“盒
(cassette)”(
例如，合成体外转录促进子盒
)
是指多核苷酸序列，其可以包括或可操作地连接到一个或更多个表达元件，诸如增强子
、
启动子
、
前导
、
内含子
、5'
非翻译区
(utr)、3'utr
或转录终止序列
。
在一些实例中，盒至少包含能够启动可操作地连接的第二多核苷酸序列的转录的第一多核苷酸序列和任选地与第二多核苷酸序列可操作地连接的转录终止序列
。
盒可以作为单个元件或作为两个或更多个未连接的元件提供
。
227.如本文所用，“多核苷酸”是指含有多于一个核苷酸的核酸分子，并且通常既指“寡核苷酸”(
长度为约
18
和约
25
个核苷酸的多核苷酸分子
)
，也指约
26
个或更多个核苷酸的多核苷酸
。
本公开内容的方面包括包含以下的组合物：长度为约
18
和约
25
个核苷酸
(
例如，约
18-mer、
约
19-mer、
约
20-mer、
约
21-mer、
约
22-mer、
约
23-mer、
约
24-mer、
或约
25-mer)
的寡核苷酸，或长度为约
26
个或更多个核苷酸的中等长度多核苷酸
(
例如，
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、
约
65、
约
70、
约
75、
约
80、
约
85、
约
90、
约
95、
约
100、
约
110、
约
120、
约
130、
约
140、
约
150、
约
160、
约
170、
约
180、
约
190、
约
200、
约
210、
约
220、
约
230、
约
240、
约
250、
约
260、
约
270、
约
280、
约
290
或约
300
个核苷酸的多核苷酸
)
，或长度大于约
300
个核苷酸的长多核苷酸
(
例如，约
300
至约
400
个核苷酸之间
、
约
400
至约
500
个核苷酸之间
、
约
500
至约
600
个核苷酸之间
、
约
600
至约
700
个核苷酸之间
、
约
700
至约
800
个核苷酸之间
、
约
800
至约
900
个核苷酸之间
、
约
900
至约
1000
个核苷酸之间
、
约
300
至约
500
个核苷酸之间
、
约
300
至约
600
个核苷酸之间
、
约
300
至约
700
个核苷酸之间
、
约
300
至约
800
个核苷酸之间
、
约
300
至约
900
个核苷酸之间，或约
1000
个核苷酸长度，或甚至大于约
1000
个核苷酸长度的多核苷酸
)。
在多核苷酸是双链的情况下，其长度可以类似地用碱基对来描述
。
228.如本文所用，“体外转录
(in vitro transcription)”或“ivt”是指转录在体外在非细胞系统中发生以产生用于各种应用的合成
rna
分子
(
合成
mrna)
的过程，该应用包括用于治疗递送至受试者
。
生成的合成
rna
分子
(
转录产物
)
可以与递送媒介物组合
。
合成的转录产物包括
mrna、
反义
rna
分子
、shrna、
环状
rna
分子
、
核酶等
。ivt
反应可以使用纯化的包含启动子序列和感兴趣的开放阅读框序列的线性
dna
模板
、
三磷酸核糖核苷酸或修饰的三磷酸核糖核苷酸
、
包括
dtt
和镁离子的缓冲体系以及合适的噬菌体
rna
聚合酶
。
[0229]“模板”或“双链
dna
模板”是指分离的核酸序列，其包含插入的感兴趣的开放阅读
框的体外转录所需的最小组分序列
。
[0230]
如本文所用，“流体贮库
(fluid depot)”可以指用于容纳流体的储存空间，并且可以包括小瓶
、
瓶子
、
袋子
、
管等
。
流体贮库可以包括作为整体部分的流体管线
(fluid line)(
例如，离开流体贮库内的主体或室的过道或通道
)。
[0231]
如本文所用，流体动力包括气动和液压
。
为方便起见，术语气动可以包括液压，且这些术语可互换使用
。
[0232]
如本文所用，“治疗性多核苷酸”是指可以是用于递送至受试者以治疗
、
预防
、
改善或以其他方式改变受试者健康的治疗性多核苷酸组合物的一部分的多核苷酸
(
例如，治疗性
mrna)。
[0233]
如本文所用，“治疗性多核苷酸组合物”可以指包括由可施用至受试者的递送媒介物包封的一种或更多种多核苷酸
(
例如，
mrna)
的组合物
。mrna
疫苗只是治疗性多核苷酸组合物的一个实例
。
[0234]
如本文所用，“不含细菌
dna”是指不存在细菌
dna。
基本上不含细菌
dna
的材料可以包括细菌
dna
少于约
0.1
％
、
少于约
0.01
％
、
少于约
0.001
％等
。
如本文所用，“不含内毒素”是指不存在内毒素
。“基本上不含内毒素”的材料是指内毒素少于约
0.1
％
、
少于约
0.01
％
、
少于约
0.001
％等
。
[0235]
如本文所用，“连接”是指用于将一种组分与另一种组分偶联的方法，诸如连接
、
合成
、
引物延伸
、
退火
、
重组或杂交
。
[0236]
如本文所用，微流控路径装置或微流控路径板装置可以等同地称为芯片
、
盒
、
生物芯片
、
微流控路径板等，并且可以包括多于一个流体互连的室
。
这些室可分为流体接触侧和压力接收侧
。
压力接收侧可以是流体动力回路的一部分，而流体接触侧可以与外部大气隔离并且可以用于处理微流控路径装置中的材料
。
本文所述的微流控板路径装置通常可以是平坦的
(
例如，具有小于约
4cm、
小于约
2cm、
小于约
1.5cm、
小于约
l cm
等的厚度
)
并且可以包括用于与一个或更多条压力管线接口的多于一个压力端口，以驱动和
/
或控制微流控路径板装置中的流体动力回路
。
[0237]
如本文所用，“按需”旨在定义何时实施方法或服务，并且与预先储存
、
计划
、
订购或准备相反使用
。
[0238]
如本文所用，光学传感器通常是指光感测装置并且可以包括一个或更多个成像装置
。
光学传感器可以包括单镜头
、
相机
、
立体相机
、
多镜头相机
、
数码相机
、
热成像相机
、ccd、
光纤等
。
[0239]
如本文所用，“具有对感兴趣的合成基因特异的区域的引物
……”
是指具有与感兴趣的合成基因杂交或与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸杂交的区域的引物
(
诸如正向或反向引物
)。
具有对感兴趣的合成基因特异的区域的引物可以是用于通过
pcr
扩增的一对引物之一
。
[0240]
如本文所用，“纯化”是指组分
(
例如，颗粒
)
与其他不想要的组分
(
例如，污染物质
、
碎片等
)
的物理和
/
或化学分离
。
[0241]
如本文所用，“密封流体连通”和“密封和封闭的流控路径”两者都可以指材料
(
例如，含有材料的流体，诸如但不限于模板
、
治疗性多核苷酸和
/
或治疗性多核苷酸组合物的溶液
)
与周围大气隔离
。
[0242]
如本文所用，“感兴趣的合成基因”是指体外合成的感兴趣的基因
。
所述基因序列可以对应于患者基因序列，诸如来源于患者癌细胞的患者基因序列
。
可以使用一种或更多种合成技术合成感兴趣的合成基因
。
合成技术可以包括化学合成
(
例如，固相合成
)、
酶促
dna
合成等
。
[0243]
如本文所用，“模板前体材料”是指形成模板
(
例如，
dna
双链模板
)
所必需的材料，并且可以包括感兴趣的合成基因，以及作为一种或更多种独立元件提供的体外转录促进子盒
。
[0244]
如本文所用，
2d
纯化是指在本文所述的基本上平坦的微流控路径装置
(
例如，微流控路径板装置
)
内进行的纯化，并且包括使用一种或更多种
(
例如，两种或更多种
、
三种或更多种等
)
类型的吸收性材料来去除材料
(
例如，双链
rna、
未反应的核苷酸
、
未反应的加帽试剂
、
缓冲液组分等
)
等，包括基于尺寸选择为吸收性的材料
。
[0245]
诸如
mrna
治疗剂的疗法可用于多种治疗方式，包括疫苗接种
、
免疫疗法
、
蛋白质替换疗法
、
组织重塑
/
再生和通过基因编辑的遗传疾病治疗
。
除了高效力之外，
mrna
治疗剂还具有与其快速开发周期
、
标准化制备
、
瞬时表达和低基因组整合风险相关的重要优势
。
[0246]
在一些实例中，本文所述的
mrna
治疗剂可以包括作为最终药物产物中的活性成分的
mrna
，其编码感兴趣的抗原或蛋白质
。mrna
的稳健翻译需要功能性的5’
帽结构
。5’帽
(
或
7-甲基鸟苷帽
)
由末端
7-甲基鸟苷残基组成，该残基通过5’‑5’‑
三磷酸键连接到第一个转录的核苷酸
。
它的存在对于核糖体识别
mrna
和保护免于
rna
酶至关重要
。
多
(a)
尾通过结合多
(a)
结合蛋白
(pabp)
与
m7g
帽协同调节
mrna
稳定性和翻译起始，
pabp
与真核翻译起始因子
eif4g
相互作用，并继而与
eif4e
形成复合物
。
多
(a)
尾的长度可以影响
mrna
到蛋白质翻译过程的效率
。
[0247]
mrna
治疗剂可大致分为至少5类，用于：(i)蛋白质替代，
(ii)
疫苗，
(iii)
效应蛋白的表达，
(iv)
通过显性负效
(dominant negative)
蛋白的表达诱导功能丧失和
(v)
基因
/
基因组编辑
。
本文所述的方法和设备可以为这些类别中的任一种
(
或多于一种
)
提供
mrna
治疗剂
。
[0248]
本文所述的方法和设备可以配制
mrna
治疗剂以在循环期间提供对
mrna
货物的包装和保护，避免免疫识别，将药物产物定位在期望的组织中，并促进细胞摄取和释放，而避免可限制重复给药的毒性或免疫原性问题
。
[0249]
通常，制备
mrna
治疗剂
(
包括但不限于患者特异性
t
细胞淋巴瘤疫苗药物产物
)
的方法可以涉及图1中示意性表示的任何或所有操作，并且包括鉴定靶蛋白和设计
mrna
序列
101
，制备靶序列的双链
dna
模板
103。
该序列可用于生成用于体外转录
(ivt)
反应的
mrna 105
，以合成
mrna。
然后可以纯化该治疗性
mrna
以去除工艺杂质并过滤以生成药物物质
107。
然后可以用递送媒介物配制治疗性
mrna 109(
包括在一些实例中用佐剂和递送媒介物组分配制以形成两亲性纳米颗粒
)。
然后可以对制剂进行处理和纯化以生成可用于递送给患者的药物产物
111。
如上所述，在一些实例中，这些操作中的一些可以远程实施
(
例如，
101-107)
，一些本地实施
(
例如，
109、111)
；在一些实例中，它们可以全部
(
例如，
103、105、107、109、111)
在本地实施
。
[0250]
作为一个实例的具体实例，图
1b
显示了用于制备患者特异性
t
细胞淋巴瘤疫苗药物产物的示例性过程
。
在图
1b
中，该过程可以包括鉴定克隆扩增的由淋巴瘤细胞表达的
tcr
序列
(
独特型
)121。
该过程还可以包括设计
mrna
疫苗序列
123
，以及制备用于
ivt
反应的双链
dna
模板
125。
该模板可用于
ivt
反应以合成
mrna 127
，并且该治疗性
mrna
可以被纯化以去除工艺杂质并过滤以将治疗性
mrna
制备为药物物质
129。
然后可以将治疗性
mrna
与佐剂和递送媒介物组分一起配制以形成两亲性纳米颗粒
131。
然后可以实施配制后处理
133
以生成药物产物，诸如治疗性
mrna
疫苗
135。
[0251]
可以优化这些制备操作中的任一个以使用如本文所述的自动化微流控路径装置控制系统来实施
。
例如，
dna
模板的产生可以在一个或更多个微流控路径装置中进行；在图
1b
所示的实例中，可以使用模板微流控路径装置
(
例如，模板生物芯片
)。
在该相同实例中，
mrna
的体外转录和该材料的纯化以生成药物物质的操作可以在
ivt
微流控路径装置
(
例如，
ivt
生物芯片
)
上实施，并且药物产物配制操作可以是在配制微流控路径装置
(
例如，配制生物芯片
)
上完成
。
这些微流控路径装置可以含有在制备过程中实施每个操作所需的输入端口
、
计量阀
、
反应室和纯化结构
。
[0252]
设备
[0253]
本文所述的方法通常可以使用可以与一个或更多个微流控路径装置
(
例如，生物芯片
)
一起使用的设备和
/
或可以包括一个或更多个微流控路径装置
(
例如，生物芯片
)
的设备和配置为控制微流控路径装置中操作的系统
(
例如，微流体控制系统
)
来实施
。
这些设备在本文中可以称为微流控设备
、
微流体控制设备
、
微流控路径装置控制系统
、
微流体控制系统或微流控系统
。
微流控路径装置
(
也称为微流控路径板装置
)
可以放置在微流体控制系统内，并且可以以封闭路径方式操作，所述方式防止系统内一些或更优选地几乎所有或所有的制备组分的组分部分暴露于大气
。
特别地，防止与系统内的流体接触的设备的部分暴露于大气
。
图
2a
显示了微流控路径装置控制系统的一个实例，其包括：微流控路径装置管理系统
203(
包括用于以下的硬件：容纳微流控路径装置
、
施加正
/
负压以在微流控路径装置中操作微流控操作
、
加热
/
冷却整个微流控路径装置或微流控路径装置的区域，检测来自微流控路径装置的一个或更多个特征和
/
或记录在一个或更多个微流控路径装置上实施的操作
)、
控制器
(
未示出
)
和冷冻容器
205(
例如，
iso 5
级柜
)。
该系统可以使用或可以包括一个或更多个微流控路径装置
201。
[0254]
微流控设备可以是用于形成治疗性多核苷酸
(
例如，
mrna
治疗剂
)
的微流控设备
。
该设备可以包括：用于可移除地容纳微流控路径板装置的座架
(seating mount)、
多于一条压力管线；多于一个流体小瓶，其中每个流体小瓶包括流体管线或配置为与流体管线偶联，其中每条流体管线和压力管线的至少一个子集配置为相对于保持在座架中的微流控路径板装置偏置以形成封闭的流控路径；和控制器，配置为控制通过压力管线施加压力，以便当微流控路径板装置保持在座架中时驱动微流控路径板装置中的流体移动，其中控制器被配置为指导合成模板的合成，指导使用模板的体外转录
(ivt)
反应以形成治疗性多核苷酸，并指导在一个或更多个保持在座架中的微流控路径板装置中纯化治疗性多核苷酸
。
[0255]
微流控设备
(
例如，用于形成治疗性多核苷酸，诸如治疗性
mrna
的微流控设备
)
可以包括：用于可移除地容纳微流控路径板装置的座架；多于一条压力管线；多于一个流体小瓶，其中每个流体小瓶包括流体管线或配置为与流体管线偶联，其中每条流体管线和压力管线的至少一个子集配置为相对于保持在座架中的微流控路径板装置偏置以形成封闭的流控路径；以及控制器，其配置为控制通过压力管线施加压力，以便当微流控路径板装置保
持在座架中时驱动微流控路径板装置中的流体移动，其中控制器配置为确定流体小瓶的内容物，将亚微升量的材料从流体小瓶转移到保持在座架中的微流控路径板装置中的一个或更多个反应器，指导合成模板的合成，指导使用模板的体外转录
(ivt)
反应以形成治疗性多核苷酸，并指导在一个或更多个保持在座架中的微流控路径装置中纯化治疗性多核苷酸
。
[0256]
控制器可以配置为实施本文所述的方法中的任一种，并且特别地可以配置为接收输入
(
例如，光学输入
、
压力输入
、
温度
/
热输入等
)
并处理输入以控制流体在微流控路径装置中的移动
、
微流控路径装置的各个区域的温度
(
包括热循环
)、
冲洗
/
组合
、
微流控装置的阀的打开
/
关闭
、
微流控装置的检测等
。
控制器可以包括一个或更多个微处理器
、
通信回路
、
存储器等
。
控制器可以包含固件
、
硬件和
/
或软件
。
[0257]
这些设备中的任一个可以包括一个或更多个
(
例如，多于一个
)
布置在座架和试剂储存框周围的光学传感器，以便当微流控路径装置位于座架中时监测试剂储存框内的流体水平和微流控路径装置中的流体移动
。
可选地或此外，光学传感器可以存在于设备的底部
(
例如，在座架下方
)
并且可以朝向上方以检测流体量
、
移动等
)。
[0258]
所描述的方法和设备通常包括一个或更多个流体动力回路以在流体室
(
贮库
、
流体接触侧
、
反应器等
)
和微流控路径装置的通道之间或在微流控路径装置内，并且在一些情况下，在微流控路径装置和设备内的流体贮库
(
小瓶
、
瓶子
、
容器等
)
之间移动材料
(
液体材料
)。
流体动力回路可以是液压或气动回路，其可以包括微流控装置，以及特别地一个或更多个压力通道和微流控装置中的室的压力接收侧
。
流体动力回路也可以称为微流控动力回路
。
单个微流控芯片可以包括多于一个流体动力回路；流体动力回路还可以包括一个或更多条压力管线以及微流体控制装置的压力管线与微流控路径装置内的一个或更多个微流控芯片之间的接口
。
一个或更多个流体动力回路可以与其他重叠的流体动力回路共享组件
(
阀
、
压力管线
、
真空帽等
)。
此外，为了同样的方便，应当理解，在使用术语“气动”的情况下，可以替代或另外地使用通用流体动力回路
(
例如，液压和
/
或气动
)。
由流体动力管线驱动的流体材料可以是任何合适的流体
(
例如，气体或液体，诸如空气
、
水
、
油等
)。
[0259]
本文还描述了用于在封闭路径中处理治疗性多核苷酸的微流控路径装置
(
例如，封闭路径微流控路径装置
)。
如提及的，这些微流控路径装置在本文中可以被称为微流控芯片
、
微流控路径板
、
处理芯片
、
生物芯片
、
处理板等
。
通常，微流控路径装置可以是微流控路径板装置，其可以是基本上平坦的板样结构；这些结构可以相对薄
(
例如，小于几
mm
厚，例如约
0.5mm
和约
20mm
之间厚
、
约
0.5mm
和约
15mm
之间厚
、
约
0.5mm
和约
10mm
之间厚等
)。
本文所述的微流控路径装置通常可以是至少部分透明的，并且特别地，可以在微流控路径装置的顶部上是透明的，从而一个或更多个光学传感器
(
相机
、ccd、
光纤等
)
可以用于感测
、
检测
、
监控
、
记录等动作，包括流体移动和
/
或弹性层的移动，其中微流控路径装置如本文所述的微流控设备所使用
。
[0260]
图
2b
是可以如本文所述使用的微流控路径装置控制系统的一个实例的示意图
。
在该实例中，该设备包括壳
233
，其包围着可容纳一个或更多个微流控路径装置
211
的座架
215
，该微流控路径装置可以是一次性使用的装置
。
壳可以是室
、
壳体等，其可以包括盖或开口；当关闭时壳可以被密封
。
壳可以封闭热调节器和
/
或可以配置为封闭在热调节环境
(
诸如冷冻单元等
)
中
。
壳可以形成无菌屏障
。
在一些实例中，壳可以形成加湿或湿度受控的环境
。
[0261]
座架
215
可以配置为使用配置为将微流控路径装置容纳在固定和预定方向的一个或更多个销钉或其他组件来固定微流控路径装置
。
[0262]
在一些实例中，热控制器
213
可位于座架
215
附近，以调节一个或更多个微流控路径装置
211
的温度
。
热控制器可以包括热电组件
(
例如
peltier
装置
)
和
/
或一个或更多个散热器，用于控制所有或部分微流控路径装置的温度
。
在一些实例中，可以包括多于一个热控制器，用于分别地调节微流控路径装置的一个或更多个区域的温度
。
热控制器可以包括一个或更多个热传感器
(
例如，热电偶等
)
，其可用于反馈控制微流控路径装置的和
/
或热控制器
。
[0263]
在图
2b
中，流体接口组件
209
将液体试剂和
/
或压力
(
例如，气体
)
与保持在座架
215
中的微流控路径装置
211
偶联，并且可以帮助递送流体材料以及正
/
负气体压力，从压力源
217
到微流控路径装置
211
的内部
。
如下文更详细描述的，流体接口组件可以任选地帮助固定微流控路径装置
。
流体接口组件可以可移除地偶联到设备
(
并且可以被移除或一部分可以被移除
)
用于在使用之间进行消毒
。
[0264]
试剂储存框
207
可以配置为含有多于一个流体样品保持器
(holder)
，每个样品保持器可以容纳流体小瓶，该流体小瓶配置为容纳试剂
(
例如，核苷酸
、
溶剂
、
水等
)
以递送到微流控装置
211
，或者可选地流体小瓶可以配置为接收来自微流控路径装置
211
内部的产物
。
试剂储存框可称为试剂架
。
在一些实例中，试剂架包括多于一条压力管线和
/
或歧管，其配置为将一个或更多个压力源
217
分成多于一条压力管线，这些压力管线可以应用于微流控路径装置，且独立地或共同地
(
以子组合
)
被控制
。
可选地，流体贮库
(
小瓶等
)
可以配置为直接固定和密封抵靠微流控路径装置
。
[0265]
流体接口组件可以包括多于一条流体管线和
/
或压力管线，并且可以包括偏置的
(
例如，弹簧加载的
)
保持器或尖端，当微流控路径装置保持在座架
215
中时，所述保持器或尖端单独和独立地驱动每条流体和
/
或压力管线到微流控路径装置中
(
或如提及的，替代地微流控路径装置可以直接是弹簧安装的
)。
管道，例如流体管线和
/
或压力管线，可以是流体接口组件的一部分和
/
或可以连接到流体接口组件
。
在一些实例中，流体管线包含柔性管，该柔性管经由将小瓶与管以锁定接合
(
例如，套圈
(ferrule))
偶联的连接器连接在微流控路径装置和试剂储存框之间
。
流体路径的末端，在一些实例中，流体管线
/
压力管线的末端，可以配置为密封抵靠微流控路径装置，例如，在微流控路径装置中形成的密封端口处，如本文所述
。
例如，流体管线的末端可以切割或形成为平坦的
(
在侧视图中垂直的
)。
可以经由连接器对小瓶加压
(
例如，
》
约1个
atm
压力，诸如2个
atm、3
个
atm、5
个
atm
等
)
，该连接器还可以连接到压力源
。
例如，流体小瓶可以被加压至约1和约
20psig
之间
(
例如，约
5psig、
约
10psig、
约
20psig
等
)。
可施加负压或正压；例如，在过程结束时，可以施加真空
(
例如，约-7psig
或约
7psig)
以将流体抽回小瓶
(
例如，贮库
)
中
。
通常，流体小瓶可以以比气动阀低的压力驱动，这可以防止或减少泄漏
。
在一些实例中，流体阀和气动阀之间的压力差可以在约
5psi
之间
(
例如，约
7psi、
约
10psi、
约
12psi、
约
15psi、
约
20psi
等
)。
[0266]
可以对每个小瓶编码
(
例如，用可以由一个或更多个传感器读取的标识符编码，如下所述
)。
控制器可以监测流体水平并因此监测流体接口组件中每种材料的量
。
[0267]
该设备还可以包括磁场施加器
219
，其可以配置为在微流控路径装置
211
的区域处创建磁场
。
可以作为光学传感器的一个或更多个传感器
205
，可以是该设备的一部分，并且
可以感测以下一项或更多项：条形码
、
保持在试剂储存框内的流体小瓶内的流体水平
、
和当装置安装在座架
215
内时微流控路径装置
211
内的流体移动
。
[0268]
传感器可以例如通过测量光学指标来测量装置上的过程
。
在一些实例中，视觉
/
光学标记物可用于估计产量
。
例如，荧光可用于通过用荧光团加标签来检测过程产量或残留材料
。
可选地或另外，动态光散射可用于测量微流控路径装置的一部分
(
例如，诸如混合部分
)
内的粒度分布
。
在一些实例中，可以使用一根或两根光纤来完成传感器测量，以将光
(
例如，激光
)
传送进来并检测出来的光信号
。
仪器包可以远离装置安装
。
这样的非接触式感测可以是优选的
。
[0269]
在本文所述的方法和设备的任一种中，传感器
(
例如，视频传感器
)
可以记录微流控路径装置
(
例如，芯片或盒
)
上的所有活动
。
例如，用于合成和
/
或处理材料
(
诸如治疗性
rna)
的整个运行可以由一个或更多个视频传感器记录，其包括可以例如从上方将微流控路径装置可视化的视频传感器
。
在微流控路径装置上的处理可以在视觉上跟踪，并且可以保存该记录以用于以后的质量控制和
/
或处理
。
因此，可以保存
、
存储和
/
或传输处理的视频记录以供后续查看和
/
或分析
。
[0270]
设备的内部部分，例如在壳
233
内，还可以配置为可消毒的
。
特别地，设备的部分可以取出并且单独地消毒
。
可以例如通过
uv
照射或限制污染或满足法规要求可能需要的任何其他消毒方法来实施消毒
。
包括壳的设备可以被容纳在高效微粒空气
(hepa)
过滤环境中
。
包括壳的设备可以被容纳在温度受控的壳体内
。
此外，设备本身可以包括一个或更多个温度受控的区域
。
在本文所述的设备的任一种中，该设备可以包括
(
例如，在壳内
)
温度受控区域，其用于储存试剂和
/
或用于储存
mrna(
例如，治疗性
mrna)
，例如，在储存温度
(
例如，温度在约-10℃
和约
20℃
之间，诸如约
100℃、
约
4℃、
约-10℃
等
)。
这些设备中的任一种可以包括制备的
mrna
文库，其可以单独或与一种或更多种另外的
mrna
和递送媒介物组合地复合
。
[0271]
如以上提及的，微流控路径装置控制器系统可以由控制器
221
控制，其包括通过微流控路径装置
211
施加压力以至少驱动流体移动
。
控制器可以完全或部分地在壳之外
。
控制器可以配置成包括用户输入
/
输出
。
例如，系统的用户界面
223
可以允许设备和微流控路径装置的简单操作和引导
。
[0272]
本文所述设备的任一种可以包括图
2b
所示的所有或一些组件；并非所有组件都是必需的
。
在图
2b
中，仅显示了组件之间的一些连接；可以使用另外
(
或替代
)
的连接
。
[0273]
微流控路径装置控制系统可以支持微流控路径装置内的所有生产活动，诸如试剂供应
、
流体控制
、
温度控制
、
混合
、
纯化和过程监控
。
可以通过应用软件访问和控制微流控路径装置控制系统上的制备活动
。
[0274]
微流控路径装置可以配置为包括一个或更多个反应器，其用于制备操作，实施该制备操作以精确地制备治疗性
(
例如治疗性
mrna)
材料
。
相同的微流控路径装置可以在一个或更多个微流控路径装置上以串联和
/
或并联方式运行，并且不会中断微流控路径装置控制系统的连续路径性质
。
例如，当使用在使用多于一个微流控路径装置的多于一个反应器中实施的多于一个处理操作来制备治疗剂时，流体产物
(
包括来自一个微流控路径装置的部分产物
)
可以通过设备以封闭路径方式转移到一个或更多个另外的微流控路径装置中，包括通过将含有流体的微流控路径装置产物移动到微流控路径装置控制装置的储存贮库部分中
。
[0275]
每个微流控路径装置可以配置为包括一个或更多个用于在制备过程中进行处理的反应器
。
例如，图
3a-图
3c
显示了微流控路径装置的三个实例
。
这些实例显示了三种不同类型的微流控路径装置：模板微流控路径装置
(
图
3a)、
体外转录
(ivt)
微流控路径装置
(
图
3b)
和配制微流控路径装置
(
图
3c)。
这些微流控路径装置实例中的每一个可以配置为包括以受控和高度可再现的方式实施一组单元操作的特征
。
[0276]
在一些实例中，微流控路径装置可以配置为包含两个更刚性的层的多层结构，其中柔性膜夹在两个脊状层之间
。
图4显示了穿过具有多于一个层的微流控路径装置的一个实例的截面图
(
横跨微流控路径装置的平面
)
，所述多于一个层形成用于处理如本文所述的治疗剂的反应器
。
反应器可以包括由多于一个层形成的密封件
、
通道
、
阀和室，该室包括泵送室
。
例如，微流控路径装置可以由两个或更多个刚性或半刚性的板
403、405
和至少一个弹性层
407
形成
。
弹性层
407
可以是不透液体的弹性材料片
。
弹性层可以稍微透气，或者可以处理为或多或少透气，其包括在各个区域
。
尽管可以使用单个连续的弹性材料片，但在一些实例中可以使用多于一个弹性材料片，或者
‘
片’可以由多于一个片的部分形成
。
这些层和弹性片可以层压在一起
。
通常，用于容纳
、
阀调和
/
或泵送流体的室可以在弹性层任一侧的板中形成，使得弹性层将室分为液体容纳侧和压力
(
例如，气体
)
施加侧
。
室的总体积可以是恒定的，并且可以形成在第一
(
例如，上
)
板和第二
(
例如，下
)
板中，但是该体积可以分为压力侧和液体侧
。
通过向压力侧施加正压或负压，弹性片可以变形以减少
(
降至零，关闭室
)
液体容纳侧的体积或增加液体容纳侧的体积
(
至预定的最大值
)。
室的压力施加侧可以连接，例如，经由连接到压力通道
447
的上板
403
中的压力端口
443
，用于向一个或更多个室的压力接收侧
419
施加负压或正压
。
与每个室的压力施加侧相对的液体容纳侧
417
可以经由流体通道
421
连接到流体端口
423。
流体端口和压力端口两者都可以由通向上板
403
和弹性层
407
的开口形成，当压力管线被推入弹性层
407
中时
(
该弹性层
407
由相对的刚性或半刚性层
405、409
在端口的下侧支撑
)
，即使当有多于一个不同输入管线时，也允许与大气隔离的密封连接
。
[0277]
图4中，微流控路径装置
400
包括第一
(
例如，上
)
板
403
，其具有第一
(
例如，顶或上
)
表面
411
和第二
(
底或下
)
表面
429
以及两者之间的厚度
。
第一表面
411
可以形成暴露的外表面
。
微流控路径装置还包括第二板
405
，第二板
405
具有第一
(
例如，上或顶部
)
表面
431
和第二
(
例如，下或底
)
表面
433
以及它们之间的厚度
。
弹性层
407
夹在第一板
403
的第二表面
429
和第二板
405
的第一表面
431
之间
。
第三板
409
在第二板的第二表面
433
上直接或间接地偶联到第二板
。
第三板
409
还具有第一
(
例如，上或顶
)
表面和第二
(
下或底
)
表面以及它们之间的厚度
。
第三板的第二表面可以形成微流控路径装置的底表面
。
板的任一种可以由多于一层形成，这些层可以层压或以其他方式连接在一起
。
例如，在图4中，第三板
409
包括任选的第二弹性层
413
，其可以帮助将第三板偶联到第二板；本实例中的第二弹性层
413
形成第三板
409
的第一表面
435。
图4中显示的层和板可以不是按比例的
(
例如，弹性层
407
可以相对于板更薄
)。
[0278]
图4中显示的微流控路径装置
400
还可以包括多于一个室
415、416、418、420
，每个室具有固定的体积
。
这些室由第一板
403
的第二
(
底
)
表面
429
和第二板
405
的第一
(
上
)
表面
431
中的切出区域
(
例如，圆形
/
弯曲切口
)
形成；弹性层
407
将这些室
415
分叉，使得每个室都包括液体容纳侧
417
和压力
(
例如，气体容纳
)
侧
419。
微流控路径装置
400
还可以包括多于一个液体
(
例如，流体
)
通道
。
在图4中，显示单个流体通道
421
，其从流体端口
423
延伸，穿过第
一板
403
的厚度，到流体通道开口
425
，其穿过弹性层
407
，并穿过第二板
405
的大部分厚度向下到第二板的底表面
433
，其中液体通道
421
的平行于第三板的底表面延伸的长度形成在第二板的底表面
433
中，并以第三板
409
的上表面为界
。
[0279]
关于流体端口
423
，第一板
403
中形成流体端口
423(
其延伸穿过第一板的厚度
)
的开口的直径可以大于流体通道开口
425(
其延伸穿过弹性层
407
并进入液体
(
例如，流体
)
通道
421)
的直径
。
流体通道开口
425
可以相对于流体端口开口的底居中，并且可以从流体端口开口的壁偏移至少将连接到流体端口的流体管线或流体管线偶联接口的预期壁厚度
。
[0280]
流体通道
421
连接到第一室
415
的液体容纳侧
417。
该第一室可以配置为阀，其具有相对低的保持体积
(
固定体积
)
，但可以通过移动弹性层
407
来完全打开或关闭
。
[0281]
微流控路径装置
400
还包括多于一个压力通道，这些压力通道可以被独立控制以施加正压和
/
或负压
。
在图4中，显示了连接到第四室
420
的单个压力端口
443
，尽管室
415、416、418
中的每一个都可以连接到单独的压力端口和压力通道
(
用于独立地操作和控制将这些室分叉的弹性层
407
的部分的移动
)
，以对每个室进行独立阀调和
/
或泵送
。
在一些实例中，压力端口可以在多于一个室之间共享
。
在图4中，压力
(
例如，气体
)
端口
443
类似于流体
(
例如，液体
)
端口
425
，并且包括完全穿过第一板
403
的开口，向下到暴露的弹性层
407
，通过弹性层到开口形成压力
(
例如，气体
)
通道开口
445。
压力通道开口
445
与压力
(
例如，气体
)
通道
447
连续，该通道
447
从压力端口
443
延伸，穿过第一板
403
的大部分厚度，并且在沿着第二板的底的切出通道
(
或替代地进入第三板的顶部的切出区域
)
并通过第二板和弹性层
407
返回到第一板内压力通道内的区域，其连接到第四室
420
的压力
(
例如，气体
)
容纳部分
419。
如对于类似的流体
(
例如，液体
)
端口所述，穿过第一板
403
的厚度的压力端口
443
的直径可以大于通过弹性层
407
的压力通道开口
445
的直径，并且可以居中或以大于将连接到压力端口的压力管线或压力管线偶联接口的壁厚度偏移
。
[0282]
在穿过图4中所示的微流控路径装置
400
的截面中，存在与未示出的其他流体
(
例如，液体
)
管线
、
流体端口
、
压力管线和压力端口的多于一个连接，因为它们可能在所示平面之外
。
例如，在图4中，第四室的液体容纳侧或部分
417
可以连接到另外的阀
(
室
)
和
/
或通道，其包括例如从液体容纳侧
417
延伸的出口通道
。
未示出的另外的室
(
例如配置为阀
)
可以如上所述形成
。
在一些实例中，出口通道可以通过另一个流体端口
(
未示出
)
将流体从一个或更多个室递送到流体接收贮库，例如小瓶
、
管等
。
该接收贮库可以保持在试剂储存框中
。
[0283]
通常，微流控路径装置和微流控设备的这种配置被配置为使得多于一个复杂操作可以由微流控路径装置上的设备以完全封闭
(
密封和保护免受大气影响
)
的方式执行，而无需人工干预
。
流体可以使用固定体积的室来计量，并通过向弹性层的偏转区域施加气动压力来移动
、
混合
、
过滤等
。
[0284]
在一些实例中，微流控路径装置内的室可配置为混合室，用于混合微流控路径装置内的流体
。
在一些实例中，室可配置成纯化室，其可以包括过滤材料
。
在一些实例中，一个或更多个室可以配置为用于浓缩治疗性材料的浓缩器
。
[0285]
尽管各种微流控路径装置可以具有不同布置的通道
、
端口和室，但它们也可以共享相似的基本架构和许多可用于不同配置以执行不同方案的功能元件
。
功能元件包括如上所述的输入端口
、
计量阀
、
泵
、
反应室
、
混合结构和纯化结构
。
[0286]
这些微流控路径装置中的任一个可以包括一个或更多个气泡去除室，或者室的流
体接触侧的任何室可以配置为气泡去除室，其中流体容纳侧的流体内的气泡可以被去除
。
气泡去除室可以称为真空帽，并且通常可以配置成在膜的对侧上施加负压，而将流体保持在室的流体接触侧内
。
如提及的，膜可以是至少部分透气的
。
图
19c
示出了气泡去除室的实例
。
将室分开的膜的全部或更优选地一部分
1988(
例如，仅仅帽区域
)
可以通过例如在装置的上表面或上板中的真空管线
1987
与真空接触，如图
19c
所示
。
在操作中，真空帽
1938
可以通过将流体保持在室的流体接触侧内并在室的上
(
压力接收
)
侧施加负压来去除或减少管线内的气泡
。
将室分为流体接触侧和压力接收侧的膜可以是透气的，使得负压可以通过覆盖在流控路径上的膜气
(
例如，空气
、
氮气等
)
而从液体
(
流体
)
侧去除气体
。
例如，膜
(
或真空帽中的膜区域
)
可以是，例如聚二甲基硅氧烷
((pdms)
弹性体膜，其具有足够的透气性以允许从膜的液体侧去除气体
。
如本文所述，具有固定体积的流体室
(
例如，在第一板和第二板之间形成的
)
可以包括或偶联到一个或更多个气泡去除室
(
真空帽
)
和
/
或可以配置为气泡去除室
。
在一些实例中，设置在形成室的第一和第二表面之间的弹性层的部分可以仅最小地
(
或根本不
)
偏转，该弹性层的部分分开流体接触侧
(
例如，在第二表面
(
和
/
或第二板
)
中
)
和第一表面
(
和
/
或第一板
)
中的压力接收侧
。
例如，上压力接收侧可以最小地间隔，和
/
或几乎与松弛的膜齐平
(
例如，平坦
)
，而流体接触侧是凹形的并延伸到第二表面
(
第二板
)
中
。
控制器可以将流体保持在真空帽区域内，例如，通过在真空帽的任一侧或两侧
(
入口和出口
)
上阀，例如，通过向阀的压力接收侧施加正压，并且可以向真空帽的压力接收侧施加负压
。
施加的负压的绝对量
(
例如，负压的量值
)
可以小于施加以偏转膜的量
(
例如，小于施加以关闭阀和
/
或泵的正压的绝对值
)。
可选地，在一些实例中，膜可以配置为相对于第一表面和
/
或板被偏转
(
例如，向上偏转
)
，例如，以从输入
1989
将流体吸入室的扩大的流体接触侧
。
膜可以通过相对于第一上表面施加的负压被保持，从而允许去除气体泡
(gas bubble)(
例如，空气泡
(air bubble))。
控制器可以将流体在真空室中保持足以去除所有或一些气体的时段
(
例如，约1秒或更长
、
约5秒或更长
、
约
10
秒或更长
、
约
20
秒或更长
、
约
30
秒或更长
、
约1分钟或更长
、
约
1.5
分钟或更长
、
约2分钟或更长
、
约5分钟或更长
、
约1秒和约5分钟之间
、
约2秒和约5分钟之间
、
约5秒和约5分钟之间等
)。
在图
19c
中，压力可以通过与形成在装置的第一和第二表面
(
例如，第一和第二板
)
之间的室的压力接收侧连通的压力管线
1987
来施加
。
真空帽
1938
可以由一个或更多个阀
1992
阀调
。
流体可以从真空帽的相对侧的流体管线
1989
离开流体接触侧
。
[0287]
压力帽的室的流体接触侧
(
如本文所述的阀和反应器一样
)
可以与流体端口流体连通，该流体端口经由一种或更多种流体通道与每个室的流体接触侧流体连接，所述流体通道可以在第二表面和
/
或板中
。
如本文所述，真空帽的压力接收侧可以与延伸穿过第一表面
/
板
(
例如，并进入表面
/
板中
)
的压力端口流体连通，以经由压力通道与压力接收端口或压力接收侧流体连接，该压力通道延伸穿过第二板并沿着第一板延伸
。
[0288]
如上所述，本文所述的微流控路径装置中的任一个可以是微流控路径板装置，其中装置基本上是薄的
。
因此，板中
/
板上的处理可以基本上在二维
(2d)
中实施，包括任何多核苷酸
(
例如，
mrna)
的纯化
。
与现有技术相比，
2d
中多核苷酸的纯化是特别有利的，所述现有技术可能需要使用柱并且可能涉及在如本文所述的封闭路径环境和
/
或小体积中难以或不可能实施的步骤
。
[0289]
此外，如图4所显示，每个室的流体接触侧
(
和
/
或压力接收侧
)
可以配置为使得在
压力接收侧中的正压驱动弹性层抵靠流体接触侧时，弹性层与第二表面中的流体接触侧齐平且没有间隙地安置
。
在一些实例中，流体接触侧和
/
或压力接收侧可以是凹形的
。
凹形可以具有稍微浅的
、
椭圆形横截面，以允许弹性层容易地抵靠流体接触侧
(
和
/
或压力接收侧
)
的壁齐平地安置
。
弹性层可以推动
(
例如，安置
)
抵靠室的壁，使得不存在室
(
例如，流体接触侧
)
的死保留部分
。
[0290]
微流控路径装置可以通过一组用于两种试剂的弹簧加载连接以及用于管理流体移动和阀控制的气动管线与微流控路径装置控制系统连接
。
试剂和气体管线可以通过相对于嵌入微流控路径装置中的弹性体层的压力来密封，创建从试剂小瓶到微流控路径装置和从微流控路径装置到输出小瓶的完全密封的路径
。
密封路径可以贯穿微流控路径装置内的所有反应来保持，有效地排除与大气的任何接触并使污染风险最小化
。
[0291]
本文所述的微流控路径装置控制系统可以提供无菌受控环境，并且可以包括用于加载试剂和回收输出的接口
。
在本文所述的设备
(
例如，系统
)
的任一种中，该设备可以包括提供受控环境的壳体；该壳体也可以放置在受控环境内
。
例如，封闭设备可以是可以放置在7类环境内的5类环境
。
[0292]
微流控路径装置的微流控路径装置控制系统可以提供与所有致动器的单步连接
。
这些控制系统还可以扫描所有试剂和微流控路径装置标识符
(
例如，条形码
)
，并且可以监测流体水平
。
通常，这些微流控路径装置控制系统可以使所有或一些微流控路径装置功能自动化，并且可以生成所有可以被监控
(
诸如用于光学质量控制分析，例如中间过程输出的光学质量控制分析
)、
存储
、
传输或稍后查看的过程操作的可视记录
。
[0293]
如以上提及的，微流控路径装置控制系统可以包括微流控路径装置管理系统，该系统包括硬件，诸如可以工程化为使得微流控路径装置正确对齐的嵌套
(
微流控路径装置保持器
)
只能以单方向插入
。
这可以例如通过嵌套中的与微流控路径装置的形状匹配的两个销钉和
/
或凹槽来管理
。
微流控路径装置管理系统
(
控制系统
)
还包括用于容纳试剂小瓶和输出小瓶的小瓶架
、
记录所有液体和阀移动以及产物输出的下视相机
。
导轨上的侧面相机捕获条形码并检测流体水平，以及带有磁体的机械臂用于珠操纵
。
微流控路径装置用真空吸盘保持就位，所述真空吸盘确保与
peltier
装置良好接触以进行温度管理
。
微流控路径装置就位后，通过定位销引导系统降低微流控路径装置管理系统的顶部部分，以单个操作实现与所有连接器的配合
。
[0294]
如提及的，微流控路径装置控制系统可以包括控制面板，该控制面板可以是所有电子装置
(cpu、
以太网
rio
装置控制器等
)
以及用于气动控制的阀和歧管以及压力调节器的接口
。
这些系统中的任一个还可以包括冷冻柜或室
(
例如，
iso 5
级安全柜
)
，其行为类似于生物安全罩，通过
hepa
空气过滤和气流管理提供微生物安全壳体
。
此外，这可以确保所有试剂在整个制备过程中都保持在正确的温度
。
柜还可以配备
uv
灯以对微流控路径装置和所有内部微流控路径装置管理系统组件消毒
。
微流控路径装置控制系统可以驻留在自身位于
iso 7
级房间中的环境
(
例如，
6ft x 6ft iso 5
级微环境
)
内
。
操作者和系统交互
(
包括加载试剂小瓶和微流控路径装置
)
都可以按照无菌最佳实践来实施
。
[0295]
递送媒介物
[0296]
本文描述的方法和设备与广泛的
mrna
递送媒介物相容
。
例如，递送媒介物可以与以下相容：电穿孔和基因枪
、
通过腺病毒
(av)
或腺相关病毒
(aav)
的病毒递送
、
外泌体和脂
质体
、
阳离子聚合物的包封和用脂质纳米颗粒
(lnp)
配制
。
[0297]
治疗剂的制备
[0298]
本文描述了用于制备治疗剂的方法和设备
(
例如，装置和系统
)。
这些方法和设备可用于在非常快的时间段内制备患者特异性治疗剂
。
特别地，如上所述，这些方法和设备可用于制备基于多核苷酸诸如
mrna
的治疗剂
。
作为该过程的一部分，所述方法和设备可以实施一些或所有上述操作，包括产生
ivt dna
模板
、
实施
tvt
反应以产生治疗性
mrna、
纯化治疗性
mrna、
用递送媒介物配制
mrna
以形成治疗性组合物和最终药物产物的配制后加工
。
[0299]
产生
ivt
模板
[0300]
本文所述的用于制备
dna
模板，并且特别是用于制备合成
dna
模板的方法对于制备更好
、
更可扩展
、
更快和更安全的疫苗和治疗剂可能特别有用
。
通过
ivt
使用合成模板进行
mrna
合成在许多方面是有益的，包括防止潜在的微生物污染
。
含有合成
dna
模板的溶液通常不含污染细胞
、
不含细胞提取物且不含来自细胞的内毒素
。
这些溶液可能特别适合作为疫苗的一部分，用于注射到患者体内，几乎不会因污染细胞
、
细胞提取物或内毒素而产生毒性风险
。
[0301]
在一些实例中，如本文所述的体外转录促进子盒
(ifc)
是能够体外转录的双链
dna。
图
6a
显示了可用于制备双链
dna
模板的体外转录促进子盒的实例
。
体外转录促进子盒包括配置为促进有效体外转录
(
例如，从插入的感兴趣基因转录
)
的功能元件，诸如启动子
、
编码5’
非翻译区
(5’utr)
的部分
、
编码3’
非翻译区
(3’utr)
的部分和编码多a尾的部分
。
体外转录促进子盒还包括一个或更多个接头和确保模板线性化的限制性位点，所述接头可用于将感兴趣的基因克隆到体外转录促进子盒中以表达感兴趣的基因
。
[0302]
体外转录促进子盒可以合成或非合成地制备，但一般将合成地制备
。
在一些实例中，制备合成体外转录促进子盒的方法包括使用商业可得的
dna
合成仪，诸如可从
twist bioscience(san francisco,ca)
或
thermofisher scientific(waltham,ma)
获得的那些
。
此外，体外转录促进子盒可以由单独的
dna
片段组装而成，或者其可以合成为一个片段
。
在一些实例中，体外转录促进子盒是线性的并且可以包括可以连接在一起的可相容末端
。
在一些实例中，体外转录促进子盒是环状的
。
在一些实例中，环状体外转录促进子盒包括在编码多a区的部分和启动子之间的位点
(
例如，限制性核酸内切酶位点
)
，该位点配置为用于在应用适当的限制性核酸内切酶时生成线性
dna
，所述线性
dna
依次含有启动子
、5’utr、
接头区
、3’utr
和编码多a区的部分
。
通常，体外转录促进子盒不编码抗生素抗性基因
。
例如，合成地合成的体外转录促进子盒不需要抗生素抗性基因，因为它不是在生物
(
例如细菌
)
细胞中生长并且不需要抗生素选择
。
通常，体外转录促进子盒不具有复制起点
(ori)
或用于促进
dna
复制的相关控制元件
。
例如，合成地合成的体外转录促进子盒不需要
ori
，因为它不在生物
(
例如细菌
)
细胞中生长并且不需要用于复制的
ori。
体外转录促进子盒的总长度可以小于许多质粒
。
体外转录促进子盒的长度可以小于约
2kb、
长度小于约
1.5kb、
长度小于约
1.0kb、
长度小于约
900bp、
长度小于约
800bp、
长度小于约
700bp
或长度小于约
600bp。
[0303]
如上所示，体外转录促进子盒包括启动子
。
酶
(rna
聚合酶
)
与启动子结合并启动自感兴趣基因的
rna
的转录
(
例如，在从盒和感兴趣基因组装双链
dna
模板之后
)。
可用于盒中转录的启动子的实例包括天然或修饰的
t7
启动子
、
天然或修饰的
t3
启动子
、
或天然或修饰的
sp6
启动子
。
[0304]
体外转录促进子盒还包括编码可交换5’
非翻译区
(5’utr)
的部分和编码可交换3’
非翻译区
(3’utr)
的部分
。
这些区域
(
其自身不会被翻译成蛋白质或肽
)
帮助调节
mrna
向蛋白质或肽的翻译
。
体外转录促进子盒还包括编码多a尾的部分
。mrna
中的多a尾是数十或数百个重复的腺嘌呤残基的长链
。
认为
mrna
上的多a尾发挥多种功能，诸如增加
mrna
在细胞胞质中的稳定性和辅助
mrna
向蛋白质的翻译
。
不同于由
mrna
的模板中的
dna
直接编码的其余的
mrna
序列，多a尾通常不由
dna
直接编码
(
例如，在自然界中
)。
而是，天然存在的
dna
含有速记信号，称为多腺苷酸化信号
(
例如，
aataaa)
，它与其他
dna
序列一起向细胞中的转录机器发出信号，以向正在合成的
mrna
添加多a尾
。
换言之，天然存在的
mrna
中多a尾的长度由产生
mrna
的细胞决定
。
如图
6a
所见，如本文所述的体外转录促进子盒包括直接编码多a尾
(
例如，整个尾
)
的
dna
区域
。
多a尾的长度由直接编码多a尾的
dna
区域的长度
(
例如，腺嘌呤或多a的数量
、
或胸苷或多
t
的数量
)
决定
。
直接编码多a尾的
dna
区域可以是至少约
100bp
长
、
至少约
200bp
长
、
至少约
300bp
长
、
至少约
400bp
长
、
或至少约
500bp
长，并且可以是介于这些之间的任何尺寸
(
诸如约
350
个碱基对长
)。
可以使用与用于生成其余
mrna
相同的过程将多a尾添加到使用盒作为模板制备的
mrna。
这样的一个优点是大大简化了生成整个
mrna
包括多a尾的过程
。
为了生成
mrna
，不需要活细胞和来自含有细胞
dna、
细胞
rna、
细胞膜蛋白和其他组分的细胞的复杂提取物
。
相反，明确定义的转录混合物可用于从本文所述的双链
dna
模板生成整个
mrna
，包括多a尾，从而使转录混合物通常不含在使用细胞或细胞提取物制备的转录混合物中可能存在的毒性副产物
。
明确定义的混合物可以安全地递送给患者，只需进行最少的清理
。
当双链
dna
模板也由基本不含毒性副产物的明确定义的混合物生成时，从双链
dna
模板制备的转录产物适合直接注射到患者体内，其只需进行最少的清理
。
本文描述了由基本不含毒性副产物的明确定义的混合物生成的双链
dna
模板
。
[0305]
体外转录促进子盒还包括一个或更多个接头区
。
接头区在5’
utr
和3’
utr
之间
。
接头区包括至少一个可裂解位点和通常两个可裂解位点
。
如果存在两个或更多个可裂解位点，它们可以具有相同的序列或不同的序列
。
一个或更多个可裂解的限制性位点可用于将感兴趣的基因
(goi)
插入体外转录促进子盒以生成合成的线性或环状连接产物
。
感兴趣的基因通常插入在外转录促进子盒中的5’
utr
和3’
utr
之间，尽管在一些情况下，5’
utr
或3’
utr
序列可以与感兴趣的基因包含在一起，并与感兴趣的基因一起插入体外转录促进子盒
。
可裂解位点可以是限制性内切酶位点，诸如
ii
型
(iig
型
、iis
型
)
限制性内切酶，诸如
bsai、bbsi、aari、hhai、hindiii、noti、bbvci、ecori、bglii、foki、alwi、acui
或
bcgi
，其可从
new england biolabs(neb
；
ipswich,ma)、promega corporation(madison,wi)
或
thermofisher scientific(waltham,ma)
获得
。
[0306]
如本文所述的感兴趣的基因
(goi)
是短的
dna
段，其通常编码功能性产物分子
(rna
或蛋白质
)。
感兴趣的基因可以编码特定的蛋白质
、
蛋白质的一部分或特定的功能
。
在一些情况下，感兴趣的基因可以含有生成不编码特定蛋白质或蛋白质部分的
rna
的指令
(
例如，感兴趣的基因可以编码不被翻译的功能性
rna)。
[0307]
可用于插入到体外转录促进子盒的感兴趣基因可以合成或非合成制备，但一般将合成地制备
。
制备感兴趣的合成基因的方法包括通过使用可商业获得的
dna
合成仪和方法，诸如可从
twist bioscience(san francisco,ca)
或
thermofisher scientific(waltham,ma)
获得的那些
。
此外，虽然感兴趣的基因可以由单独的
dna
片段组装而成，但通常它是作为
一个片段合成的
。
感兴趣的基因可以制备为
dna
的线性片段或环状片段
。
可以用限制性内切酶消化感兴趣的环状基因以形成感兴趣的线性化基因
。
可以纯化制备的感兴趣基因
(
例如，通过柱
、
电泳分离等
)。
[0308]
感兴趣的基因通常在将它与体外转录促进子盒组合之前进行裂解
。
特别地，感兴趣的基因可以用与用于裂解体外转录促进子盒相同的限制性核酸内切酶裂解，但也可以通过酶促扩增生成
。
通常，感兴趣的基因不编码抗生素抗性基因
。
例如，合成地合成的感兴趣的基因不需要抗生素抗性基因，因为它不是在生物
(
例如细菌
)
细胞中生长并且不需要抗生素选择
。
通常，感兴趣的基因不具有复制起点
(ori)
或用于促进
dna
复制的相关控制元件
。
例如，合成地合成的感兴趣的基因不需要
ori
，因为它不在生物
(
例如细菌
)
细胞中生长并且不需要用于复制的
ori。
在一些实例中，感兴趣基因的总长度可以小于许多质粒
。
感兴趣的基因长度可以小于约
2kb、
长度小于约
1.5kb、
长度小于约
1.0kb、
长度小于约
900bp、
长度小于约
800bp、
长度小于约
700bp、
或长度小于约
600bp、
长度小于约
500bp、
长度小于约
400bp、
或长度小于约
300bp、
长度小于约
200bp、
长度小于约
100bp。
[0309]
在一些实例中，感兴趣的基因是
t
细胞受体
(tcr)
或
t
细胞受体的一部分，诸如用于治疗由
t
细胞受体
(tcr)
或
t
细胞受体的一部分介导的
ctcl
或其他疾病或状况
。
例如，在
t
细胞发育中，细胞必须重排
t
细胞受体
(tcr)
基因以创建和表达新的
tcr
分子
。
因为
tcr
重排发生在
t
细胞发育早期并且在成熟
t
细胞淋巴瘤
(
诸如
ctcl)
发展之前，所以每个恶性
ctcl
细胞表达相同的克隆
tcr
，包含独特的
tcr
α
和
tcr
β
亚基
。
这种
tcr
对淋巴瘤细胞是独特的，使得它对免疫系统而言在其他方面是外来的，并因此是优异的治疗靶
。
[0310]
感兴趣的基因可以是互补决定区
(cdr)
区域的一部分或全部
。cdr
是
tcr
序列的高度可变部分，并介导
t
细胞与抗原-主要组织相容性复合体
(mhc)
的结合
。
图8显示可用于制备用于疫苗或治疗剂的双链
dna
的
t
细胞受体的一个区域
。
特别是，跨越
v(d)j
和c区域之间连接部的
cdr3
区域具有最高的可变性，并且代表了真正独特的蛋白质片段，该蛋白质片段应当只存在于淋巴瘤细胞中
。
因此，在c末端和n末端两端延伸
10
个氨基酸的
cdr3
区域构成疫苗肽片段
。
在一些方法中，基因的独特序列，诸如
t
细胞受体
(tcr)
或
t
细胞受体的一部分，是从个体中确定的，并且感兴趣的基因制备为与
t
细胞受体
(tcr)
或来自个体的
t
细胞受体的一部分
。
尽管在一些情况下，可以以特定的己知方式对序列进行可控修饰，诸如为了密码子优化或优化
rna
稳定性或表达，但感兴趣基因的序列仍然基于从个体获得的序列
。
在一些实例中，感兴趣基因的序列包含具有与来自患者的
dna
序列相同的
dna
序列
、
或相对于来自患者的
dna
序列以己知方式可控修饰的
t
细胞受体
。
[0311]
本文描述了制备双链
dna
模板的方法，特别是制备合成双链
dna
模板的方法
。
双链
dna
模板可以特别用于实施体外转录以生成
mrna
，诸如用于疫苗或其他治疗剂以用于注射或向患者递送的其他模式
。
[0312]
用于实施体外转录的现有
dna
模板和用于实施体外转录的混合物通常包括粗或半纯化的细胞提取物
(
例如，细菌
、
其他微生物或其他提取物
)
，并且可能是复杂的和不确定的
。
这样的提取物可以包括细菌
、
其他微生物或其他
dna、
内毒素和
/
或其他不希望的组分
。
当用于生成
dna
模板或实施体外转录作为疫苗或治疗用途过程的一部分时，不希望的组分会增加严重副作用的风险
。
例如，内毒素是革兰氏阴性菌外细胞壁中的大分子脂多糖，是生成用于体外转录反应的细胞提取物的常用来源
。
内毒素在血液中
(
诸如通过注射
)
会在人类
和其他动物中导致各种问题，诸如炎症和脓毒症，并带来严重的健康风险
。
本文所述的方法对于制备不含生物污染物
(
细菌
、
其他微生物或其他污染物
)、
不含细菌
(
或其他微生物或不想要的
)dna
和
/
或不含内毒素的双链
dna
模板可能特别有用
。
本文所述的方法可以包括使用明确的或合成的组分来制备感兴趣的基因
、
制备体外转录促进子盒和
/
或制备双链
dna
模板
(
或制备用于制备这些材料的任何中间体
)。
明确的或合成的组分可以由明确的或合成的成分制成，诸如
dna
合成仪
、
纯化的核苷酸和纯化的酶
。
明确的或合成的组分可以基本上不含细菌
、
其他微生物或其他
dna、
内毒素和
/
或其他不希望的组分
。
首先，通过避免使用基于生物的组分，生物污染物诸如
dna
和内毒素不会污染
dna
模板
(
或其他组分
)。
双链
dna
模板和下游材料更安全，无需困难或麻烦的纯化操作
。
本文的这种方法和其他方法可以包括以下操作：将感兴趣的合成基因与合成体外转录促进子盒连接以创建合成的线性或环状连接产物；去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒；扩增环状连接产物以生成线性
、
环状或分支的扩增
dna
；以及将扩增的
dna
连接产物线性化以生成双链
dna
模板
。
[0313]
如上所述，连接感兴趣的基因与体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物可以包括将感兴趣的基因插入到体外转录促进子盒中
。
图
6b
显示了如本文所述生成的双链
dna
模板
。
感兴趣的基因和体外转录促进子盒可以具有与本文别处描述的相同的限制性核酸内切酶位点，并且该方法可以包括用针对限制性核酸内切酶位点的限制性核酸内切酶消化感兴趣的基因和体外转录促进子盒，从而创建相容的末端，并将感兴趣的基因连接到盒中
。
该方法可以包括将感兴趣的基因
、
体外转录促进子盒
、
限制性核酸内切酶缓冲液
、
能量来源
、
一种或更多种限制性核酸内切酶
、
连接酶缓冲液和连接酶组合，并将混合物孵育适当的时间量
。
缓冲液可以适用于或优化用于特定限制性核酸内切酶和
/
或连接酶，并且可以是一种缓冲液或可以是两种
(
或更多种
)
缓冲液
。
核酸内切酶和
/
或连接酶缓冲液可以是商业可获得的缓冲液
(
例如，
neb、promega)
和
/
或可以包含
tris、
氯化钾
、
氯化镁
、
氯化钠和二硫苏糖醇，诸如
tris-乙酸盐
(
例如，约
6mm-90mm)、
乙酸钾
(
约
50mm-100mm)、
乙酸镁
(
约
5mm-10mm)、
牛血清白蛋白
(bsa
；约
50ug/m1-200 ug/ml)、
二硫苏糖醇
(1mm)
，
ph
为约
7.4
至约
9.0。
连接酶可以是可商业获得的
(
例如，
new england biolabs、promega、thermo fisher scientific)
或其他连接酶，诸如
t3 dna
连接酶
、t4 dna
连接酶或
t7 dna
连接酶
。
消化可以进行约
10
分钟到约4小时或之间的任何时间量
(
例如，约
30
分钟
、
约1小时
、
约2小时等
)。
连接步骤可以进行约
10
分钟到约4小时或之间的任何时间量
(
例如，约
30
分钟
、
约1小时
、
约2小时等
)。
消化和连接操作可以同时或依次实施
。
能量来源可以是腺苷5’‑
三磷酸
(atp)(
例如，约
0.1mm
到约
5mm)。
可以随着时间的推移添加另外量的任何组分，诸如限制性核酸内切酶和连接酶，并且可以继续孵育
。
在一些实例中，只有经证明无动物源
(aof)
的材料将用于治疗性制备，以降低传播感染因子的风险
。
其中体外转录促进子盒不是环状的这些方法中的一些包括连接体外转录促进子盒的末端并生成环状体外转录促进子盒的操作
。
可选地，可以使用用于连接感兴趣的基因和体外转录促进子盒的其他方法，诸如回嚼方法
(chew back method)。
可选地或此外，体外转录促进子盒和感兴趣的基因之间的连接可以使用引物延伸来实施，以在指数扩增方法之前生成线性分子
。
[0314]
本文所述的这种或其他方法可以包括以下操作：从合成的线性或环状连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒，或从未反应的感兴趣
的合成基因中和未反应的合成体外转录促进子中纯化双链
dna。
可以在适当的核酸外切酶缓冲液
(neb
；
promega、thermo fisher)
中使用诸如核酸外切酶
(
诸如核酸外切酶
v)
的酶从合成的环状连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒
。
该方法可以包括消化未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子
。
该方法可以包括将消化的混合物通过树脂或柱，诸如离子交换树脂或尺寸排阻树脂，并将未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒保留在柱中或将双链
dna
模板保留在柱中，并允许双链
dna
模板或未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒通过树脂或柱
。
一些实例还可以包括将消化的核苷酸保留在树脂或柱内，或允许消化的核苷酸通过树脂或柱
。
一些实例包括洗涤和
/
或洗脱树脂或柱
。
一些实例还可以包括将消化的核苷酸保留在树脂或柱内
。
一些实例包括将未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒结合到珠上
、
或将双链
dna
结合到珠上，用磁体保留珠并去除双链
dna、
或从双链
dna
中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒
。
树脂
、
柱和磁珠可从诸如
bangs laboratories,inc.,(fishers,in)、beckman coulter(brea,ca)、millipore(burlington ma)、thermo fisher,vwr(radnor,pa)
等处获得
。
一些实例可以包括使用甲基化敏感性限制性内切酶
。
[0315]
本文所述的这种方法和其他方法可以包括扩增线性或环状连接产物以生成扩增的
dna。
一些方法包括扩增线性或环状连接产物以生成线性扩增
dna。
一些方法包括扩增线性或环状连接产物以生成线性
、
分支或环状扩增的
dna。
扩增产物可使用以下进行扩增：解旋酶依赖性扩增
(had)、
环介导等温扩增
(lamp)、
多重置换扩增
(mda)、
基于核酸序列的扩增
(nasba)、
聚合酶链式反应
(pcr)、
滚环扩增
(rca)、
自持序列复制
(self-sustained sequence replication
，
3sr)
或链置换扩增
(sda)。
根据需要添加适当的缓冲液
、
脱氧核糖核苷酸三磷酸
(dntp)、
酶
(dna
聚合酶
)
和用于反应的引物
。
控制扩增的温度和时间
。
该方法可以包括以下操作：加热线性或环状连接产物
(
例如，在或高于约
70℃
至约
100℃)
以使
dna
变性，并且然后冷却
dna。
该方法可以包括以下步骤：将配置为用于使
dna
变性的变性缓冲液添加到线性或环状连接产物中以使
dna
变性，并且然后将中和缓冲液添加到变性
dna
混合物中以中和变性缓冲液，并留下变性
dna。
该方法可以包括以下操作：添加用于扩增或延伸变性
dna
的酶，诸如
dna
聚合酶
(
例如，
bst dna
聚合酶
、
φ
29dna (phi29)
聚合酶
、taq dna
聚合酶
)
，并用该酶扩增或延伸
dna
以生成扩增的
dna(
例如，分支的
、
环状的或线性的扩增
dna)。
[0316]
一些方法包括从缓冲液
、
酶
、
核苷酸和其他不需要的组分中纯化扩增或延伸的
dna。
该方法可以包括使扩增或延伸的
dna
通过珠
、
树脂或柱，诸如离子交换树脂
、
磁珠或尺寸排阻树脂，并且保留扩增或延伸的
dna
或者允许扩增或延伸的
dna
通过珠
、
树脂或柱并将不需要的酶和其他组分保留在珠
、
树脂或柱中
。
一些实例包括对树脂或柱进行洗涤和
/
或洗脱和
/
或干燥和
/
或再水合
。
一些实例包括重复这些操作中的一个或更多个
。
一些实例包括两个或更多个
(
多于一个
)
珠
、
树脂或柱的贮库，并重复洗涤
/
洗脱
/
干燥
/
和
/
或再水合操作中的一个或更多个
。
一些实例包括将
dna
结合到珠，用磁体保留珠并从
dna
和珠去除
(
洗涤
)
不需要的组分和污染物
。
适合使用的树脂
、
柱和磁珠可从
bangs laboratories,inc.,(fishers,in)、beckman coulter(brea,ca)、millipore(burlington ma)、thermo fisher
和
vwr(radnor,pa)
获得
。
[0317]
在一些实例中，扩增的
dna
不是线性的；它可以是分支的或环状的
。
一些方法包括
将
dna
线性化和生成线性化模板
dna。
一些方法可以包括将限制性核酸内切酶
(
在适当的缓冲液中
)
添加到纯化的扩增或延伸的
dna
中
、
将
dna
与限制性核酸内切酶一起孵育以及将
dna
线性化
。
选择限制性酶被以便在5’
utr、
感兴趣的基因
、3’utr
和编码多a区域的部分之外进行裂解
。
在一些实例中，限制性内切酶在一个延伸或扩增的
dna
的3’
utr
和邻接的
(
和下游
)
延伸或扩增的
dna
的5’
utr
之间进行裂解
。
关于限制性酶消化用于连接感兴趣的合成基因和合成体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物，限制性酶可以是任何限制性酶，诸如
iis
型限制性内切酶，如上文所示
。
在一些实例中，限制性内切酶是
bsai、bbsi、aari、hhai、hindiii、noti、bbvci、ecori、bglii、foki、alwi、acui
或
bcgi
中的至少一种，其可从
new england biolabs(neb
；
ipswich,ma)、promega corporation(madison,wi)
或
thermofisher scientific(waltham,ma)
获得
。
在一些实例中，限制性核酸内切酶与用于将感兴趣的合成基因插入体外转录促进子盒中的限制性核酸内切酶相同
。
在一些实例中，限制性内切酶与用于将感兴趣的合成基因插入体外转录促进子盒中的限制性核酸内切酶不同
。
本文还描述了用于制备如本文所述的双链
dna
的微流控路径装置反应器
。
[0318]
图9显示了用于生成双链
dna
的微流控生物芯片反应器的架构的一种实例的实例
。
本文所述的这种方法和其他方法可以包括在无菌封闭的生物芯片中从感兴趣的基因和体外转录促进子盒生成双链
dna
，其中所有组分在生成过程中都保持无菌
。
无菌
、
封闭的生物芯片对于大气是封闭的
。
图9显示了具有4个互连反应器
(
例如，模块或室
)
的微流控生物芯片反应器，通过这些反应器，在不同阶段的
dna
前体沿着成为双链
dna
模板的途径移动
。
例如，在图9中，可以包括连接反应器
(
连接反应室
901)、
预混合室
903、
扩增反应器
(
扩增反应室
905)
和消化反应器
(
消化反应室
)907(
连接器和阀在该实例中未示出
)。
本文所述方法的不同步骤在不同的模块或室中进行
。
感兴趣的基因和体外转录促进子盒在预混合室中混合在一起
。
感兴趣的基因和体外转录促进子盒连接在一起以在连接反应室中生成连接产物
。
在扩增室中扩增连接的产物以生成扩增的
dna。
进一步处理扩增的
dna
，诸如在消化反应室中消化以去除不需要的
dna
或分离扩增的感兴趣的基因的不同拷贝
。
[0319]
使用
pcr
形成模板
[0320]
通常，本文描述了使用基于
pcr
的
、
无动物技术来形成合成多核苷酸
(
例如，
dna)
模板的方法和设备，包括用于形成具有长多a尾的
mrna
模板的短引物和长
(
大于约
150bp、
大于约
200bp
等
)
引物
。
[0321]
本文描述的用于
mrna
形成的模板可以是完全合成的，并且在微流控设备中不使用细菌而形成
。
当用作治疗剂的一部分时，使用细菌过程形成的模板可能提供污染的机会和可能的交叉反应问题
(
例如，患者反应
)。
本文所述的方法和设备可以从片段
(
例如，合成片段
)
开始形成模板，所述片段可以与启动子和多a尾组合，并且然后如上所述进行扩增
。
例如，靶序列，例如患者特异性序列
(
诸如感兴趣的基因或感兴趣的基因的一部分或
utr)
可以被合成，并可以通过添加可以在5’
末端结合
ivt
的启动子
(
例如
t7
启动子
)
，并且还可以在3’
末端添加长多a尾，使其具有扩增和体外转录的潜力
。
多a尾可有利地相当长
(
例如，
》
约
150mer、
大于约
200mer、
大于约
250mer
，等等
)。
[0322]
在一些实例中，用于形成模板的方法可以使用
pcr
和一组不对称
(
例如，一个相对较短，且一个长得多
)
的引物
。
合成片段的启动子侧可以包含特异性锚定引物
(
用于扩增
)
的区域
。
在一些实例中，尾端可以是非特异的
。
在这些方法中的任一种中，长多
t
尾引物
(
例如，
约
150mer
或更大
、
约
200mer
或更大，等等
)
，其还可以在一个末端包括用于退火
/
杂交的特异性序列区
(
锚定区，例如，长约
20
和约
40bp
，例如，长约
25bp)。
然后可以使用
pcr
过程来形成和扩增模板，并且可以运行大约
20
个循环或更多
。
甲基化敏感切割酶
(
诸如，例如
dpn1)
可用于去除任何潜在痕量的细菌
dna。
这些方法和设备可以包括纯化操作，以洗涤
/
去除低于阈值的任何东西，例如小于约
800bp、
小于约
700bp、
小于约
600bp、
小于约
500bp
等
。
这些方法中的任一个可以由本文描述的设备
(
例如，微流控装置
、
芯片等
)
执行并集成到其中
。
[0323]
在一些实例中，患者特异性序列
(
例如，靶
、
感兴趣的基因序列
)
可以由商业供应商提供，并且可以来源于例如环状质粒
。
在进行
pcr
形成和扩增以及
dpn1
处理之前，可以将环状质粒线性化
。
可选地，在一些实例中，可以合成
(
例如，化学合成等
)
整个起始
(
靶或感兴趣的基因
)
序列
。
[0324]
在一些实例中，起始材料为约
1ng/ul
或更少，例如，约
0.5ng/ul
或更少
、
约
0.1ng/ul
或更少
、
约
0.09ng/ul
或更少
、
约
0.07ng/ul
或更少
、
约
0.05ng/ul
或更少，等等
。
例如，这些方法和设备可以配置成从约
5ng
输入材料开始进行
50ul
反应
。
所述方法或设备可以包括循环约
20
个循环
(
例如，约
21
个循环
、
约
22
个循环
、
约
23
个循环
、
约
24
个循环等
)。
输出可以与待使用的模板的
ivt
的输入相匹配
。
例如，使用
3ug
模板的
50ul
反应可以使用约
20
个循环或更多
(
例如，约
21
个循环
、
约
22
个循环
、
约
23
个循环
、
约
24
个循环等
)。
在一些实例中，这可导致纯化后产生约4和约
5ug(
其中一些可用于质量控制测试和
/
或验证
)。
[0325]
令人惊讶的是，本文描述的用非常长
(
大于约
150bp)
的引物形成模板的方法可以干净地产生大量的模板，而没有任何实质性的缩短形式或转录错误，不需要显著的下游纯化和
/
或不使用多于一种限制性内切酶，显著的下游纯化和使用多于一种限制性内切酶可能使模板形成过程过于复杂，可能导致可能的污染
(
例如，来自细菌来源的酶
)。
尽管已知多
(a)
尾可以赋予
mrna
稳定性并提高翻译效率，但普遍认为使用基于
pcr/
引物的方法添加多
(a)
尾对多a区域的长度具有大约
120-mer
的上限，超过该上限的扩增异常将妨碍可靠的使用
。
例如，
scharenberg
的
us9943612b2
明确提出了生成用于
ivt
的真正长
(》200bp)
多a尾的问题，并得出结论“尽管通过
pcr
向
mrna
添加多
(a)
尾避免了额外的酶促操作，但
pcr
方法也可能带来额外的问题，诸如长度变化以及扩增异常，这可能源于不容易通过
pcr
扩增的特定基因
。pcr
还受到引物中可以包含的腺嘌呤残基数量的限制
(
至大约
120
个
)。
更重要的是，它还局限于可以通过
pcr
扩增的基因
。”[0326]
与之相比，本文描述的形成用于制备治疗性
mrna
的
ivt
模板的方法可以替代地使用非常长
(
例如，约
150mer
或更大
、
约
200mer
或更大
、
约
250mer
或更大等
)
的含多a的引物
。
[0327]
本文描述的方法
(
和用于实施它们的设备
)
可以使用合成长度的感兴趣的靶基因
(
或基因的区域
)
，其可以使用基于
pcr
的方法修饰以添加长
(》
约
150mer)
多a尾，并且在一些实例中以相对不含细菌的产物并因此无交叉污染的方式添加启动子
(
例如，
t7
启动子
)。
例如，可以以
ng
的量提供感兴趣的靶基因
。
在一些实例中，感兴趣的靶基因
(
或基因的区域
)
可以通过商业合成公司或技术合成，并且可以存在于包含该基因的质粒中；该质粒不包含多a区域，并且在一些实例中不包含用于
ivt
的启动子
。
因此，靶基因或基因的区域可以因此被称为感兴趣的合成基因
。
感兴趣的合成基因可以是患者特异性合成片段
。
如图7所示，因此该方法可以包括使用该感兴趣的合成基因和一对引物
。
在图7中，第一引物
(“t7
启动子正向引物”)
是正向引物，包含所需启动子
(
例如，
t7
启动子
)
和与患者特异性合成片段的3’
末端
中的区域相同的引物的5’
末端中的区域
。
第二
、
反向引物
(“多
t
尾反向引物”)
包括与多
t
尾反向引物的5’
末端的患者特异性合成片段的5’
末端的第二区域
(
对接区域
)
互补的区域
。
多
t
尾反向引物的剩余部分可以包括约
150
或更多个胸腺嘧啶的段
(
多
t
区域
)。
[0328]
在图7中，所述方法可以包括在微流控装置的室中将感兴趣的合成基因
(
患者特异性合成片段
)
与
t7
启动子正向引物和多
t
尾反向引物组合
。
然后可以使用该设备对该室进行温度控制，以进行热循环来形成和扩增已经添加了多a尾的患者特异性合成片段，形成如所示的模板
。
扩增之后，合成的模板然后可以在同一微流控路径装置
(
例如，芯片
)
中纯化
。
例如，在一些实例中，酶，诸如
dpn1
，可以被添加到室中和
/
或材料可以被移动到第二室以包含
dpni。
然后可以进一步处理所述材料，包括去除较小的
(
例如，小于约
600bp、
小于约
500bp、
小于约
400bp、
小于约
300bp
等
)。
然后最终模板可以被储存和
/
或使用本文所述的
ivt
程序立即
(
或在几天
、
几小时
、
几分钟内
)
用于形成治疗性
mrna。
[0329]
图7显示了第一引物和第二引物的第一实例
。
可选地，在一些实例中，第一引物可以替代为反向引物
(
例如，“t7
启动子反向引物”)
，其包括与位于患者特异性合成片段的3’
末端处或附近的第一区域互补的区域
。
第二引物可以是正向引物
(
例如，“多a尾正向引物”)
，其包括位于第二引物的3’
末端处或附近的区域，该区域与位于患者特异性合成片段的5’
末端处或附近的第二区域的序列大致相同，以及形成多a区域的长的长度
(
例如，约
150mer
或更多
)
的腺苷
。
[0330]
在一些实例中，包括启动子
(
例如，
t7
启动子
)
区域的第一引物与感兴趣的合成基因或与感兴趣的合成基因互补的多核苷酸杂交
。
[0331]
在一些实例中，感兴趣的合成基因
(“患者特异性合成片段”)
可以在载体中提供，该载体可以包含启动子
(
例如，
t7
启动子
)
和
/
或典型的短
(《50bp)
多a尾中的一个或两个
。
因此，在一些实例中，第二引物可以配置为与作为载体一部分的多a尾的一部分杂交
。
[0332]
在操作中，该设备可以控制包含试剂
(
例如，感兴趣的合成基因
、
正向和反向引物
、
聚合酶
、
和缓冲液，包括
dntp)
的室的温度
。
因此，微流控设备可以被配置为快速改变温度并保持温度以控制变性
、
退火
、
延伸等
。
聚合酶可以是不含细菌污染的具有低错误率的聚合酶，诸如
q5(
来自
new england biolabs
的“高保真聚合酶”)。
[0333]
在一些实例中，热循环可以在微流控设备的一个室或多于一个室中进行
。
可以准备该室以防止接触或表面干扰，例如，通过在添加试剂之前用材料预处理或涂覆该室
。
例如，可以包括诸如合成
(
非细菌
)
材料
(
例如蛋白质材料
)
的涂层，以便减少或防止与室壁的非特异性结合，所述室壁可以是聚合塑性材料
。
在一些实例中，室可以用重组
(
例如，合成
)
白蛋白
(
例如，分子生物学级的重组白蛋白
)
预处理
。
该材料可以通过用合成材料诸如合成蛋白进行预处理而钝化
。
[0334]
图
22a
和图
22b
示出如上所述形成的合成模板的一个非限制性工作实例
。
例如，图
22a
显示了模板样品的凝胶电泳，在该实例中，模板是萤光素酶报告基因，通过图7所示的方法向其添加了
t7
启动子和
200bp
的多a尾
。
如图
22a
所示，右侧泳道显示多核苷酸模板的预期尺寸的单个干净条带
。
起始材料为合成生成的萤光素酶报告基因
。
通过使用第一
(t7
启动子正向引物
)
和第二
(
多
t
尾反向引物
)
添加
t7
启动子和
200-mer
多a尾
。
图
22b
示出了在图
22a
示出的相同模板的毛细管电泳
。
[0335]
与更传统的细菌合成模板相比，上述制备合成
dna
模板的方法可导致显著更高的
产率和更均一的模板
。
这在图
23a-图
23c
中示出，其显示合成产生的模板
mrna
和细菌产生的模板
mrna
之间的比较，显示合成产生的模板
mrna
导致更好的尺寸分布和更高的生物活性
。
在图
23a-图
23c
中，模板是萤光素酶报告基因，类似于上面在图
22a-图
22b
中描述的
。
图
23a
显示了使用细菌合成方法形成的萤光素酶报告基因
mrna
模板的毛细管电泳结果，所述细菌合成方法例如，通过克隆到具有启动子和多a尾的载体中
。
作为比较，图
23b
显示了使用合成
pcr
技术形成的萤光素酶报告基因
mrna
模板的毛细管电泳结果，其中通过使用以上关于图7描述的引物添加
t7
启动子和多a尾
(
例如，
200-mer
多a尾
)。
在图
23b
中，所得模板具有窄得多的分布，并显示出具有可比或更高产率的更均一的模板
。
[0336]
图
23c
显示了从图
23a
和图
23b
所示模板合成的两种
mrna
转染后6小时小鼠树突状细胞系
(jawsii)
中萤光素酶生物活性之间的比较
。
如图
23c
所示，合成模板
(
显示在图
23b
中
)
具有比细菌模板高得多的表达
(
平均发光
)。
[0337]
ivt
反应
[0338]
该过程的下一步可以是产生
mrna
的
ivt
反应
。
此过程可以在相同或不同的微流控路径装置
(
例如，在一些实例中，在
ivt
微流控路径装置的
)
内进行，所述微流控路径装置可以容纳在如前所述的微流控路径装置控制系统中
。
阐明
ivt
微流控路径装置内的主要操作和子隔室的高水平
mrna
制备过程在图
11
中进行了描述
。
[0339]
ivt
反应可以包括将
dna
模板与
t7
聚合酶
、
核苷酸和加帽试剂组合，并在受控条件下孵育该反应以产生加帽
mrna
分子
。ivt
反应可以在微流控路径装置
(
例如，
ivt
微流控路径装置
)
的反应室内发生，并且处理参数
(
诸如温度
)、
混合和试剂添加
(
在反应开始时和整个反应过程中
)
可以控制以优化水平
。
如上所述，该过程可以由控制器驱动
。
缓冲液和溶液可以经由微阀阵列递送，并且可以使用预设程序控制体积，该程序可以对每种
mrna
药物物质优化的方案是特定的
。
[0340]
在
ivt
反应之后，可以进行
dna
酶处理来降解模板
dna。
该操作可以在
ivt
反应室
(ivt
反应器的一部分
)
内实施，并且参数
(
诸如稀释率
、
酶
/
缓冲液浓度
、
温度
)
和混合可以控制以优化水平
。
该过程可以自动执行并由监控相机记录
。
[0341]
ivt
纯化
[0342]
可以纯化
dna
酶处理的
mrna
以去除杂质和副产物
。
特别地，降解的模板
、
任何未反应的核苷酸
、
酶
(t7
聚合酶和
dna
酶
)
和
dsrna
影响药物物质的质量和免疫原性
。
对于纯化，可以使用两步固相可逆固定程序，使用有不同表面化学的支持物
。
第一步可以涉及使用纤维素膜在精确控制的结合条件下选择性地捕获
dsrna
，并将未结合的级分洗脱到第二纯化室中
。
第二纯化操作可以使用约1μm和约2μm的羧基包被的顺磁珠，该磁珠选择性地捕获长度大于约
500bp
的
mrna。
然后可以实施多次洗涤以去除未结合的物质，包括核苷酸
、
酶和降解的模板
。
然后可以在
usp
级水中洗脱纯
mrna。
基于在线微流控的纯化可实现完全集成的工作流程，无需将材料暴露于大气，避免使用基于传统
hplc
的方法使用的有毒流动相，并显著减少人工干预
。
[0343]
如上所述，通常，这些方法和设备是无菌方法和设备，它们允许制备治疗性
mrna
或用于制备治疗性
mrna
的任何或所有组分，而不暴露于外部大气和
/
或可能的
rna
酶来源和
/
或其他方面可能必需的污染组分
。
例如，如本文所述，这些方法可以被实施而不添加细菌来源的多核苷酸
(
例如，在模板
dna
中
)
和
/
或不添加在经由
hplc
或其他传统技术纯化时可能存
在的组分，诸如增塑剂
。
本文描述了用于在微流控路径装置内进行纯化的设备和方法
(
例如，使用纯纤维素
)。
[0344]
纯化的
mrna
可使用
a260 nm uv
吸收或使用
mrna
特异性荧光染料的荧光来定量
。
可以实施另外的
mrna qc
操作以确认纯度和身份
。
整个
mrna
制备过程可以在微流控路径装置控制系统内进行，并且试剂添加和输出可以经由上述封闭路径微流控路径装置控制系统执行，例如，使用无菌技术
。
最后，可以进行过滤，例如通过
0.22
μm过滤器
。
如果最终产物符合以下接受标准，则可将其视为低生物负载药物物质并释放用于药物产物配制：产率
(
例如，通过
uv vis/
荧光测定，
》
约
6.5ug mrna/u1
起始
ivt)、
身份
(
例如，通过测序，与靶
100
％一致同源性
)、
完整性
(
例如，测序，
《1
％突变率
)、
纯度
(
例如，
ce
，
》
约
95
％的产物在单个条带中
)、
加帽效率
(hplc
，
》
约
95
％加帽的
mrna)、
残留
dsrna(
例如，
fret/
免疫印迹，
《
约
0.02
％
(1ng))、
细菌组分
(
例如，
hcp elisa(
用于
dna&
蛋白质
)、《x)、
细菌组分
(
例如，
hc-dna
，
《x)、
内毒素
(
例如，
lal
测试，
《
约
0.2eu/ml)、
生物负载
(
例如，微生物限度测试
((mlt))
等
。
[0345]
将
mrna
配制成
anp
[0346]
纯化的
mrna
可以与递送组分组合以形成纳米颗粒制剂
。
该过程在图
12
中描述
。
例如，
mrna
货物
(
治疗性
mrna
，本文也称为药物物质
)
的水性溶液可以在配制微流控路径装置内的微流控混合结构中与递送媒介物的乙醇溶液组合
。
然后，该材料可以经历两个配制后处理操作，该操作涉及首先进行芯片上纯化过程以交换配制产物中的缓冲组分，然后进行浓缩操作以减少药物产物的体积以匹配规格
。
在基于微流控路径装置的制备装置上实施这些过程可以导致对配制过程的高度控制，而无需人为干预并且人为错误的可能性最小
。
[0347]
通常，本文所述的制备方法的组成部分
(
包括例如合成模板
、
实施
ivt
以生成
mrna、
纯化
mrna、
将
mrna
与递送媒介物组合以形成治疗性组合物
、
透析治疗性组合物和
/
或浓缩治疗性组合物
)
可以在单个微流控路径装置和
/
或多于一个微流控路径装置上实施，如图
3a-图
3c
所示，如上所述
。
因此，流控路径可以是连续的或部分连续的
(
例如，在制备过程的组成部分上连续，诸如以下一项或更多项：模板形成
、ivt、
纯化
mrna、
将
mrna
与递送媒介物组合以形成治疗性组合物
、
透析治疗性组合物和
/
或浓缩治疗性组合物
)。
在所有情况下，可以使用相同的控制器设备，或者可以使用不同的控制器设备
。
这些组成部分中的每一个的产物可以储存在控制器备中的流体小瓶
(
例如，贮库
)
中并且转移到新的或后续的微流控路径装置
。
因此，在这些方法和装置的任一种中，可以保护产物免于大气暴露
。
[0348]
如以上提及的，在一些实例中，基于类肽的脂质制剂可以用作药物媒介物，其可以将阳离子基团和脂质部分两者掺入到
n-取代的肽
(
即类肽
)
骨架上
。
递送媒介物组分可以是单分散的
、
完全可表征的化学实体，其可以通过常规手段获得
。
[0349]
受控和一致的配制过程对于保持
mrna anp
制剂中小而均匀的粒度可能至关重要
。
用本文所述的方法和设备，递送媒介物组分与
mrna
以受控比例快速混合
。dv
组分暴露于水性溶液以及阳离子
(+)
脂质和阴离子
(-)mrna
之间的相互作用可引发颗粒形成
。
该过程可以通过使用本文所述的微流控路径装置来执行
(
以控制粒度和均匀性
)。mrna
可以溶解在酸性缓冲液
(ph 3-5)
中，这可能有助于确保递送媒介物上负责其阳离子电荷的碱性官能团
(
诸如胺
)
的完全质子化
。
递送媒介物可以溶解在与水混溶的有机溶剂
(
通常是乙醇
)
中，这有助于在暴露于水性货物溶液时形成纳米尺寸的颗粒
。
混合后立即用中性缓冲液稳定溶液
ph。
所得制剂可在约
4℃
储存数周而无明显功能损失
。
可选地，配制过程可以适时和在护理点进
7.4+/-0.2)、
效力
(
例如，生物测定
/elisa
，
x ec
50
)。
实施例
[0357]
如以上提及的，本文描述的方法和设备可用于制备
mrna
治疗，包括例如对皮肤
t
细胞淋巴瘤
(ctcl)
的治疗
。
成熟的
t
细胞表达独特的
tcr
，该
tcr
由两种蛋白质组合形成，
αβ
t
细胞中的
α
链和
β
链或
δγ
t
细胞中的
δ
链和
γ
链
。
每种
tcr
链由独特的重组事件形成，通过该重组事件，通过称为
v(d)j
重组的过程使编码基因的
v、(d)
和j区域的许多可能外显子中的任一个在一起
。
这些
v(d)j
重组事件是准随机的，并且可以产生大量组合，从而导致
tcr
的大量多样性
。
此外，在
v(d)j
重组过程期间，核苷酸的随机添加或缺失可发生在外显子连接处，导致生成另外的
tcr
多样性，其共同生成个体的
tcr
库
。
据估计，通过下一代技术深度测序的健康个体在任何给定时间点时外周血中都含有大约
1-5x106种不同的
tcr
，并且在没有感染的情况下，任何单个
tcr
通常占总群体的不超过5％
。t
细胞淋巴瘤源于单个恶性
t
细胞的克隆扩增，导致肿瘤在淋巴样组织
(
脾脏或淋巴结
)
或其他组织
(
诸如皮肤
、
肝脏或胃肠道
)
中发展
。
[0358]
已经开发了替代方法来对个体的
tcr
库进行测序，所述
tcr
库也用于诊断和鉴定
t
细胞淋巴瘤患者中的克隆扩增的
tcr。
一种常用的方法是使用精心开发的
pcr
引物组对
tcr
β
或
δ
基因组重排进行测序，其中扩增偏倚得到控制
。
因此，可以实施多重
pcr
以进行靶富集，然后进行下一代测序
。
这样的方法
(
例如来自
adaptive biotechnologies
的
immunoseq
测定
)
已得到验证，并在临床中用作诊断工具和用于最小残留疾病定量
。
替代方法是直接对
cdna
进行深度测序，无需靶富集，以鉴定显著过度呈现的
tcr
链
。
淋巴瘤
tcr
的身份通常称为淋巴瘤独特型或克隆型
。
[0359]
为了确定独特型，可以收集活检并样品且可以对样品进行测序以确定淋巴瘤独特型的身份
。
有关患者特异性独特型的数字数据可用于患者特异性疫苗设计
。
[0360]
mrna
疫苗的设计
[0361]
基于
mrna
的患者特异性癌症疫苗的生产可以从设计与个性化靶肽相对应的
dna
序列开始，该靶肽能够通过抗原呈递细胞
(apc)
产生特异性且免疫学有效的表位呈递
。
为了实现这点，第一操作可以包括从独特型
tcr
链
(
αβ
或
δγ
)
中提取互补决定区
(cdr)。cdr3
区域可以通过对典型
tcr
实施序列比对来提取
。cdr
是
tcr
序列的高度可变部分，它介导与抗原-mhc
复合物的结合
。
特别是，跨越
v(d)j
和c区域之间连接部的
cdr3
区域具有最高的可变性，并且代表了真正独特的蛋白质片段，该蛋白质片段应当只存在于淋巴瘤细胞中
。
因此，例如，在c末端和n末端两端延伸
10
个氨基酸的
cdr3
区构成疫苗肽片段，如上文对图8所述的
。
[0362]
由于
tcr
具有两条链
(
α
和
β
)
，因此每位患者有2个
cdr3
，尽管在少数情况下只会鉴定出一个
cdr3。
[0363]
鉴定出最终的疫苗肽氨基酸序列后，设计过程可以包括密码子优化以得到
dna
序列，该序列可以：(i)高度转录和高度翻译，导致良好的蛋白质表达，
(ii)
适合于
dna
合成，
(iii)
包括模板生成操作所需的衔接子序列，和
(iv)
排除序列基序
(
诸如限制性酶
)
，否则其将干扰模板生成过程
。
可以实施密码子优化，例如，以便平衡序列
gc
，并去除序列重复
、
内部启动子序列
、
终止序列
、
剪接序列
、
重组序列和内部核糖体进入位点
(ires)。
此外，密码子使用可以调整为在高表达的人类基因中观察到的密码子
。
可以使用的密码子优化过程的一个
实例的示意图显示在图
10
中
。
[0364]
序列设计过程完成后，优化的序列可以合成为线性
dna
分子
。
可以如上所述准备用于
ivt
的模板
。
例如，在经由
ivt
合成
mrna
之前，可以生成能够
ivt
的双链
dna
模板
。dna
模板可以包含(i)蛋白质编码序列
(
或
cds)
，定义为对应于待产生的靶患者特异性肽的一组密码子，
(ii)
包括5’
非翻译区
(5’utr)
和3’
utr
的非编码序列，
(iii)
保护
mrna
免受核酸外切酶活性影响的多a序列和
(iv)
募集
rna
聚合酶的启动子序列，所述
rna
聚合酶将
dna
模板转录成
mrna
，如上文图
6a
中所述
。
[0365]
因此，作为合成的线性
dna
的患者特异性肽编码序列
(
例如，来自
dna
合成供应商
)
可以与
ivt
所需的通用功能元件配对，作为模板生成过程
。
[0366]
本文描述的基于微流控路径装置的方法可以包括模板生成，并且可以比目前实施的基于细菌培养的方法快得多和更有效，所述基于细菌培养的方法可能需要～4天或更长时间，可能导致可变长度的多a尾
(
由于细菌重组过程
)
，并可能具有细菌蛋白质
、
细菌
dna
和内毒素残留的风险
。
相比之下，本文所述的方法和装置可在单日
(
～
12
小时
)
内实施，并可以导致一致的多a尾
(
大于
300bp)
，并且可以不涉及与宿主核酸或宿主细胞蛋白质的任何接触
。
最终的双链
dna
可以由化学产生的核苷酸制成，因此可以认为是合成来源的
。
[0367]
如上所述，这些方法可以包括四个步骤：
(i)goi
与
tifc
的连接，以及通过核酸外切酶处理去除未连接的材料，
(ii)
经由称为多重置换扩增
(mda)
的技术环状扩增连接的产物，
(iii)
使用
iis
型限制性内切酶消化将扩增产物线性化，
(iv)
芯片上纯化程序以去除杂质
。
作为最后的操作，纯化的模板可通过
0.22
μm过滤器过滤
。
为了在用于
ivt
反应之前确保所得材料的质量，可以进行许多分析测试，其包括测试产率
(
例如，在
1ug/ul
时
》
约
50ug、260/280nm
比
》
约
1.8)、
身份
(
例如，与靶
100
％一致同源性
)、
完整性
(
例如，
《
约1％突变率
)、
纯度
(
例如，通过
ce
，
》
约
95
％的产物在单个条带中
)
和内毒素
(
例如，
《
约
0.2eu/ml)。
[0368]
因此，药物产物可以包括以
1:1
的比混合的编码患者特异性
tcr
肽的
mrna
以及作为佐剂的
cpg。
核酸混合物可以包封到
200nm anp
中，其用于保护
mrna
免受
rna
酶的降解，并且也作为促进剂起作用，用于其细胞摄取和细胞质释放
。
活性成分的作用机制可能需要细胞质中完整
mrna
的生物可得性，细胞质是翻译过程发生的地方
。anp
包含核酸组分
、
阳离子胺官能化类肽
ntx-dv-0024
和
2wt
％
peg-脂质，
mrna:dv
的总体比为
5:1w/w。anp
的尺寸分布可以是单峰的，z平均粒度为约
200nm。anp
可以悬浮在目标
ph 7.4
的磷酸盐缓冲盐水
(0.144mg/ml
磷酸二氢钾
、9.0mg/ml
氯化钠和
0.795mg/ml
磷酸氢二钠
)
中
。
所有制剂赋形剂通常被认为是安全的
。
最终产物可以是无菌的和生理等渗的，重量摩尔渗透压浓度
(osmolality)
为
295
±
20mosm/kg。
[0369]
尽管
mrna
本身具有吸引人的安全性概况，但是例如亚可见颗粒
、
宿主细胞蛋白
(hcp)、
宿主细胞
dna、
处理相关杂质
、
生物负载
、
细菌内毒素水平
、
无菌性以及可浸出物和可提取物的水平是主要安全相关的，并且必须根据既定的安全概况和行业标准进行最小化和控制
。
此外，将用于制备
ivt mrna
的残留模板
dna、
双链
rna
和酶的存在消除或最小化可以确保产物安全且有效
。
[0370]
如提及的，本文所述的方法和装置可以包括颗粒物质的定量分析，例如，通过一种或更多种程序，诸如光阻法颗粒计数测试和
/
或显微颗粒计数测试
。
可能有必要通过光阻法颗粒计数测试，接着进行显微颗粒计数测试来测试某些制剂，以得出符合要求的最终结论
。
由于纳米颗粒制剂因为存在于注射液中的液滴和
/
或颗粒集合体的光散射而本质上是不透明的，因此过滤器的过滤和随后的显微分析可用于颗粒物质分析
。
可以使用调整到
100
±
10
放大率的光学显微镜，它允许可视化小至约1μm的颗粒，并且该方法中使用的过滤器的标称孔经可以高至约
1.0
μm，在
100nm
至
250nm
范围内的药物产物纳米颗粒不会干扰颗粒物检测
。
[0371]
本文所述的模板生成方法不涉及使用细菌或任何其他活微生物，而是依赖于使用酶促反应和化学制备的核苷酸，因此模板和
mrna
产物是完全合成的
。
[0372]
关于成品药物产物中残留的宿主细胞
dna
，本文所述的方法和设备在最终产物剂量中可以具有少于约
10ng/
剂和约
200
个碱基对
。
除了使过程相关的杂质的存在最小化之外，还可以通过制备过程
、
制剂开发和优化以及本文所述的适当储存条件的鉴定来控制与产物相关的杂质
。
尽管
ivt mrna
产物旨在尽快生产和施用，但其稳定性概况可以满足定义的接受标准，至少直到施用
。
在冷冻条件下，维持本文所述治疗剂的足够稳定性的持续时间可以是至少约
30
天
。
[0373]
ivt mrna
进入细胞质后，其药理学受调控天然
mrna
稳定性和翻译的相同细胞机制控制
。
因此，
ivt mrna
效力在很大程度上取决于细胞质的生物利用度，并且重点应放在开发产物上，以使细胞摄取最大化
。
[0374]
本文所述的储存容器
(
例如贮库
)
通常可以保护产物免受外部环境的影响
(
如果适用的话，包括氧气进入和防止光降解
)、
可消毒并确保在整个保质期内保持无菌性
、
与产物制剂相容，并且在储存过程中对产物的可浸出化学物质贡献极少甚至没有
。
例如，贮库可以包括有卤化丁基橡胶塞的i型硼硅酸盐玻璃小瓶，提供适当的产物保护，并确保在产物的整个保质期内保持无菌性
、
安全和功效
。
[0375]
作为非限制性的工作实例，实施了初步筛选，其最大化
mrna
表达
、
最小化对细胞存活力的影响并实现有利的生物分布概况
。
对于这些实验，选择了基于萤火虫萤光素酶
(fluc)
表达的生物发光测定
。
该测定允许以高通量方式定量测量通过每种递送媒介物候选物的
mrna
摄取的基因表达
。
对于初步评估，通过固相类肽合成，合成了
36
种氨基脂化类肽用于初步评估，并通过冻干和
/
或沉淀进行分离
。
这些候选材料在其阳离子和脂质结构域中都含有结构实例
。
这
36
种材料以不同的比与
fluc mrna
以及2％
(w/w)
的脂质锚定
peg(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)
组合
。
用所得制剂处理几种细胞系，包括
hela、hepg2
和
jawsii
树突细胞，导致6种先导候选物的向下选择
。
[0376]
静脉内
(iv)、
皮下
(sc)
和肌肉内
(im)
注射后，通过
balb/c
小鼠中的
fluc
表达来量化递送媒介物候选物的体内
mrna
表达和生物分布
。
基于表达
(
体外和体内
)
和生物分布
(
体内
)
，选择
ntx-dv-0024
作为候选物
。
合成了编码卵清蛋白的
mrna
，并作为模型疫苗评估
。
卵清蛋白在疫苗接种的背景中得到了非常充分的研究，并且用于追踪表位呈递和
t
细胞应答的试剂是商业可获得的，这使其成为概念验证研究的理想候选物
。
使用
jawsii
鼠
(c57bl/6)
树突细胞在体外模型上对如本文所述产生的
ova mrna
进行初步评估
。
简而言之，使用商业转染试剂
(
例如
lipofectamine2000
tm
)
用
ova mrna
候选物转染
jawsii
细胞
24
小时，在该时间后使用针对与
siinfekl
表位结合的
mhc-i
的荧光抗体对细胞进行染色
。
染色群体的平均荧光强度
(mfi)
代表总体抗原呈递的量度
。
这在图
15
中示意性地描述
。
[0377]
使用该测定，针对商业购买的材料评估如本文所述产生的
mrna。
在这种情况下，与商业对照相比，所产生的
mrna
导致在
mhc-i
上的
siinfekl
呈递水平高出
42
％
。
还展示了装置
上
mrna
合成的可重复性，5批
ova mrna(ntx-rna-0184)
导致了相似水平的
siinfekl+jawsii
细胞
。
[0378]
在鼠体内实验中，将
mrna
候选物类似地作为疫苗候选物评估
。
将
c57bl/6
小鼠注射
(iv)
商业或所产生的
mrna(
由本文所述的微流控路径装置产生
)
和递送媒介物
。
注射后7天，分离外周血并使用对识别
ova
表位的
t
细胞特异的荧光
mhc-i
四聚体染色
。
然后通过流式细胞术对
ova
特异性
cd8+t
细胞的比例进行定量
。
在这个实验中，如前文，所产生的
mrna
导致外周血中
ova
特异性
t
细胞的比例相对于商业对照增加了
50
％，表明这些分子作为疫苗候选物的强度
。
[0379]
基于
mrna
的疫苗
(
如本文所述产生
)
的体内功效的首次展示是在鼠的
、
表达
ova
的
eg.7、
同基因
t
细胞淋巴瘤的模型中
。
该模型是适应症淋巴瘤的生理相关动物模型，并且与
ntx-0565
的免疫疗法作用机制相关
。
同基因小鼠模型是来自相同近交背景品系的鼠宿主中的永生化小鼠癌细胞系的移植物
(
同种移植物
)。
同基因宿主鼠背景使基于免疫疗法的药物能够从宿主募集功能性抗肿瘤免疫应答，这对于研究免疫疗法是必要的
。
同基因模型特征在于完全有能力的鼠免疫
、
免疫细胞浸润到肿瘤中的多样性
、
全面的小鼠肿瘤
、
免疫细胞和基质界面，以及易于进行包括遗传和蛋白质表达历史在内的药理学研究的肿瘤同步
。
[0380]
使用鼠
e.g7-ova
淋巴瘤肿瘤模型
。e.g7-ova
肿瘤细胞系是
el-4
淋巴瘤衍生系，其被工程化改造以携带1个基因组拷贝的
ova
抗原，该
ova
抗原持续且稳健地表达
。
这种方法实现对基于外源
ova
的抗原的高度特异性的免疫反应，使这些肿瘤细胞对研究癌症疫苗是理想的
。
文献中已经展示了使用
dna
疫苗
、
基于细胞的疫苗和
sirna
疫苗的肿瘤生长抑制
。
对于第一个功效研究，疫苗组分是编码
ova
抗原的
mrna
，并且研究设计是根据关于该动物模型与基于
mrna
的疫苗的先前文献建模的
。
使用测试物品递送媒介物
——
磷酸盐缓冲盐水并行运行随机并发的阴性对照
。
动物是年龄和性别匹配的，并且分组随机分配以确保肿瘤尺寸和体重的平均分布
。
测试物品是不知情的，以便使体内研究管理者消除偏见
。
样品分析同样是不知情的以消除分析者的偏见
。
在开始之前，提案中预先定义了接受进入研究的纳入和排除标准
。
在研究开始之前，研究提案中预先定义了终点
、
观察频率和时间表
。
预定义安乐死标准和动物护理干预
。
[0381]
该初步研究展示了本文所述的
mrna
疫苗具有统计学上高度显著的治疗功效
(
图
16a-图
16d)。
当
ova mrna
疫苗静脉内递送至第2组时，该组在肿瘤植入后第
14
天开始显示出统计学上的极端显著性
(***
，
p《0.0005
，第
14
天，相对于阴性对照，经由多重
dunnett
比较检验
)。
在第
21
天，第2组的肿瘤体积为
797mm3，相对于第1组对照中的肿瘤体积
2000mm3(**
，
p《0.005
，如第
21
天通过多重
dunnett
比较检验测量的
)。
这意味着，当动物接受如本文所述制备的
mrna
疫苗
(iv)
时，
61.42
％的肿瘤生长抑制
。
在植入后第
21
天，当阴性对照组
(
第1组
)
达到预定终点肿瘤体积
(2,000mm3)
时，计算肿瘤生长抑制
(tgi
％
)。
肿瘤生长抑制
(
％
)
由下式定义：
tgi(
％
)
＝
(tv
对照组-tv
治疗组
)/tv
对照
x 100
并且是相对于肿瘤植入后第
21
天的阴性对照，此时所有对照动物都已达到终点肿瘤体积
。
这种肿瘤生长抑制转化为
mrna
疫苗接种组的存活率的统计学上显著增加，其中第2组即
mrna
疫苗接种的动物到终点的时间为
25
天，而第1组即媒介物处理的动物到终点的中位时间为
23
天
(**p《0.01
，通过相对于对照的对数秩检验测量
)。
根据体重和实验室测试结果，在给定剂量未观察到可观察到的毒性
。
在图
16a-图
16c
中，制备的基于
mrna
的疫苗在鼠淋巴瘤
e.g7
同基因模型中显示出体内功效
。
如
在个体动物曲线
(
图
16a、
图
16b)
和每组的平均肿瘤体积
(
图
16c)
中观察到的，肿瘤生长被抑制了
61.4
％
(*p《0.01)。
这种肿瘤生长抑制转化为
mrna
疫苗接种组的存活率的统计学显著增加
(
图
16d)(**
，
p《0.01)。
[0382]
为了补充上述物理测量，还在一周的时间段内使用报告基因表达对储存的药物产物制剂实施体内测试
。
在该实验中，萤火虫萤光素酶
mrna
和
ntx-dv-0028
的制剂是在
1)
注射前7天
、2)
注射前3天和
3)
注射前1小时配制的
。
配制后，产物在
4℃
储存直至施用
。
然后经由尾静脉注射将所有三种材料以
0.25mg/kg
的剂量施用于
balb/c
小鼠
。
注射后8小时，测量全身生物发光，并且所得图像显示在图
17a
中，并在图
17b
中定量
(
显示了注射储存的
mrna
制剂后全身萤光素酶表达的定量光子通量
)。
在此1周的储存实验过程中，测量的生物发光没有实质性损失
。
储存3天和7天的两种材料均在注射前立即配制的材料的误差内
。
此功能稳定性数据支持上述粒度稳定性数据，强烈表明本文所述的
mrna
制剂在
4℃
稳定储存至少1周
。
[0383]
通常，如本文所述的
mrna
药物物质与递送媒介物分子配制成的
anp
可具有大约
200nm
的尺寸，从而排除了在最终配制操作结束时使用
0.2
微米无菌过滤器以防止损失
。
因此，可以在整个制备过程中加入多于一个有条理的过滤操作，以减轻无菌风险，而避免破坏最终的
anp
药物产物
。
图
18
示意性显示了可以应用过滤的不同时间
。
在
ivt
反应之前，纯化的模板和单独的
ivt
试剂
(
包括
dntp、
酶等
)
都可以通过
0.22um
过滤器过滤
(
图
18a、
图
18b)。
在
ivt
微流控路径装置中完成
mrna
生产后，所有输入材料将在最终配制过程
(
在其中形成
anp)
之前过滤
。
这些包括药物物质
(mrna
，例如图
18c)、
佐剂
(cpg)、
两亲性类肽递送媒介物组分和缓冲液
(
图，例如图
18d)、dmg-peg2000
递送媒介物组分
(
例如，图
18d)
和缓冲液
(
例如，图
18e)。
除了输入材料的
0.22
微米过滤之外，最终的两亲性纳米颗粒药物产物可以通过
0.45
微米过滤器过滤以去除任何微粒或聚集材料
(
图
18f)。
这种更大的过滤操作可以有助于防止
anp
的破坏并保持最终药物产物的功效
。
[0384]
为了补充上述谨慎的过滤操作，本文所述的微流控路径装置控制系统可以设计为使用密封的无菌流控路径操作，这将确保最终药物产物的安全性和无菌性，例如，如本文所述，使用一个或更多密封的微流控路径装置，这些装置执行药物产物制备所需的操作，包括模板制备
、
体外转录
(ivt)、
用递送媒介物配制成两亲性纳米颗粒
(anp)、
以及缓冲液交换和浓缩操作
。
这些微流控路径装置可以驻留在温度受控的5级层流罩内，该罩进一步容纳在例如
6x6
的7级洁净室中
。mrna
反应器可以是提供保护而不受人类和外部环境影响的装置的自动化部件
。
可以使用一次性无菌无核酸酶管将试剂和产物流体路径从加压的无菌容器递送到反应器的核心
。
最终产物制剂和药物产物可以在如上所述的多层微流控路径装置中在完全封闭的系统中制备
。
[0385]
可渗透插入物
[0386]
本文所述的任何微流控路径装置可以包括一个或更多个用于处理治疗性材料溶液
(
或其中正在形成治疗性材料的溶液
)
的可渗透插入物
。
可渗透插入物可插入微流控路径装置中的室的流体接触侧中
。
并且可以配置成使得进入或通过室的流体接触侧的流体必须通过可渗透插入物，从而被可渗透插入物修饰
。
可以使用任何合适的可渗透插入物
。
例如，可渗透插入物可以包括被配置为去除不需要的材料的材料；在一些实例中，可渗透插入物包括纤维素材料，其被配置为从单链
rna(ssrna)
的治疗性溶液中去除双链
rna(dsrna)。
[0387]
图
19a
显示了微流控路径装置
1900
的一个实例，该装置包括在室
1957
的流体接触
侧内的可渗透插入物
1969。
在图
19a
中，微流控路径装置
1900
可以包括至少一对室
1953、1957、1957’，每个室可以包括流体接触侧
1917、
压力
(
例如，气体
)
侧
1919、
流体连接
、
压力连接和流体
/
压力管线，其可以在微流控路径装置的厚度中形成
。
在一些实例中，室是成对的，并且这对室中的每个室可以通过流体连接器
1955
彼此连接
。
流体连接器
1955
可以与施加到室压力侧的正压和
/
或负压配合使用，以驱动两个室之间的液体侧中的液体，从而在每个室中混合该液体
。
室可以由弹性材料
(
例如，弹性层或膜
)
分叉，并且在室的固定体积内偏转弹性材料可以驱动液体内的任何液体进出室的流体接触侧
(
例如，在两个室之间
)。
[0388]
微流控路径装置
1900
可以包括多于一对的室，其中任何一个都可以包括可渗透插入物
。
每对室可用于不同的过程
。
例如，第一对室
1953
可用于
rna
的合成
。
第二对室
1957、1957’可用于纯化合成的多核苷酸
。
在向各个室的压力接收侧
1919
施加压力并打开第一对室
1953
和第二对室
1957
之间的阀
1959
时，可以将流体从第一对室
1953
驱动到第二对室
。
阀室
1959
可以由在两对室之间的连接通道内的弹性层
1907
形成
。
[0389]
如图
19a
和图
19b
所示的微流控路径装置
1900
可以具有多于一个压力端口
1943
和流体端口
1923、1923’。
多于一个压力端口和流体端口可以邻近微流控路径装置的外围设置，并且配置为连接到流体接口组件
109
，如上所述
。
[0390]
端口
(
例如，密封阀
)
可以由弹性层沿连接通道
1939(
压力通道或流体通道
)
的长度形成，如图
19a
所示，对于阀
1961
，它可以控制从流体端口
1923
驱动的试剂的递送时间，但是当与一个或更多个类似构造的阀串联放置时，也可以允许计量到装置的室的试剂递送
。
例如，在图
19a
中，显示了三个阀室
(
下面更详细地描述
)
；这三个阀中的第一个可以用作蠕动泵，而中间阀可以是计量较小的计量室
(
例如，具有计量体积约为约
10nl、
约
20nl、
约
25nl、
约
50nl、
约
75nl、
约
100nl
等
)。
通道的尺寸，并且特别是连接到通道的室的尺寸
)
可以计量出沿流体连接通道
1939、1921
分配并递送到连接到流体连接通道
1939、1921
的室
1953
中的体积
。
在一些实例中，计量体积可以小至
50nl。
可以引入约
100nl、
约1微升
、
约5微升或更多的计量体积
。
可以预先选择多种阀尺寸以并入到微流控路径装置
1900
中，并且可以通过用户选择将试剂连接到适当的计量尺寸
。
[0391]
另外，一个以上的阀体
1961
可以包括在沿着流体连接通道
1939
的一排中
。
一系列阀
1961
可以作为蠕动泵起作用来移动流体，其包括
(
但不限于
)
粘性流体
。
发挥流体的蠕动泵功能的能力通常对于移动流体可能具有特别的优势，流体可以是粘性的或含有悬浮颗粒
(
诸如纯化或捕获珠
)
的
。
[0392]
如所提及的，微流控路径装置
1900
还可以包括递送或输出库或贮库
1963。
在图
19a
中，可以与上述室构造类似地形成预选体积，或者根据需要可以仅含有计量侧
。
在任一种情况下，可以使用阀来计量进入库
1963
的所需体积
。
阀
1965
可以控制从库
1963
递送流体
。
如果需要更大的体积，则可以重复递送
。
可选地，如果库
1963
被预先选择为输出库，则阀
1965
可以打开，并从室
1957
递送流体，而保持阀
1967
关闭，这仅允许将测量体积的流体输出到库
1963。
该流体然后可以输出到试剂储存框上的流体小瓶中，以进行进一步处理或测试
。
在一些实例中，室
、
库或贮库
(
例如，
1963)
可以配置为由例如三个阀结构
(1967、1965、1967)
形成的1μ
l
泵的计量部分
。
室可配置为用于例如从混合室
1957
输出废物
。
[0393]
微流控路径装置
1900
可以是密封路径构造
。
当连接流体小瓶
、
流体管线和微流控路径装置时，可以在没有材料进或出系统的任何交换，并且特别是进
/
出用于处理的微流控
路径装置的流控路径的情况下实施设备的操作，包括合成多核苷酸
(rna)
并准备将其用于生物递送
(
作为治疗剂，诸如药物
、
疫苗等
)。
因此，整个系统可以作为封闭路径运行，和
/
或单独的微流控路径装置可以在系统中作为封闭路径运行
(
免受大气影响
)。
[0394]
通常，这些微流控路径装置可以包括在室或通道的流体侧
1917
内并入一个或更多个可渗透插入物
1969。
可渗透插入物可以配置为从室或通道中的流体混合物中吸收选定的部分
(
例如，选定的材料
)。
吸收的材料可以是从溶液中纯化出来的不想要的材料，或者它可能是从溶液中移出以稍后洗脱和进一步处理的所需材料
。
在一个实例中，插入物的可渗透材料可以包括纤维素材料，其可以选择性地从混合物中吸收双链
mrna。
纤维素材料可以仅插入一对室中的一个室中，使得在混合流体或使流体通过第一室中的可渗透插入物时，可以有效地从流体混合物中去除
dsrna
，然后可以将流体混合物转移到进一步下游的另一对室中以供进一步处理或输出
。
[0395]
微流控装置
1900
的一些实例还可以包括室内的浓缩器，浓缩器可以设置在第二板的厚度内并且可以与诸如
1949
的出口通道流体连通
。
可以通过驱除多余的流体介质来浓缩多核苷酸，以及从微流控路径装置
1900
输出浓缩的多核苷酸混合物以供进一步处理或使用
。
在一些实例中，浓缩器可以是透析室
。
例如，透析膜可以存在于微流控路径装置的板内或板之间
。
[0396]
微流控路径装置
1900
可以由对可见光和
/
或紫外光至少基本上半透明的材料形成
。
基本上半透明意指与半透明材料相比，至少约
90
％的光透过该材料
。
在一些实例中，微流控路径装置
1900
可以由对可见光和
/
或紫外光基本透明的材料形成
。
基本上透明意指与完全透明的材料相比，至少
90
％的光透过该材料
。
[0397]
微流控路径装置可以由两个或更多个彼此层叠的板形成，在板之间形成室和
/
或通道；弹性材料可以夹在第一板和第二板之间
。
第一板和
/
或第二板可以由刚性材料形成
。
板可以由相同的材料或不同的材料形成
。
例如，刚性材料可以是聚合物或玻璃
。
聚合物或玻璃可以是生物相容的，例如，不浸出对活细胞有毒性的任何单体或可溶性小分子
。
可以使用任何合适的生物相容性聚合物，包括医用级聚碳酸酯-氨基甲酸酯
、
硅酮聚碳酸酯氨基甲酸酯
、
聚醚氨基甲酸酯等
。
在一些实例中，聚合物可以是环烯烃共聚物
。
[0398]
图
19b
显示了通过微流控路径装置的一部分的截面，其显示了室
1920
的流体接触侧
1917
内的可渗透插入物
1969
，室
1920
被弹性材料
1907
分叉成流体接触侧和压力接收侧
1919。
因此，微流控路径装置可以配置为包含两个更刚性的层
1903、1905
的多层结构，其中柔性膜
1907
夹在两个脊状层之间
。
图
19b
显示了穿过具有多于一个层的微流控路径装置的一个实例的截面图
(
横跨微流控路径装置的平面
)
的一部分，所述多于一个层形成用于处理如本文所述的治疗剂的反应器
。
反应器可以包括由多于一个层形成的密封件
、
通道
、
阀和室，该室包括泵送室
。
例如，微流控路径装置可以由两个或更多个刚性或半刚性的板
1903、1905
和至少一个弹性层
1907
形成
。
弹性层
1907
可以是不透液体的弹性材料片
。
弹性层可以稍微透气，或者可以处理为或多或少透气，其包括在各个区域
。
尽管可以使用单个连续的弹性材料片，但在一些实例中可以使用多于一个弹性材料片，或者
‘
片’可以由多于一个片的部分形成
。
这些层和弹性片可以层压在一起
。
通常，用于容纳
、
阀调和
/
或泵送流体的室可以在弹性层任一侧的板中形成，使得弹性层将室分为液体容纳侧和压力
(
例如，气体
)
施加侧
。
室的总体积可以是恒定的，并且可以形成在第一
(
例如，上
)
板和第二
(
例如，下
)
板中，但是
该体积可以分为压力侧和液体侧
。
通过向压力侧施加正压或负压，弹性片可以变形以减少
(
降至零，关闭室
)
液体容纳侧的体积或增加液体容纳侧的体积
(
至预定的最大值
)。
室的压力施加侧可以连接，例如，经由连接到压力通道
1947
的上板
1903
中的压力端口
1943
，用于向一个或更多个室的压力接收侧
1919
施加负压或正压
。
与每个室的压力施加侧相对的液体容纳侧
1917
可以经由流体通道
1921
连接到流体端口
1923。
流体端口和压力端口两者都可以由通向上板
1903
和弹性层
1907
的开口形成，当压力管线被推入弹性层
1907
中时
(
该弹性层
1907
由相对的刚性或半刚性层
1905、1909
在端口的下侧支撑
)
，即使当有多于一个不同输入管线时，也允许与大气隔离的密封连接
。
[0399]
图
19b
中，微流控路径装置
1900
包括第一
(
例如，上
)
板
1903
，其具有第一
(
例如，顶或上
)
表面
1911
和第二
(
底或下
)
表面
1929
以及两者之间的厚度
。
第一表面
1911
可以形成暴露的外表面
。
微流控路径装置还包括第二板
1905
，第二板
1905
具有第一
(
例如，上或顶部
)
表面
1931
和第二
(
例如，下或底
)
表面
1933
以及它们之间的厚度
。
弹性层
1907
夹在第一板
1903
的第二表面
1929
和第二板
1905
的第一表面
1931
之间
。
在该实例中，第三板
1909
在第二板的第二表面
1933
上直接或间接地偶联到第二板
。
第三板
1909
还具有第一
(
例如，上或顶
)
表面和第二
(
下或底
)
表面以及它们之间的厚度
。
第三板的第二表面可以形成微流控路径装置的底表面
。
板的任一种可以由多于一层形成，这些层可以层压或以其他方式连接在一起
。
例如，在图
19b
中，第三板
1909
包括任选的第二弹性层
1913
，其可以帮助将第三板偶联到第二板；本实例中的第二弹性层
1913
形成第三板
1909
的第一表面
1935。
图
19b
中显示的层和板可以不是按比例的
(
例如，弹性层
1907
可以相对于板更薄
)。
[0400]
图
19b
中显示的微流控路径装置
1900
还可以包括多于一个室
1915、1916、1918、1920
，每个室具有固定的体积
。
这些室由第一板
1903
的第二
(
底
)
表面
1929
和第二板
1905
的第一
(
上
)
表面
1931
中的切出区域
(
例如，圆形
/
弯曲切口
)
形成；弹性层
1907
将这些室
1915
分叉，使得每个室都包括液体容纳侧
1917
和压力接收
(
例如，气体容纳
)
侧
1919。
微流控路径装置
1900
还可以包括多于一个液体
(
例如，流体
)
通道
。
在图
19b
中，显示单个流体通道
1921
，其从流体端口
1923
延伸，穿过第一板
1903
的厚度，到流体通道开口
1925
，其穿过弹性层
1907
，并穿过第二板
1905
的大部分厚度向下到第二板的底表面
1933
，其中液体通道
1921
的平行于第三板的底表面延伸的长度形成在第二板的底表面
1933
中，并以第三板
1909
的上表面为界
。
[0401]
关于流体端口
1923
，第一板
1903
中形成流体端口
1923(
其延伸穿过第一板的厚度
)
的
19
开口的直径可以大于流体通道开口
1925(
其延伸穿过弹性层
1907
并进入液体
(
例如，流体
)
通道
1921)
的直径
。
流体通道开口
1925
可以相对于流体端口开口的底居中，并且可以从流体端口开口的壁偏移至少将连接到流体端口的流体管线或流体管线偶联接口的预期壁厚度
。
[0402]
流体通道
1921
连接到第一室
1915
的液体容纳侧
1917。
该第一室可以配置为阀，其具有相对低的保持体积
(
固定体积
)
，但可以通过移动弹性层
1907
来完全打开或关闭
。
[0403]
微流控路径装置
1900
还包括多于一个压力通道，这些压力通道可以被独立控制以施加正压和
/
或负压
。
在图
19b
中，显示了连接到第四室
1920
的单个压力端口
1943
，尽管室
1915、1916、1918
中的每一个都可以连接到单独的压力端口和压力通道
(
用于独立地操作和控制将这些室分叉的弹性层
1907
的部分的移动
)
，以对每个室进行独立阀调和
/
或泵送
。
在
一些实例中，压力端口可以在多于一个室之间共享
。
在图
19b
中，压力
(
例如，气体
)
端口
1943
类似于流体
(
例如，液体
)
端口
1925
，并且包括完全穿过第一板
1903
的开口，向下到暴露的弹性层
1907
，通过弹性层到开口形成压力
(
例如，气体
)
通道开口
1945。
压力通道开口
1945
与压力
(
例如，气体
)
通道
1947
连续，该通道
1947
从压力端口
1943
延伸，穿过第一板
1903
的大部分厚度，并且在沿着第二板的底的切出通道
(
或替代地进入第三板的顶部的切出区域
)
并通过第二板和弹性层
1907
返回到第一板内压力通道内的区域，其连接到第四室
1920
的压力
(
例如，气体
)
容纳部分
1919。
如对于类似的流体
(
例如，液体
)
端口所述，穿过第一板
1903
的厚度的压力端口
1943
的直径可以大于通过弹性层
1907
的压力通道开口
1945
的直径，并且可以居中或以大于将连接到压力端口的压力管线或压力管线偶联接口的壁厚度偏移
。
[0404]
在穿过图
19b
中所示的微流控路径装置
1900
的截面中，存在与未示出的其他流体
(
例如，液体
)
管线
、
流体端口
、
压力管线和压力端口的多于一个连接，因为它们可能在所示平面之外
。
例如，在图
19b
中，第四室的液体容纳侧或部分
1917
可以连接到另外的阀
(
室
)
和
/
或通道，其包括例如从液体容纳侧
1917
延伸的出口通道
。
未示出的另外的室
(
例如配置为阀
)
可以如上所述形成
。
在一些实例中，出口通道可以通过另一个流体端口
(
未示出
)
将流体从一个或更多个室递送到流体接收贮库，例如小瓶
、
管等
。
该接收贮库可以保持在试剂储存框中
。
[0405]
如以上提及的，可渗透插入物
1969
可以插入到分离室的流体接触侧中，并且可以配置成被将流体接触室与室的压力接收侧分开的弹性材料压缩
。
在该实例中，施加到接收侧的正压或负压
(
例如，经由寻址到该室的压力端口
)
可以使弹性材料偏转以改变流体接触侧的体积
。
可以驱动流体进入具有可渗透插入物
1969
的室
1920
中，并且流体可以通过插入物以修饰溶液
。
在可渗透插入物是可压缩的实例中，可渗透插入物可以被压缩以从该室中去除和喷射流体；在一些示例中，可渗透插入物然后可以扩展
(
或允许扩展
)
回到扩展构造，并且然后流体可以再次通过可渗透插入物，或者可以实施进一步的处理
。
[0406]
本文所述的方法和设备也可以在有或没有可渗透插入物的情况下用于制备包含适于体外转录的合成
dna
模板的合成产物
。
例如，图
19b
示出了微流控路径装置
(
例如，可以是盒或可以是盒的一部分的“芯片”)1980
的一个实例，该微流控路径装置
1980
不一定包括在室的流体接触侧内的可渗透插入物
。
在图
19c
中，微流控路径装置
1980
包括四个
pcr
室
1983、1983’、1983”、1983
”’
，每个
pcr
室可以包括流体接触侧
、
压力
(
例如，气体
)
侧，并且它们流体连接到相邻的
pcr
室
。
每个
pcr
室具有固定的体积，并且如以上对于一般室描述的，形成在第一板的第一表面和第二板的第二表面之间；第一板和第二板可以通过它们之间的弹性可变形膜
(
例如，弹性层
)
连接在一起，从而分隔室
。
弹性层将每个室分成第二表面中的流体接触侧和第一表面中的压力接收侧
。
[0407]
在图
19d
中所示的微流控路径装置中，每个室的压力接收侧
1919
被一个或更多个流体连接的蛇形路径
1985
进一步分隔
。
压力接收表面中的这些蛇形路径将通过通道施加的正压和负压
(
并且尤其是负压
)
更均匀地分布在相对较大的室的表面上
。
当施加负压以将可偏转膜拉离容纳流体的室时，每个
pcr
室中的压力接收表面的细分
(
例如，在一些实例中由一个或更多个蛇形路径细分
)
可以支撑可偏转膜
。
这也可以防止气泡的形成，并且可以保持固定的
、
可预测的体积
。
[0408]
图
19d
中所示的微流控路径装置还包括多于一个流体通道，每个流体通道从流体
端口
1923、1923’延伸穿过第一板区域并进入第二板区域，以与多于一个室中的一个或更多个室的流体接触侧流体连接
(
类似于图
19a
和图
19b
所示的构造
)。
在图
19d
中，标记了流体端口的子集，包括提供与以下
(
装置外
)
的源流体连接的那些流体端口：质粒
1923、pcr
缓冲液
、
引物
(
例如，
t7
引物
)、
寡
dt、
酶
(
例如，聚合酶
)、
纯化基质
(
例如，
ampure
tm
珠
)、
无
rnase
空气
、dntp、
产物输出
(“out”)1923’、
来自
uv
产率检测通道的输出
(“out uv”)、uv
检测缓冲液
(“uv
缓冲液”)、
水
、
乙醇
(
例如，
70
％乙醇冲洗液
)
和废物
(“废物”)。
另外的流体端口也包括在内，并且可以是多余的或者可以不使用
。
微流控路径装置还包括多于一个压力端口
1943。
如所述，压力端口可以提供连通，用于将正压和
/
或负压施加到每个室
、
通道
、
真空帽
、
阀等的压力接收侧
。
因此，控制器可以通过将正压或负压施加到特定的压力端口
1943
或压力端口的组合来控制装置内的流体移动，包括混合
、
泵送
、
阀调等
。
压力端口和流体端口可以布置在第一板的上侧上，典型地围绕板的外围，如图
19a
和图
19d
所示
。
[0409]
在图
19d
中，装置还包括多于一个压力通道
1947
，每个压力通道从一个或更多个压力端口延伸，穿过第一板区域和弹性层，进入第二板区域，并返回穿过弹性层，并进入第一板区域
(
类似于图
19b
中所示
)
，其中所述多于一个压力通道中的每个压力通道在所述第一板区域内延伸并且与所述多于一个室中的一个或更多个室的一个或更多个压力接收侧流体连接
。
如图
19b
中所示，由包括流体贮库和气动驱动器的系统的控制器通过压力通道
(
从压力端口
)
施加正压或负压可以打开
/
关闭阀
1915、1918
，并且可以泵送流体通过室
1916、1920、1983。
[0410]
本文描述的任何微流控路径装置还可以包括与一个或更多个
pcr
室流体连通的一个或更多个
uv
产率检测室
1990。uv
产率检测室可以包括
uv
产率检测窗，该
uv
产率检测窗被配置为使
uv
光从其穿过以量化
uv
产率检测室内的多核苷酸
。uv
产率检测室
1990
还可以连接到用于实施
uv
检测的缓冲液的源
。uv
检测可以测量
dna
所在缓冲液的吸光度
。
包括协调微流控路径装置上的操作的控制器的设备
(
系统
)
可以被配置成控制
uv
产率检测室的操作，如下文将详细描述的
。
例如，微流控路径装置被配置为使用的系统的控制器可以首先检查不含产物的
uv
缓冲液的吸光度，并且然后可以添加预定量的
(
例如，纯化的
)
产物用于比较
。
然后，系统
(
例如，控制器
)
可以自动或半自动地使用所确定的浓度来提醒用户和
/
或在产物从微流控路径装置输出或移动到另一微流控路径装置之前稀释产物
。
[0411]
通常，图
19d
所示的装置是类似的，并且可以包括图
19a(
和图
19b-图
19c)
中所示的任何特征
。
例如，端口可以由弹性层沿着连接通道
1939(
压力通道或流体通道
)
的长度形成，诸如图
19a
所示
。
一个或更多个阀体
1961
可以沿着流体连接通道
1939
被包括在一排中
。
[0412]
pcr
室可以被配置成优化本文所述的
pcr
过程
。
例如，微流控路径装置可以包括面积比流体接触侧的高度大得多的
pcr
室
。
例如，每个
pcr
室的流体接触侧可以具有
1.5cm
或更小的厚度，诸如特别是
1.3cm
或更小
、1.2cm
或更小
、1.1cm
或更小
、1.0cm
或更小
、0.9cm
或更小
、0.8cm
或更小
、0.7cm
或更小
、0.6cm
或更小
、
或
0.5cm
或更小
。
典型地，高度
(
例如，室的“厚度”)
越低，由于热循环引起的热传递可以越有效，然而总体积也越低
。
本文描述的微流控路径装置可用于
pcr
室内的
pcr
，而不需要添加油
/
疏水材料，因为蒸发可以受到室的封闭
(
或可封闭
)
配置的限制
。
[0413]
通常，这些微流控路径装置中的任一个可以包括与纯化基质
(
例如，
ampure
珠
)
流体连通的纯化室
。
[0414]
本文所述的微流控路径装置还可以被配置成通过从微流控路径装置施加空气
(
例如，不含
rna
酶的空气
)
通过设备的流体接触侧来提供混合
(
例如，气泡混合
)
，并从流体端口流出到与流体端口偶联的贮库中
。
在图
19d
中，例如，微流控路径装置可以由
(
与微流控路径装置偶联的系统的
)
控制器控制，以通过驱动不含
rna
酶的空气通过与流体端口连通的流体通道，在与流体端口偶联的贮库内混合和重悬基质珠
(
例如，
ampure
tm
珠
)。
这可以导致贮库内基质珠的起泡和混合
。
控制器可通过施加不含
rna
酶的空气来控制
(
使用通过微流控路径装置的压力端口施加的正压和
/
或负压
)
混合，并且在混合之后，可以将重悬的基质引导出贮库并进入纯化室以纯化模板产物
。
[0415]
如所述，这些设备中的任一个可以被配置为可拆卸的盒，该盒被配置为与流体贮库和气动驱动器接合，并且可以被偶联到系统，例如微流控路径装置控制系统，该系统包括用于协调微流控路径装置的操作以产生模板的控制器
。
[0416]
通常，微流控路径装置可以是任何合适的尺寸
/
体积
。
例如，微流控路径装置可以被配置为具有约
3ml
和约
10ml
之间
(
例如，约
4ml
和约
8ml
之间
、
约
5ml
和
7ml
之间等
)
的总
pcr
反应器尺寸
。
在图
19d
所示的实例中，总
pcr
反应器体积
(
所有四个
pcr
室的组合
)
为约
6.03ml。
因此，在图
19d
中，
pcr
反应体积为约
3ml
，发现其产生约
130ng/ul
模板产物
(
在
3ml
内
)。
[0417]
图
20a
示意性地示出了使用本文所述的任何设备处理流体
(
例如，
rna
样品
)
中的治疗性材料的方法的一个实例
。
例如，该方法可以包括首先将微流控路径装置
(
或多于一个微流控路径装置
)
附接到微流控路径装置控制系统
2001。
这可以包括将微流控路径装置偶联到压力源
。
在一些实例中，该操作
(
或另外的操作
)
可以包括将微流控路径装置偶联到治疗性材料诸如
rna
的来源
。
任选地，在一些实例中，该方法可以包括在微流控路径装置中合成治疗性材料，诸如通过体外转录生成治疗性
rna 2003。
如提及的，这些装置和方法中的任一个可以任选地包括本文所述的可渗透插入物，以修饰包含治疗性材料
(
或其中正在形成治疗性材料
)
的溶液
。
[0418]
该方法还可以包括将含有治疗性材料
(
例如，
rna)
的样品输送到含有可渗透插入物的处理室的流体接触部分
2005。
例如，这可以包括施加压力以将样品输送到微流控路径装置的分离室的流体接触侧
。
在一些实例中，可以通过偏转微流控路径装置内的弹性材料
(
例如，弹性膜
)
来施加压力，以将包括治疗剂
(
或推定的治疗性材料
)
的流体驱动到该室的流体接触侧
。
作为该操作的一部分，流体
(
包括治疗剂
/
推定的治疗剂
)
样品可以传递到分离室的流体接触侧内的可渗透插入物中，以修饰样品
2007。
例如，可以通过与可渗透插入物相互作用来添加或去除来自治疗剂
/
推定的治疗剂的材料
。
[0419]
最后，可以施加压力以将样品输送出分离室的流体接触侧，例如通过使弹性材料
(
其将室的流体接触侧与室的压力接收侧分开
)
诸如弹性膜偏转
2009。
[0420]
图
20b
示出了使用本文所述的任何设备处理流体
(
例如，
rna
样品
)
中的治疗性材料的方法的特定实例
。
例如，在图
20b
中，所述方法可以是从含有双链
rna(dsrna)
和单链
rna(ssrna)
两者的
rna
样品去除
dsrna
的方法
。
在该实例中，该方法可以包括：将微流控路径装置偶联到压力源
2011。
如提及的，在一些实例中，如上文所述，这可以包括将微流控路径装置偶联到治疗性
rna
的源，和
/
或在微流控路径装置中进行治疗性
rna
的体外转录
2013。
然后，该方法可以包括施加压力以将
rna
样品输送到微流控路径装置的分离室的流体接触侧
2015。
然后，可以使
rna
样品通过
/
进入在分离室的流体接触侧内的包含纤维素的固体且可渗透的插入物
2017
，其中纤维素结合
dsrna
，使得
dsrna
被插入物保留
。
然后可以施加压力以将
rna
样品输送出分离室的流体接触侧，将
ssrna
留在治疗性溶液中
2019。
必要时可以重复该过程以去除全部或基本上全部
dsrna。
[0421]
图
20c
示出了制备包含适于体外转录的合成
dna
模板的合成产物的方法的另一个实例
。
上述的任何特征或步骤
(
或步骤的部分
)
可以被包括在图
20c
中所示的方法中和
/
或与之组合
。
例如，这些方法中的任一种可以包括用于检测产物的
uv
产率检测室
(
具有
uv
产率检测窗
)。
如上所述，这些方法和设备中的任一种还也可以被配置成通过装置施加气泡混合
(
例如，将小瓶中的基质珠重悬
)。
该方法通常可以包括使用一个或更多个反应器
(
例如，分成四个相连室的反应器，如图
19d
所示
)
的
pcr
扩增
。
本文描述的方法和设备可以配置为纯化模板产物
(
例如，使用纯化基质
)
和
/
或可以配置为以受控方式稀释所得产物并洗脱产物
。
这些步骤中的任一个可以由控制器自动地执行和
/
或在用户的指导下半自动地执行
。
[0422]
例如，这些方法中的任一种可以包括在控制器的控制下将用于形成模板的
pcr
反应的试剂泵入
pcr
室
2501。
例如，该方法
(
例如，图
20c)
可以包括将
pcr
试剂
(
例如，质粒
、
缓冲液
、
酶
、
引物
、nt、
水等
)
递送至模板微流控路径装置的
pcr
室
。
然后控制器可以协调模板的扩增，例如通过对
pcr
室进行热循环来合成模板
2503。
在热循环期间的任何点，设备可在
pcr
反应
2505
的任何步骤之前或期间操纵液体流动以添加所需量的另外组分
(
例如，酶
、dntp
等
)。
特别地，本文描述的方法可以包括在
pcr
反应期间，诸如例如在第
15
个热循环
(
例如，在第
12
个循环
、
在第
13
个循环
、
在第
14
个循环
、
在第
15
个循环
、
在第
16
个循环
、
在第
17
个循环等
)
添加另外的酶
(
聚合酶
)。
这可以提高产率；在一些情况下，当在第
15
个循环添加时，多至
20
％
。
[0423]
在热循环完成后，该设备可以在微流控路径装置中纯化
pcr
产物
。
例如，微流控路径装置可以首先通过经由微流控路径装置施加如上所述的气泡混合来混合纯化基质，诸如珠
(
例如，
ampure
tm
珠
)
，并且可以将悬浮的基质与产物合并
2507。
产物可以结合到基质上，洗涤
(
例如，使用洗涤缓冲液
)
和干燥
(
例如，使用
70
％ etoh)
，所有这些都在微流控路径装置内，包括在一个或更多个纯化室中
。
然后，纯化的产物可以在微流控路径装置内从基质洗脱，并且洗脱产物的一小部分然后可以被传递到
uv
产率检测室，从而可以确定浓度
2511。
[0424]
例如，
uv
产率检测室可以包括
uv
产率检测窗，
uv
光可以通过该窗，以便使用形成系统一部分的分光光度计来测量吸光度
。
可以将
uv
检测缓冲液施加到
uv
产率检测室中，从而可以进行浓度测量
。
例如，可以将
uv
检测缓冲液施加到
uv
产率检测室中，并获取基线水平
。
之后，可以将洗脱的模板产物
(
例如，大约
5ul)
转移至
uv
产率检测室并与
uv
检测缓冲液合并；然后可以施加
uv
光，并通过分光光度法确定产物的浓度
。
然后，系统可以洗脱产物或以其他方式将其传递到另一个微流控路径装置和
/
或将其转移出微流控路径装置，或者系统可以将产物稀释到所需浓度
2513
，并洗脱
2515。
可以使用相同或不同的
uv
产率检测室实施多于一个浓度检测步骤
。
[0425]
如以上提及的，然后可以进行进一步的处理
(
与递送媒介物组合
、
透析
、
浓缩等
)。
[0426]
本文描述的设备可以包括一个或更多个隔离室和
/
或可与一个或更多个隔离室一起使用
。
例如，在一些实例中，本文描述的设备可以是可以生产治疗性多核苷酸
(
例如用于递送给受试者
)
的治疗性多核苷酸制备
‘
工厂’的一部分
。
治疗性多核苷酸可以是例如治疗性
mrna。
图
21a-图
21b
示出了系统
2105
的一个实例，该系统
2105
可以包括自身用作工厂设备
或可以用作并行制备单元的一部分的设备
。
在图
21a
中，设备
2101、2101’可以包括5级隔离柜
2103
或可保持在5级隔离柜
2103
中；隔离柜本身可以保持在7级隔离空间内
。
在图
21a
中，隔离柜包括两个微流体控制设备
2101、2101’。
所述设备可以是提供精确复制的
gmp
单元的组装工厂的一部分，所述
gmp
单元可以自动快速地制备治疗性多核苷酸，诸如治疗性
mrna
，以供患者使用
。
这些设备可以是高度可重新配置的，并且允许快速部署和低成本生产
。
在一些实例中，它们可以被部署为按需制备“工厂”单元
。
在一些实例中，这些设备可以被设置为移动单元的一部分，该移动单元可以被临时地或在更长的时间段部署到远程地点
。
[0427]
应当理解，前述概念和以下更详细讨论的另外概念的所有组合
(
前提是这些概念不是相互不一致的
)
被认为是本文公开的本发明主题的一部分，并且可以用于实现本文描述的益处
。
[0428]
本文描述和
/
或示出的工艺参数和步骤顺序仅作为示例给出，并且可以根据需要改变
。
例如，虽然本文所示和
/
或描述的步骤可以以特定的顺序示出或讨论，但是这些步骤不一定需要以所示或讨论的顺序来执行
。
本文描述和
/
或示出的各种示例方法也可以省略本文描述或示出的一个或更多个步骤，或者包括除了公开的那些步骤之外的另外步骤
。
[0429]
本文描述的任何方法
(
包括用户界面
)
可以被实现为软件
、
硬件或固件，并且可以被描述为存储能够由处理器
(
例如，计算机
、
平板电脑
、
智能手机等
)
执行的一组指令的非暂时性计算机可读存储介质，当由处理器执行时，使得处理器控制执行任何步骤，包括但不限于：显示
、
与用户通信
、
分析
、
修改参数
(
包括定时
、
频率
、
强度等
)、
确定
、
提醒等
。
例如，本文描述的任何方法可以至少部分地由包括一个或更多个处理器的设备来执行，该处理器具有存储非暂时性计算机可读存储介质的存储器，该非暂时性计算机可读存储介质存储用于该方法的过程的一组指令
。
[0430]
尽管本文已经在全功能计算系统的上下文中描述和
/
或示出了各种实施方案，但是这些示例性实施方案中的一个或更多个可以以各种形式作为程序产品来分发，而无论用于实际执行分发的计算机可读介质的特定类型
。
本文公开的实施方案也可以使用执行某些任务的软件模块来实现
。
这些软件模块可以包括可存储在计算机可读存储介质或计算系统中的脚本
、
批处理或其他可执行文件
。
在一些实施方案中，这些软件模块可以配置计算系统来执行本文公开的一个或更多个示例性实施方案
。
[0431]
如本文所述，本文所述和
/
或所示的计算装置和系统广泛地表示能够执行计算机可读指令的任何类型或形式的计算装置或系统，诸如包含在本文所述模块内的那些指令
。
以它们的最基本配置，这些计算装置可以各自包括至少一个存储器装置和至少一个物理处理器
。
[0432]
如本文使用的术语“存储器”或“存储器装置”通常表示能够存储数据和
/
或计算机可读指令的任何类型或形式的易失性或非易失性存储装置或介质
。
在一个实例中，存储器装置可以存储
、
加载和
/
或维护本文描述的一个或更多个模块
。
存储器装置的实例包括但不限于随机存取存储器
(ram)、
只读存储器
(rom)、
闪存
、
硬盘驱动器
(hdd)、
固态驱动器
(ssd)、
光盘驱动器
、
高速缓存
、
其中一个或更多个的变体或组合，或者任何其他合适的存储存储器
。
[0433]
此外，如本文使用的术语“处理器”或“物理处理器”通常指能够解释和
/
或执行计算机可读指令的任何类型或形式的硬件实现的处理单元
。
在一个实例中，物理处理器可以
访问和
/
或修改存储在上述存储器装置中的一个或更多个模块
。
物理处理器的实例包括但不限于微处理器
、
微控制器
、
中央处理单元
(cpu)、
实现软核处理器的现场可编程门阵列
(fpga)、
专用集成电路
(asic)、
其中一个或更多个的部分
、
其中一个或更多个的变体或组合
、
或任何其他合适的物理处理器
。
[0434]
尽管示出为单独的元件，但本文描述和
/
或示出的方法步骤可以表示单个应用的部分
。
此外，在一些实施方案中，这些步骤中的一个或更多个可以表示或对应于一个或更多个软件应用或程序，当由计算装置执行时，可以使计算装置执行一个或更多个任务，诸如方法步骤
。
[0435]
此外，本文描述的一个或更多个装置可以将数据
、
物理装置和
/
或物理装置的表示从一种形式转换为另一种形式
。
另外或可选地，本文所述的一个或更多个模块可以通过在计算装置上执行
、
在计算装置上存储数据和
/
或以其他方式与计算装置交互，将处理器
、
易失性存储器
、
非易失性存储器和
/
或物理计算装置的任何其他部分从一种形式的计算装置转换为另一种形式的计算装置
。
[0436]
如本文使用的术语“计算机可读介质”通常指能够存储或携带计算机可读指令的任何形式的装置
、
载体或介质
。
计算机可读介质的实例包括但不限于传输类型介质诸如载波，和非瞬时类型介质，诸如磁存储介质
(
例如，硬盘驱动器
、
磁带驱动器和软盘
)、
光学存储介质
(
例如，光盘
(cd)、
数字视频盘
(dvd)
和
blu-ray
盘
)、
电子存储介质
(
例如，固态驱动器和闪存介质
)
，以及其他分发系统
。
[0437]
本领域普通技术人员将认识到，本文公开的任何过程或方法可以以多种方式进行修改
。
本文描述和
/
或示出的工艺参数和步骤顺序仅作为示例给出，并且可以根据需要改变
。
例如，虽然本文所示和
/
或描述的步骤可以以特定的顺序示出或讨论，但是这些步骤不一定需要以所示或讨论的顺序来执行
。
[0438]
本文描述和
/
或示出的各种示例方法也可以省略本文描述或示出的一个或更多个步骤，或者包括除了公开的那些步骤之外的另外步骤
。
此外，本文公开的任何方法的步骤可以与本文公开的任何其他方法的任何一个或更多个步骤组合
。
[0439]
本文描述的处理器可以被配置成执行本文公开的任何方法的一个或更多个步骤
。
可选地或组合地，处理器可以被配置成组合本文公开的一种或更多种方法的一个或更多个步骤
。
[0440]
当特征或元素在本文中被称为在另一个特征或元素“上”时，其可以直接在另一个特征或元素上，或者也可以存在中间特征和
/
或元素
。
相反，当特征或元素被称为“直接在”另一个特征或元素上时，不存在中间特征或元素
。
还将理解，当特征或元素被称为“连接”、“附接”或“联接”到另一个特征或元素时，其可以直接连接
、
附接或联接到另一个特征或元素或者可以存在中间特征或元素
。
相反，当特征或元素被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接联接”到另一个特征或元素时，不存在中间特征或元素
。
尽管关于一种实施方案进行了描述或示出，但是如此描述或示出的特征和要素可以应用于其他实施方案
。
本领域的技术人员还将认识到，对布置为与另一个特征“相邻”的结构或特征的引用可以具有重叠或位于相邻特征下方的部分
。
[0441]
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明
。
例如，如本文所使用的，单数形式“一
(a)”、“一
(an)”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另
外清楚地说明
。
将进一步理解到，当在本说明书中使用时，术语“包括
(comprises)”和
/
或“包括
(comprising)”指定所述特征
、
步骤
、
操作
、
元素和
/
或部件的存在，但并不排除一个或更多个其他特征
、
步骤
、
操作
、
元素
、
部件和
/
或其组合的存在或添加
。
如本文所使用的，术语“和
/
或”包括关联的所列项目中的一个或更多个的任何和所有组合，并且可以缩写为“/”。
[0442]
为便于描述，在本文中可能使用了空间相对的术语，诸如“下方
(under)”、“在
...
下面
(below)”、“下部
(lower)”、“上面
(over)”、“上部
(upper)”以及类似术语来描述一个元素或特征与另一个元素或特征的关系，如附图所示
。
将理解，空间上相关的术语意图涵盖除了附图中描绘的取向之外装置在使用或操作中的不同取向
。
例如，如果附图中的装置被倒置，那么被描述为在其他要素或特征“下方”或“下面”的要素将被定向为在其他要素或特征“上面”。
因此，示例性术语“下方”可以包括上面和下方的取向
。
装置可以被以其他方式定向
(
旋转
90
度或以其他取向
)
，并且本文使用的空间相关的描述词被相应地解释
。
类似地，术语“向上地
(upwardly)”、“向下地
(downwardly)”、“垂直的
(vertical)”、“水平的
(horizontal)”等在本文中仅用于解释的目的，除非另有特别说明
。
[0443]
虽然术语“第一”和“第二”在本文中可以用于描述多个特征
/
元件
(
包括步骤
)
，但是这些特征
/
元件不应该受这些术语的限制，除非上下文另外指示
。
这些术语可以用于将一个特征
/
元件与另一个特征
/
元件区分开
。
因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下文讨论的第一特征
/
元件可以被称为第二特征
/
元件，并且类似地，下文讨论的第二特征
/
元件可以被称为第一特征
/
元件
。
[0444]
在整个本说明书和所附的权利要求中，除非上下文另外要求，否则词语“包括
(comprise)”及诸如“包括
(comprises)”和“包括
(comprising)”的变型意味着可以在方法和物品
(
例如，组合物和包括装置的设备
、
以及方法
)
中共同使用多种部件
。
例如，术语“包括
(comprising)”将被理解为暗示包含任何陈述的元件或步骤，但不排除任何其他元件或步骤
。
[0445]
通常，本文所述的任何设备和方法应被理解为是包括性的，但组成部分和
/
或步骤的全部或子集可以替代地是排他的，并且可以表示为“由各种组成部分
、
步骤
、
子组成部分或子步骤组成”或替代地“主要由各种组成部分
、
步骤
、
子组成部分或子步骤组成”。
[0446]
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，包括如在示例中使用的，且除非另有明确说明，所有数字可以被读作貌似前面有“约
(about)”或“大致
(approximately)”的词语，即使该术语没有明确出现
。
可以在描述幅度和
/
或位置时使用措辞“约
(about)”或“大致
(approximately)”，以指示所描述的值和
/
或位置在值和
/
或位置的合理预期范围内
。
例如，数值可以具有为所陈述的值
(
或值的范围
)
的
+/-0.1
％
、
所陈述的值
(
或值的范围
)
的
+/-1
％
、
所陈述的值
(
或值的范围
)
的
+/-2
％
、
所陈述的值
(
或值的范围
)
的
+/-5
％
、
所陈述的值
(
或值的范围
)
的
+/-10
％等的值
。
本文给定的任何数值也应被理解为包括约或大致该值，除非上下文另外指示
。
例如，如果值“10”被公开，那么“约
10”也被公开
。
本文列举的任何数值范围旨在包括包含在其中的所有子范围
。
还应当理解的是，如本领域技术人员所正确理解的那样，当公开了一个值时，“小于或等于”该值
、“大于或等于该值”和值之间的可能范围也被公开
。
例如，如果公开了值“x”，则也公开了“小于或等于
x”以及“大于等于
x”(
例如，其中
x
是数值
)。
还应理解，在整个申请中，以多种不同的格式提供数据，并且该数据表示数据点的任何组合的端点和起始点以及范围
。
例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，
则应理解，大于
、
大于或等于
、
小于
、
小于或等于
、
和等于
10
和
15
以及在
10
和
15
之间被认为被公开
。
还应理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位
。
例如，如果公开了
10
和
15
，则还公开了
11、12、13
和
14。
[0447]
尽管上文描述了多种说明性实施方案，但在不脱离如由权利要求描述的本发明的范围的情况下，可以对多种实施方案进行多种变化中的任何一种
。
例如，在可选择的实施方案中，执行多种描述的方法步骤的顺序可以经常改变，并且在其他可选择的实施方案中，可以一起跳过一个或更多个方法步骤
。
多种装置和系统实施方案的任选的特征可以被包括在一些实施方案中，而不被包括在其他实施方案中
。
因此，先前的描述主要被提供用于示例性目的，并且不应被解释为限制如在权利要求中阐述的本发明的范围
。
[0448]
本文所包括的实例和说明通过说明而非限制的方式示出了其中可以实践主题的特定实施方案
。
如所提及的，可以利用和从其中导出其他实施方案，使得可以做出结构和逻辑替换和改变而不脱离本公开内容的范围
。
仅为了方便，本发明主题的这样的实施方案在本文中可以单独地或共同地由术语“发明”来指代，并且如果实际上多于一个被公开，不意图将本技术的范围主动地限制为任何单个发明或发明概念
。
因此，尽管本文已经说明和描述了特定实施方案，但是被认为实现相同目的的任何布置可以替代所示出的特定实施方案
。
本公开内容旨在覆盖多种实施方案的任何和全部修改或变型
。
在阅读以上描述后，以上实施方案的组合以及本文未具体描述的其他实施方案对本领域技术人员来说将是明显的
。