一种苯并[a]芘磁性分子印迹材料及其制备方法与应用与流程

本发明涉及食品检测，特别是涉及一种苯并[a]芘磁性分子印迹材料及其制备方法与应用。

背景技术：

1、多环芳烃(polyelic aromatic hydrocarbons，pahs)是一类广泛存在于环境、食品及生物体内的污染物。其化学性质稳定，不易水解，最突出的特性是致癌性，能够引起胃、食道、皮肤等部位的肿瘤和癌变。

2、苯并芘是苯与芘稠合而成的一类多环芳烃，其中最常见的是苯并[a]芘。苯并[a]芘简称b[a]p，其分子式为c20h12，分子量252.32，常温下为无色至浅黄色针状晶体(纯品)，碱性环境下性质稳定，遇酸易发生化学变化，熔点179℃，沸点310～312℃，不溶于水，微溶于甲醇、乙醇，溶于苯、甲苯、二甲苯、氯仿、乙醚等有机溶剂。近年来关于食用油中检出b[a]p时有报道，花生油、大豆油、玉米油、芝麻油和葵花籽油中都检出过苯并芘超标，说明食用油受到b[a]p的严重污染。

3、许多国家和组织均对直接消费的植物油中b[a]p的含量有着严格的标准。所以食用油中b[a]p的检测十分必要。目前，食用油中b[a]p的检测方法主要有薄层层析法、荧光分光光度法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用。但是由于植物油中b[a]p含量极微，稳定性差，样品基体复杂且存在潜在的多种干扰物，如大量甘油三酯和脂肪伴随物，因此无论采用上述何种方法检测食用油中b[a]p，都需要对样品进行预处理以富集待测组分，消除基体的干扰，以提高检测的灵敏度，降低检测限。所以如何快速、准确地检测出食品中的b[a]p，就成为人们现阶段研究的重点。

4、植物油中b[a]p分析的传统样品预处理方法复杂耗时，这越来越成为现代分析方法发展的瓶颈。食用油中b[a]p检测的样本预处理方法主要包括液-液萃取预处理、固相萃取预处理和分子印迹技术。

5、传统液-液萃取预处理方法复杂、耗时，并且需要大量的有机溶剂，产生大量的废液。固相萃取克服了传统液-液萃取的分离过程耗时长，费溶剂等缺点，其萃取过程简单快速、节省溶剂、重现性好、回收率高，减少了杂质的引入，减轻了有机溶剂对实验人员和环境的影响。目前常规的苯并芘固相萃取材料，主要是键合硅胶、硅土、中性氧化铝等材料。基于苯并芘与杂质在固定相与流动相之间的吸附性能不同进行分离。由于食用油中脂肪酸组分较多，极性分布性质类似，因此采用固相萃取得到的分离产物通常是某一类的分离产物。能够去除部分杂质，但去除并不完全。给后续的检测造成很大的困难。此外，由于苯并芘化学结构的特殊性，在非极性物质如食用油中的溶解度很高，难以萃取出来，这也给样本处理带来了难度。

6、分子印迹技术是近年来发展起来的一种新的材料制备技术。基本的原理是利用待检分子作为模板，在合成单体、交联剂和溶剂的共同作用下，通过引发剂引发，合成一个高分子物质。然后通过淋洗，将模板分子洗掉，从而在合成的高分子物质上形成一个空穴，达到特异性识别的目的。也有人称之为人工抗体技术。分子印迹技术目前在小分子化合物识别以及部分生物大分子识别中都有应用。

7、现有的分子印迹材料多采用本体聚合法合成，聚合成的分子印迹材料需要研磨成小颗粒，然后通过不同孔目的筛具，过筛后作为吸附剂。该方法的缺点是研磨过程中难以控制颗粒大小，导致颗粒大小不均一，结合效率低。除此之外，由于分子印迹反应过程是在表面和内部同时发生，容易造成材料内部的模板残留，难以完全洗脱干净，影响吸附效果。同时，在样本前处理过程中，分子印迹材料内部的模板分子有可能被同时洗脱下来，造成检测的假阳性。而且即使是以微球形式合成的分子印迹材料，也会造成材料内部模板洗脱不完全，模板残留的现象。导致检测时的假阳性和假阴性。因此，现有的分子印迹材料难以满足对样本中，尤其是油脂样本中苯并[a]芘的高效吸附，以及处理后样本的精准检测，开发一种特异性好、与苯并[a]芘结合效率高的苯并[a]芘分子印迹材料十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种苯并[a]芘磁性分子印迹材料及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题。所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料能够特异性结合苯并[a]芘，降低其它物质的干扰。将其在样本前处理过程中作为吸附材料用于富集净化非极性溶剂样本中的苯并[a]芘，能够特异性富集和净化非极性溶剂如食用油中的苯并[a]芘，降低其它物质的干扰，保证检测数据准确、可靠。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明的技术方案之一：一种苯并[a]芘磁性分子印迹材料，以fe3o4磁性纳米微球为内核，所述fe3o4磁性纳米微球表面覆盖有sio2分子层，所述sio2分子层表面覆盖有苯并[a]芘分子印迹聚合物层。即所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料为多层核壳结构，其中内核为fe3o4磁性纳米微球，外壳为苯并[a]芘分子印迹聚合物层，中间层为sio2分子层。

4、所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料能够特异性富集和净化苯并[a]芘。

5、本发明的技术方案之二：一种上述苯并[a]芘磁性分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：在fe3o4磁性纳米微球表面合成sio2分子层，得到fe3o4-sio2磁性微球；对fe3o4-sio2磁性微球表面进行疏水化修饰，得到活性fe3o4-sio2磁性微球；采用表面分子印迹法在活性fe3o4-sio2磁性微球表面合成苯并[a]芘分子印迹聚合物层，得到所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料。

6、sio2可以在fe3o4表面起到修饰作用，使后续的苯并[a]芘分子印迹聚合物层的合成得以进行。

7、进一步地，所述fe3o4磁性纳米微球采用溶剂热法制备，包括以下步骤：将铁源、柠檬酸钠溶于溶剂中，再加入乙酸钠，加热反应，得到所述fe3o4磁性纳米微球。

8、进一步地，加热反应结束后还包括冷却至室温、洗涤、干燥的操作。

9、进一步地，所述铁源为fecl3；所述溶剂为乙二醇；所述加热反应的温度为100-300℃，时间为5-15h。

10、进一步地，所述fecl3与乙二醇的用量比为0.0001-0.01mol:40ml，优选为0.005mol:40ml；所述fecl3与柠檬酸钠的摩尔比为(1.5-5):1；加入的乙酸钠的终浓度为0.1-0.5μmol/l。

11、进一步地，fecl3与柠檬酸钠的摩尔比优选为(2-4):1；加入的乙酸钠的终浓度优选为0.2-0.4μmol/l；加热反应的温度优选为150-250℃，时间优选为8-12h。

12、进一步地，所述在fe3o4磁性纳米微球表面合成sio2分子层，得到fe3o4-sio2磁性微球包括：将所述fe3o4磁性纳米微球加入盐酸水溶液中，超声分散，得到fe3o4磁性纳米微球盐酸分散液；将所述fe3o4磁性纳米微球盐酸分散液与乙醇水溶液混合，再加入还原剂和硅源，搅拌反应，反应结束后分离，得到所述fe3o4-sio2磁性微球。

13、将fe3o4磁性纳米微球在盐酸水溶液中分散的目的是将fe3o4磁性纳米微球很好地分散开，并使其表面稍微带一点电荷。

14、进一步地，分离后还包括洗涤、干燥的操作。

15、进一步地，所述盐酸水溶液的浓度为0.1-0.5mol/l；进一步优选为0.1-0.15mol/l。

16、进一步地，所述乙醇水溶液由乙醇和水按体积比7:3-9:1混配而成；进一步优选为由乙醇和水按体积比8:2混配而成。

17、进一步地，fe3o4磁性纳米微球与盐酸水溶液、乙醇水溶液、还原剂、硅源的用量比为0.1-0.5g:100ml:100-120ml:1-5ml:0.5-3ml；所述还原剂为浓氨水；所述硅源为正硅酸四乙酯；所述搅拌反应的温度为22-25℃，时间为5-8h。

18、进一步地，所述搅拌反应的时间优选为5-6h。

19、进一步地，fe3o4磁性纳米微球与盐酸水溶液、乙醇水溶液、浓氨水、正硅酸四乙酯的用量比优选为0.1-0.2g:100ml:100-120ml:1-2ml:1-2ml。

20、进一步地，所述浓氨水的浓度为22-30wt％；进一步优选为25-28wt％。

21、进一步地，所述对fe3o4-sio2磁性微球表面进行疏水化修饰，得到活性fe3o4-sio2磁性微球包括：将所述fe3o4-sio2磁性微球分散在包含修饰试剂的混合溶液中，搅拌，分离，得到所述活性fe3o4-sio2磁性微球。

22、进一步地，分离后还包括洗涤、干燥的操作。

23、进一步地，所述包含修饰试剂的混合溶液为修饰试剂-甲醇溶液；其中的修饰试剂为3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、二甲基二乙氧基硅烷或十六烷基三甲氧基硅烷；所述修饰试剂进一步优选为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。

24、进一步地，所述修饰试剂-甲醇溶液中修饰试剂的浓度为5-15vol％，进一步优选为6-8vol％。

25、进一步地，所述fe3o4-sio2磁性微球与修饰试剂-甲醇溶液的用量比为1-4mg:1ml；进一步优选为1.5-2.5mg:1ml。

26、进一步地，所述将fe3o4-sio2磁性微球分散在包含修饰试剂的混合溶液中，包含直接将fe3o4-sio2磁性微球(固体)分散在包含修饰试剂的混合溶液中，或先将fe3o4-sio2磁性微球(固体)分散在一定量的甲醇中，得到fe3o4-sio2磁性微球甲醇分散液，再将所述fe3o4-sio2磁性微球甲醇分散液分散到包含修饰试剂的混合溶液(此时fe3o4-sio2磁性微球与修饰试剂-甲醇溶液的用量比中所述的修饰试剂-甲醇溶液的体积包含提前对fe3o4-sio2磁性微球进行分散时使用的那一部分甲醇，即fe3o4-sio2磁性微球与制备fe3o4-sio2磁性微球甲醇分散液时使用的甲醇以及修饰试剂-甲醇溶液体积之和的用量比为1-4mg:1ml)。

27、进一步地，所述修饰试剂-甲醇溶液中除了包含修饰试剂和甲醇外，还可包含乙酸。

28、进一步地，所述搅拌的温度为40-60℃，时间为20-25h。

29、进一步地，所述在活性fe3o4-sio2磁性微球表面合成苯并[a]芘分子印迹聚合物，得到所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料包括：将苯并[a]芘(化合结构式如图1所示)、功能单体、辅助单体与溶剂混合，预反应，得到反应液；在所述反应液中加入所述活性fe3o4-sio2磁性微球以及交联剂和引发剂，在保护氛围下进行化学交联反应，反应结束后分离出磁性产物；将所述磁性产物用提取液进行索氏提取，得到所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料。

30、进一步地，活性fe3o4-sio2磁性微球与功能单体、溶剂、交联剂、引发剂的用量比为1mg:1-15μl:1ml-2ml:100-200μl:0.5ml-2ml；苯并[a]芘与活性fe3o4-sio2磁性微球的质量比为1:1-8；功能单体和辅助单体的体积比为1-5:1；所述功能单体为4-乙烯基吡啶；所述辅助单体为甲基丙烯酸；所述溶剂为二氯甲烷；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述预反应的温度为2-8℃，时间为12-20h；所述化学交联反应的温度为40-80℃，时间为21-40h。

31、进一步地，所述化学交联反应的具体反应程序为先在40-80℃条件下反应5-10h，再在50-80℃条件下反应16-30h。

32、即利用4-乙烯基吡啶为功能单体，甲基丙烯酸为辅助单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)为交联剂，偶氮二异丁腈(aibn)为引发剂，以苯并[a]芘做模板，在二氯甲烷中进行表面分子印迹反应。

33、预反应是单体与模板相互识别和结合的过程，但没有开始聚合。化学交联反应速度较快，先进行一个预反应能使得聚合效果更高。

34、进一步地，活性fe3o4-sio2磁性微球与功能单体、溶剂、交联剂、引发剂的用量比优选为1mg:2-12μl:1ml-2ml:150-180μl:1ml-1.5ml；苯并[a]芘与活性fe3o4-sio2磁性微球的质量比优选为1:2-6；功能单体和辅助单体的体积比优选为1.5-3:1。

35、进一步地，在预反应前，先将所述苯并[a]芘、功能单体、辅助单体与溶剂在冰浴及氮气保护下搅拌均匀。

36、进一步地，所述提取液为甲醇-乙酸混合溶液。

37、进一步地，所述甲醇-乙酸混合液由甲醇与乙酸按体积比7:3-9:1混配而成；进一步优选地按体积比8:2-9:1混配而成。

38、进一步地，所述索氏提取的时间为20-30h；进一步优选为20-25h。

39、进一步地，分离出磁性产物后还包括对磁性产物的洗涤、干燥操作。

40、进一步地，索氏提取后还包括洗涤、干燥的操作。

41、进一步地，所述洗涤为采用去离子水和无水甲醇交替洗涤；所述干燥的温度为50-60℃。

42、本发明的技术方案之三：一种上述苯并[a]芘磁性分子印迹材料在非极性溶剂中苯并[a]芘的检测中的应用，所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料用于在非极性溶剂样本的前处理过程中特异性富集苯并[a]芘。

43、即将所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料在非极性溶剂样本前处理过程中作为吸附材料用于富集净化非极性溶剂样本中的苯并[a]芘。

44、进一步地，所述非极性溶剂优选为油脂。

45、进一步地，所述油脂为食用油或回收油。

46、进一步地，所述食用油为植物油脂或动物油脂。

47、进一步地，所述植物油脂包括大豆油、花生油或菜籽油。

48、本发明的技术方案之四：一种利用上述苯并[a]芘磁性分子印迹材料从油脂样本中富集苯并[a]芘的方法，包括以下步骤：将所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料依次用二氯甲烷和正己烷活化，得到活化苯并[a]芘磁性分子印迹材料；用提取液对油脂样本进行提取，得到油脂提取液；将所述活化苯并[a]芘磁性分子印迹材料与所述油脂提取液混合均匀，磁性分离，得到富集有苯并[a]芘的磁性分子印迹材料；将所述富集有苯并[a]芘的磁性分子印迹材料洗涤，然后用溶剂洗脱，磁性分离，收集洗脱液。

49、进一步地，对苯并[a]芘磁性分子印迹材料进行活化时，所述苯并[a]芘磁性分子印迹材料与二氯甲烷和正己烷的用量比为10-30mg:3-5ml:5ml。

50、进一步地，所述提取液为正己烷、二氯甲烷、乙腈或甲醇；进一步优选为正己烷。

51、进一步地，所述油脂样本与提取液的用量比为1g:10-15ml。

52、进一步地，所述活化苯并[a]芘磁性分子印迹材料与所述油脂提取液的用量比为1-10mg:1ml；进一步优选为2-6mg:1ml。

53、进一步地，将所述富集有苯并[a]芘的磁性分子印迹材料洗涤时是用正己烷洗涤1-3次，每次使用的正己烷的用量与对油脂样本进行提取时使用的提取液的用量相同。

54、进一步地，洗脱时使用的溶剂是二氯甲烷，二氯甲烷的用量是对油脂样本进行提取时使用的提取液的用量的0.5-1.5倍。

55、进一步地，所述利用苯并[a]芘磁性分子印迹材料从油脂样本中富集苯并[a]芘的方法，还包括：对收集的洗脱液进行处理后，检测其中苯并[a]芘的含量。

56、进一步地，所述处理为将所述洗脱液用40-50℃氮气吹干，然后用0.1-2ml乙腈涡旋复溶，并用微孔滤膜过滤。

57、进一步地，所述检测的方法包括高效液相色谱(hplc)检测法、液相色谱-质谱(lc-ms)检测法、高效液相色谱-质谱(hplc-ms)检测法、气相色谱-质谱(gc-ms)检测法、荧光分光光度法、侧向免疫层析法、酶联免疫吸附分析(elisa)法。

58、本发明公开了以下技术效果：

59、(1)本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料能特异性地结合油脂样本中的苯并[a]芘，与油脂样本中其他的基质不产生结合。用于油脂样本中苯并[a]芘的净化，能够得到纯度较高的苯并[a]芘净化产物。与传统的固相萃取材料相比较，传统的固相萃取材料只能结合某一类具有同一性质的物质。而本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料特异性非常强，只特异性地结合样本中的苯并[a]芘。大幅度提高了样本处理效率。同时也提高了检测的准确性，减少了检测设备的负担。

60、(2)本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料，由于具有磁性的内核，能够很方便的利用磁场进行分离。因此能够直接在液相中反应，不需要装填纯化柱。相对于目前常用的固相萃取柱、分子印迹柱等前处理方式来说增加了便捷性，提高了样本处理效率。

61、(3)本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料，由于具有磁性内核设计，可以直接在液相中进行均相反应。在样本处理过程中，所有苯并[a]芘磁性分子印迹材料的目标物结合反应是均等的。而目前常用的固相萃取柱或者分子印迹柱等柱式样本处理方式，需要将样本加入到净化柱中，样本从上而下流过净化柱，会造成样本在净化柱的上下不同层之间的结合效率不同，可能会造成净化柱上层的填料已经结合能力饱和，但是下层由于填料阻挡等原因结合能力还有富余。对于某些样本，还会出现净化柱堵塞的现象，影响过柱的效率。本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料，由于可以在液相中进行均相结合，并且不用担心堵塞问题，大大提高了结合能力和净化效率。

62、(4)本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料，有利于实现自动化，可以适用于全自动化的净化设备，节省了人工，大大提高了样本处理效率。

63、(5)本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料，在fe3o4-sio2磁性微球表面进行了疏水化的修饰。使得该印迹材料能够与非极性溶液更好地结合，对于植物油脂、动物油脂以及其它的非极性样本中的苯并[a]芘净化更加有效。尤其适合食用油中苯并[a]芘的净化。

64、(6)传统的用本体聚合法合成分子印迹材料，会有粉碎和研磨步骤，导致颗粒大小不均一，结合效率低。即使是以微球形式合成的分子印迹材料，也会造成材料内部模板洗脱不完全，模板残留的现象。导致检测时的假阳性和假阴性。本发明的苯并[a]芘磁性分子印迹材料，采用表面分子印迹的方法，在fe3o4-sio2磁性微球表面合成了分子印迹聚合物薄层。分子印迹层薄，避免了材料内部模板洗脱不完全的情况，大大提高了样本的净化效率以及后续检测的准确性。